Name: 2 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 현장 영상에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: 배우세요 마우스 흉선 조직의 현장 영상 촬영을 위한 2광자 현미경 기법을 활용한 면역학 연구 방법입니다. 이 기술은 T세포 이동과 선택 메커니즘을 실시간으로 관찰하여 면역 세포 발달 과정을 심도 있게 이해하는 데 활용됩니다.

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우리는 매트 바울과 기술 지원 지미 님 감사합니다.

입양 전송 골수 50 - 100ul가 1시 1분의 최종 기증자 대 호스트 비율과 함께, 생명의 첫 3-7일 동안 인슐린 주사기에게 2-4 번 사용하는 neonates을 주사. 흉골과 흉곽 아래에 주사 사이트에 대한하지만 창자와 위 이상을 목표로하고 있습니다. 멀리 충분하지 소중히 다이어프램를 신중 복막을 침투 바늘을 삽입합니다. 골수의 일부가 주사하는 동안 손실되는 것이 일반적입니다. 당신은 피부가 서서히 바늘을 제거하고, 확장하고 수 있도록만큼 주사로 당신은 강아지에 손잡이를 느슨해진하여 손실을 줄일 수 있습니다. Thymus의 해부 정중선을 통해 절개를 만들고 갈빗대을 나타내기 위해 멀리 피부를 잘라내거나 눈물. 흉골을 잡고 복막 및​​ 격막을 통해 했네요. 흉강을 나타내기 위해 흉곽의 측면을 자르고. thymus은 심장의 정상에 자리잡고 있습니다. 그럼으로 thymus의 구조를 유지하기 위해, 당신이 thymus을 해부하다와 같은 조직을 주변에 만요. 해부하는 동안 밖으로 건조에서 유지하는 PBS로 thymus을 씻어. 부드럽게 thymic 캡슐의 표면에 떨어진 초과 조직을 애타게 두 개의 엽 (叶)을 이등분. 이미징을위한 조직을 준비 광장 coverslip에 아무런 접착제 thymus로 수의과 조직 접착제를 사용하지 않습니다. 접착제의 microliter의 일부를 넣어 pipetteman을 사용합니다. 대략적인 길이 thymus의 너비에 접착제를 펴. 꾸준한는 coverslip에 대한 thymus과 장소로 드래그합니다. 두 광자 이미징 조직은 95 % 산소와 5 % 이산화탄소로 perfused 37을 따뜻하게합니다 페놀 레드 ° C.없는 DMEM에 빠져들 것입니다 두 광자 여기는 PMT 감지기를 사용하여 스펙트럼 - 물리 마이 타이 900nm에 레이저 조정하고, CFP, GFP, YFP와 텍사스 레드 발광 라이트 분리된 495을 사용하여 515, 560 이색성 거울과 수집을 사용하여 달성되었습니다.

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

thymus에서 두 광자 이미징 살고, 손상 기관 상호 작용과 thymus 내에 선택 이벤트를 기초로 마이 그 레이션 검사 우리에게 있습니다.

2 광자 현미경을 사용하여 마우스 thymus의 현장 영상에서

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

두 광자 현미경 (TPM)는 thymus에 깊은 이미지를 우리를있게하고 thymocyte 발전을위한 중요한 이벤트를 문서. thymocytes의 군중에서 개인의 마이 그 레이션을 수행하기 위해, 우리는 thymocytes 미만 1퍼센트가 ubiquitously 표현 형광 단백질에 대한 유전자 변형되는 기증자에서 파생됩니다 신생아 chimeras를 생성합니다. 이러한 부분 hematopoetic chimeras를 생성하려면, 신생아받는 사람은 나이 3-7일 사이에 골수로 주입됩니다. 4~6주 후, 마우스가 희생되고 thymus은 신중하게 해부하고 몇 군데 될 조직의 구조를 보존 bissected. thymus는 TPM의 예 생체내 이미징에 대비하여 coverslip에 붙어있다. 이미징 동안 thymus는 95 % 산소와 5 % 이산화탄소로 perfused 37을 따뜻하게합니다 페놀 레드 ° C.없는 DMEM에 저장됩니다 이 방법을 사용, 우리는 다양한 T 세포 레퍼토리의 생성에 필요한 이벤트를 공부할 수 있습니다.

우리는 신생아 chimeras의 생성뿐만 아니라 2 광자 현미경으로 해부하고 예 생체내 이미징에 대한 thymus의 준비를위한 단계별 지침을 제시한다.

