2 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 현장 영상에서

이광자 이미징은 단일 세포가 주변 환경과 상호작용하며 이동하는 과정을 추적할 수 있어 면역학 연구에 유용합니다. 이광자 현미경을 사용하여 흉선 내 이동을 추적함으로써, 양성 선택 및 음성 선택의 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 버클리의 Ellen Roby 박사 연구실 소속 Ina Lottie입니다. 그리고 저 또한 Ellen Roby 박사 연구실의 Paul Herzmark입니다. 오늘은 흉선 조직의 in situ 이미징 방법을 보여드리고, 이광자 현미경을 사용하여 흉선을 이미징하는 과정을 설명하겠습니다.

이제 이광자 이미징에 이르기까지의 단계들을 보여드리겠습니다. 여기에는 골수에서 조혈모세포를 분리하는 과정, 신생아로의 골수 세포 입양 전이, 흉선의 해부 및 이분절, 그리고 이광자 레이저 주사 현미경 이미징을 위한 조직 준비 절차가 포함됩니다. 그럼 시작하겠습니다.

영상 촬영을 위해 흉선을 준비하기 전, 먼저 신생 생쥐에 골수 세포를 입양 전이시켜야 합니다. 이 골수 세포들은 GFP를 편재적으로 발현하는 형질전환 생쥐의 뒷다리에서 분리되었습니다. 이것은 50 µL의 골수가 들어있는 인슐린 주사기입니다.

공여체 한 마리의 골수를 사용하여 생후 3~7일 된 숙주에게 2~4회 주입합니다. 여기 생후 5일 된 새끼 쥐가 있으며, 주입 중에 새끼 쥐가 움직이지 않도록 하고 피부를 팽팽하게 유지하기 위해 피부를 뒤로 잡아당깁니다. 폐와 갈비뼈 아래, 그리고 장과 위 위의 지점을 주입 부위로 잡습니다.

주입하면서 피부를 잡은 손의 힘을 풀어 피부가 확장될 수 있도록 합니다. 마지막으로, 골수 손실량을 최소화하기 위해 주사기를 천천히 제거합니다. 이 마우스들을 4~6주 동안 성장시킨 후, 영상 촬영을 위해 흉선을 적출할 수 있습니다.

4~6주 후면 흉선을 제거할 수 있습니다. 영상 촬영을 위해 큰 포셉과 가위 한 세트, 그리고 작은 포셉과 가위 한 세트를 사용하겠습니다. 이 마우스는 동물 실험 프로토콜에 따라 희생되었으며 에탄올로 소독되었습니다.

이제 큰 포셉을 사용하여 피부를 집어 정중선에 절개를 넣겠습니다. 가위를 사용하여 정중선을 따라 절개하거나 피부를 복막에서 떼어낼 수 있는데, 여기서는 피부를 핀으로 고정하여 흉강을 노출시키겠습니다. 복막을 절개하며 흉강으로 들어갈 때 흉골을 잡고 지지하며, 횡격막을 통해 흉강으로 진입한 후 흉곽의 측면을 따라 절개하겠습니다.

심장 바로 위에 놓여 있는 흉선을 확인하실 수 있습니다. 다시 제자리에 놓겠습니다. 이것이 흉선입니다.

저는 이 부분을 건드리지 않도록 하겠습니다. 작은 포셉을 사용하여 흉선 주변의 조직을 계속 잡고 계십시오. 이제 PBS를 분사하여 과잉 조직의 일부를 제거하기 시작하겠습니다.

따라서 흉선을 잡기 위해 흉선 주변의 조직을 이용하겠습니다. 흉선을 정제할 때, 과도한 조직을 조심스럽게 잘라내어 제거하겠습니다. 이제 흉선에는 두 개의 엽이 있으며, 정제 과정에서 이 두 엽 또한 분리해야 합니다.

먼저 흉선 표면에 위치한 모든 여분의 혈관들을 제거하겠습니다. 영상 촬영 예정인 흉선의 구조가 손상되지 않도록 매우 주의하며, 표면에 바로 붙어 있는 조직만 제거하고 있습니다.

이제 두 엽을 조심스럽게 분리하겠습니다. 분리할 부분은 복측 엽과 배측 엽이며, 조직을 부드럽게 절개하여 떼어내겠습니다. 조직이 건조해지는 것을 방지하기 위해 PBS를 소량 분사하겠습니다.

이제 두 엽을 분리했습니다. 이것은 특징적인 기타 모양을 띤 등쪽 엽(dorsal lobe)이며, 여기 있는 것이 배쪽 엽(ventral lobe)입니다.

각 엽에서 영상 촬영 영역에 불필요한 조직이 없도록 과잉 조직을 제거하겠습니다. 다만, 핀셋으로 잡을 수 있도록 조직을 아주 조금만 남겨두겠습니다. 영상 촬영 시 이러한 과잉 조직을 투과하여 촬영하게 되는데, 이는 사실 불필요하며, 이를 제거함으로써 영상의 품질을 높일 수 있습니다.

이제 이미징을 위해 커버 슬립에 마운트할 준비가 된 두 개의 이분된 엽이 준비되었습니다. 이분된 흉선을 이미징하기 위해 준비하려면 수의학용 조직 접착제와 18 x 18 커버 슬립이 필요합니다. 저는 파이펫맨을 사용하여 커버 슬립 위에 소량(1 µL 미만)의 접착제를 도포합니다.

따라서 이미지 촬영을 진행할 흉선 길이와 비슷한 정도로 접착제를 한 방울 떨어뜨리겠습니다. 그런 다음 접착제를 넓게 펴 바르는 것이 좋습니다. 흉선의 너비에 맞춰, 두 엽 모두를 동일한 커버슬립 위에 올리겠습니다.

이제 여기에 하나 더 놓겠습니다. 과잉 조직에서 엽을 집어 커버슬립 위에 올려놓은 다음, 접착제가 있는 구역으로 끌어당기겠습니다. 다른 엽에 대해서도 동일하게 진행하겠습니다. 다시 한번, 손을 고정하기 위해 접착제가 없는 커버슬립 부위에 접촉시킨 후, 다른 흉선 엽을 커버슬립 위에 올려놓겠습니다.

이제 두 흉선 구체를 커버슬립에 부착했으므로, 이미징을 위해 폴에게 전달하겠습니다. 고마워요, Ina. 이 샘플을 가져와서 이미징에 사용할 DME 배지에 넣겠습니다.

이것이 저희의 이광자 현미경 설정입니다. 이광자 현미경 촬영은 흉샘 깊숙한 곳까지 관찰하여 형광 세포들이 움직이는 모습을 볼 수 있기 때문에 면역 세포 이미징에 매우 유용합니다. 이 장비는 펄스 적외선 레이저를 사용하여 세포가 형광을 띠게 합니다.

당사의 홈 벨트 현미경에는 네 가지 서로 다른 색상을 동시에 시각화할 수 있는 네 개의 카메라가 있으며, 20배 배율의 특수 대물렌즈를 사용합니다. 이 렌즈는 흉선을 담근 DMEM 배지 속으로 직접 들어가는 특수 렌즈로, 0.95 NA를 구현하여 세포를 매우 밝게 관찰할 수 있게 해줍니다. 조직의 건강한 상태를 유지하기 위해 DMEM 배지에