2 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 현장 영상에서

이광자 현미경(Two-photon Microscopy, TPM)을 통해 흉선 깊은 곳까지 이미징하고 흉선세포 발달에 중요한 사건들을 기록할 수 있습니다. ...을 추적하기 위해

이광자 이미징은 단일 세포가 주변 환경과 상호작용하며 이동하는 과정을 추적할 수 있어 면역학 연구에 유용합니다. 이광자 현미경을 사용하여 흉선 내 이동을 추적함으로써, 양성 선택 및 음성 선택의 메커니즘을 규명할 수 있습니다.안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 버클리의 Ellen Roby 박사 연구실 소속 Ina Lottie입니다. 그리고 저 또한 Ellen Roby 박사 연구실의 Paul Herzmark입니다. 오늘은 흉선 조직의 in situ 이미징 방법을 보여드리고, 이광자 현미경을 사용하여 흉선을 이미징하는 과정을 설명하겠습니다.이제 이광자 이미징에 이르기까지의 단계들을 보여드리겠습니다. 여기에는 골수에서 조혈모세포를 분리하는 과정, 신생아로의 골수 세포 입양 전이, 흉선의 해부 및 이분절, 그리고 이광자 레이저 주사 현미경 이미징을 위한 조직 준비 절차가 포함됩니다. 그럼 시작하겠습니다.영상 촬영을 위해 흉선을 준비하기 전, 먼저 신생 생쥐에 골수 세포를 입양 전이시켜야 합니다. 이 골수 세포들은 GFP를 편재적으로 발현하는 형질전환 생쥐의 뒷다리에서 분리되었습니다. 이것은 50 µL의 골수가 들어있는 인슐린 주사기입니다.공여체 한 마리의 골수를 사용하여 생후 3~7일 된 숙주에게 2~4회 주입합니다. 여기 생후 5일 된 새끼 쥐가 있으며, 주입 중에 새끼 쥐가 움직이지 않도록 하고 피부를 팽팽하게 유지하기 위해 피부를 뒤로 잡아당깁니다. 폐와 갈비뼈 아래, 그리고 장과 위 위의 지점을 주입 부위로 잡습니다.주입하면서 피부를 잡은 손의 힘을 풀어 피부가 확장될 수 있도록 합니다. 마지막으로, 골수 손실량을 최소화하기 위해 주사기를 천천히 제거합니다. 이 마우스들을 4~6주 동안 성장시킨 후, 영상 촬영을 위해 흉선을 적출할 수 있습니다.4~6주 후면 흉선을 제거할 수 있습니다. 영상 촬영을 위해 큰 포셉과 가위 한 세트, 그리고 작은 포셉과 가위 한 세트를 사용하겠습니다. 이 마우스는 동물 실험 프로토콜에 따라 희생되었으며 에탄올로 소독되었습니다.이제 큰 포셉을 사용하여 피부를 집어 정중선에 절개를 넣겠습니다. 가위를 사용하여 정중선을 따라 절개하거나 피부를 복막에서 떼어낼 수 있는데, 여기서는 피부를 핀으로 고정하여 흉강을 노출시키겠습니다. 복막을 절개하며 흉강으로 들어갈 때 흉골을 잡고 지지하며, 횡격막을 통해 흉강으로 진입한 후 흉곽의 측면을 따라 절개하겠습니다.심장 바로 위에 놓여 있는 흉선을 확인하실 수 있습니다. 다시 제자리에 놓겠습니다. 이것이 흉선입니다.저는 이 부분을 건드리지 않도록 하겠습니다. 작은 포셉을 사용하여 흉선 주변의 조직을 계속 잡고 계십시오. 이제 PBS를 분사하여 과잉 조직의 일부를 제거하기 시작하겠습니다.따라서 흉선을 잡기 위해 흉선 주변의 조직을 이용하겠습니다. 흉선을 정제할 때, 과도한 조직을 조심스럽게 잘라내어 제거하겠습니다. 이제 흉선에는 두 개의 엽이 있으며, 정제 과정에서 이 두 엽 또한 분리해야 합니다.먼저 흉선 표면에 위치한 모든 여분의 혈관들을 제거하겠습니다. 영상 촬영 예정인 흉선의 구조가 손상되지 않도록 매우 주의하며, 표면에 바로 붙어 있는 조직만 제거하고 있습니다.이제 두 엽을 조심스럽게 분리하겠습니다. 분리할 부분은 복측 엽과 배측 엽이며, 조직을 부드럽게 절개하여 떼어내겠습니다. 조직이 건조해지는 것을 방지하기 위해 PBS를 소량 분사하겠습니다.이제 두 엽을 분리했습니다. 이것은 특징적인 기타 모양을 띤 등쪽 엽(dorsal lobe)이며, 여기 있는 것이 배쪽 엽(ventral lobe)입니다.각 엽에서 영상 촬영 영역에 불필요한 조직이 없도록 과잉 조직을 제거하겠습니다. 다만, 핀셋으로 잡을 수 있도록 조직을 아주 조금만 남겨두겠습니다. 영상 촬영 시 이러한 과잉 조직을 투과하여 촬영하게 되는데, 이는 사실 불필요하며, 이를 제거함으로써 영상의 품질을 높일 수 있습니다.이제 이미징을 위해 커버 슬립에 마운트할 준비가 된 두 개의 이분된 엽이 준비되었습니다. 이분된 흉선을 이미징하기 위해 준비하려면 수의학용 조직 접착제와 18 x 18 커버 슬립이 필요합니다. 저는 파이펫맨을 사용하여 커버 슬립 위에 소량(1 µL 미만)의 접착제를 도포합니다.따라서 이미지 촬영을 진행할 흉선 길이와 비슷한 정도로 접착제를 한 방울 떨어뜨리겠습니다. 그런 다음 접착제를 넓게 펴 바르는 것이 좋습니다. 흉선의 너비에 맞춰, 두 엽 모두를 동일한 커버슬립 위에 올리겠습니다.이제 여기에 하나 더 놓겠습니다. 과잉 조직에서 엽을 집어 커버슬립 위에 올려놓은 다음, 접착제가 있는 구역으로 끌어당기겠습니다. 다른 엽에 대해서도 동일하게 진행하겠습니다. 다시 한번, 손을 고정하기 위해 접착제가 없는 커버슬립 부위에 접촉시킨 후, 다른 흉선 엽을 커버슬립 위에 올려놓겠습니다.이제 두 흉선 구체를 커버슬립에 부착했으므로, 이미징을 위해 폴에게 전달하겠습니다. 고마워요, Ina. 이 샘플을 가져와서 이미징에 사용할 DME 배지에 넣겠습니다.이것이 저희의 이광자 현미경 설정입니다. 이광자 현미경 촬영은 흉샘 깊숙한 곳까지 관찰하여 형광 세포들이 움직이는 모습을 볼 수 있기 때문에 면역 세포 이미징에 매우 유용합니다. 이 장비는 펄스 적외선 레이저를 사용하여 세포가 형광을 띠게 합니다.당사의 홈 벨트 현미경에는 네 가지 서로 다른 색상을 동시에 시각화할 수 있는 네 개의 카메라가 있으며, 20배 배율의 특수 대물렌즈를 사용합니다. 이 렌즈는 흉선을 담근 DMEM 배지 속으로 직접 들어가는 특수 렌즈로, 0.95 NA를 구현하여 세포를 매우 밝게 관찰할 수 있게 해줍니다. 조직의 건강한 상태를 유지하기 위해 DMEM 배지에 95% oxygen과 5% CO2를 버블링하여 공급합니다.그다음, 용액을 관류 챔버로 펌핑하여 37°C로 가열하며, 이곳에 흉선 엽을 침전시킵니다. 이 시스템을 통해 4시간의 이미징 동안 흉선 내의 세포들을 건강한 상태로 유지할 수 있습니다. 지금까지 이광자 현미경의 이미징 설정 방법을 보여드렸습니다.이제 반복 재생되는 이 영상에서 일부 결과물을 살펴보겠습니다. 여기 네 가지 서로 다른 색상으로 촬영된 흉선을 볼 수 있습니다. 빨간색은 흉선의 혈관이며, 노란색은 흉선 특이적 프로모터의 제어 하에 노란색 형광 단백질을 발현하는 호스트 유래 수지상 세포입니다.여기 보이는 파란색과 초록색 흉선세포는 Ena가 앞서 보여준 입양 전이 기술을 사용하여 신생아 키메라를 만들기 위해 사용한 두 명의 서로 다른 공여자로부터 얻은 것입니다. 초록색 세포는 녹색 형광 단백질을 발현하는 흉선세포이며, 파란색 세포는 청록색 형광 단백질을 발현하는 공여자의 흉선세포입니다. 이것은 이전에 보여드렸던 것과 동일한 루핑 영상입니다만, 이러한 영상을 얻기 위해 우리가 수집하는 데이터 세트의 3차원성을 보여드리고자 합니다.특정 평면에 초점을 맞춰 이미지를 촬영한 다음, 초점 거리를 조금 더 깊게 조절하여 또 다른 이미지를 촬영하고, 다시 더 깊은 곳의 이미지를 촬영하는 과정을 반복합니다. 본 영상의 경우, 약 60 µm 깊이까지 내려가며 이미지 볼륨을 생성했으며, 움직이는 볼륨을 얻기 위해 약 30초마다 이 과정을 반복했습니다. 이 영상은 약 20분에 걸쳐 촬영되었습니다.따라서 시간에 따른 세포의 3차원적 이동을 추적할 수 있습니다. 지금까지 이광자 현미경을 이용한 흉선 이미징 방법을 살펴보았습니다. 이 과정에서 가장 중요한 단계는 첫째, 신생 마우스에 공여자의 골수를 주입하는 것입니다.둘째, 흉선의 구조를 손상시키지 않으면서 흉선을 박리합니다. 셋째, 두 광자 현미경 촬영을 위해 흉선을 커버 글라스에 단단히 부착합니다. 흉선 내 영상 촬영을 통해 흉선 세포의 발달과 다양한 T-세포 레퍼토리의 생성에 관한 많은 질문에 답을 얻을 수 있습니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

in-situ-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

두 광자 영상은 기저 조건에서 림프절 이내에 면역 반응 한 중 림프구 세포 운동성 및 상호 작용을 밝혀있다. 여기, 우리는 T 세포, 림프절의 고립, 그리고 CD4의 영상 운동성 + explanted 림프절의 T 세포의 입양 전송을 보여줍니다.

해부와 마우스에서 주변 림프절의 2 광자 이미징

우리는 반복 murine microglia를 시각화하고 monocytes 순환하는 방법을...

만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서</emNeuroinflammation의 모델 Murine Microglia의> 이미징

본 연구진은 흉선의 생체 내 영상 획득을 위한 새로운 실험실 도구 및 프로토콜을 개발하였습니다. 이러한 기술은 T 세포 발달이 일어나는 흉선 내의 "니치(niches)"를 식별하는 데 도움이 될 것입니다.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

살아있는 동물의 타임랩스 영상은 온전한 뇌의 구조적 재구성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 여기에서는 이광자 현미경으로 살아있는 쥐 피질의 형광 표지된 시냅스 구조를 경두개 이미징할 수 있는 얇은 두개골 제제를 소개합니다.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

프로토콜의 목표는 레이저 스캐닝 현미경 마우스 눈의 앞쪽 챔버에 thymic 임 플 란 트에 의해 thymocytes의 경도 intravital 실시간 추적을 보여주는 것입니다. 각 막의 투명도는 이식의 vascularization 지속적으로 녹음 시 조 셀 모집 및 성숙한 T 세포 출구 수 있습니다.

레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 눈의 앞쪽 챔버에 Thymocytes의 비보에 추적 실시간

이 연구에서는 선물이 인플루엔자 바이러스 감염 후 murine tracheal 점 막에서 2 광자 intravital 이미징 및 세포 상호 작용 분석을 수행 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 호흡기 감염 시 면역 세포 역학을 공부 하는 연구자와 관련이 있을 것입니다.

영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

형태학적 변화는 활성화 다음 면역 반응 섬유 아세포 세포에서 발생하고 세포 모집에 변경을 촉진. 유전자 조작섬유아세포 특이적 단백질 1(FSP1)-cre와 함께 2광자 이미징을 활용; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) 마우스 라인과 녹색 형광 태그 lipopolysaccharide-FITC, 우리는 진피 섬유아세포와 생체 내 형태학적 변화에 있는 lipopolysaccharide의 고도로 특정 한 섭취를 설명할 수 있습니다.

피부에 있는 유전으로 표를 붙인 기자 세포의 Vivo 2 색 2-광자 화상 진찰에서

본 프로토콜은 개복 수술의 위험을 피하고 맹검 경피 주사의 정확도를 향상시키기 위해 마우스에서 흉선 내 주사를 위해 확립 된 중재 적 방사선 절차를 설명합니다.

마우스에서 흉강내 주사를 위한 최소 침습적이고 정확하며 효율적인 기술

여기에서는 이광자 현미경을 사용하여 이식된 쥐의 왼쪽 폐를 생체 내 이미징하는 프로토콜을 제시합니다. 이는 쥐 폐 이식 후 실시간으로 세포 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 유용한 도구입니다.

이식된 마우스 폐의 생체 내 2광자 현미경

이 프로토콜은 형광 스티렌 미세구를 이용한 생 체 내 2광자 현미경 영상에 최적화된 만성 두개골 창문 및 미세혈관 색전증 마우스 모델에 대한 단계별 접근법을 상세히 설명하고 있습니다.

형광 폴리스티렌 미세구를 이용한 생체 내 2광자 현미경용 미세혈관 색전증 마우스 모델

본 연구는 생 체 내 2광자 영상 접근법을 통해 쥐의 앞발 피부에서 저역계 기계수용체(LTMR) 축삭 말단 구조를 시각화하는 방법을 제시합니다. 개별 축삭의 반복적이고 고해상도 영상을 사용하여 이 방법은 발달 과정과 성인에서 피부 감각 회로의 구조와 기능을 연구할 새로운 플랫폼을 제공합니다.

마우스 피부의 촉각 감각 축삭 형태의 생명체 내 2광자 영상

배우세요 마우스 흉선 조직의 현장 영상 촬영을 위한 2광자 현미경 기법을 활용한 면역학 연구 방법입니다. 이 기술은 T세포 이동과 선택 메커니즘을 실시간으로 관찰하여 면역 세포 발달 과정을 심도 있게 이해하는 데 활용됩니다.

2 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 현장 영상에서

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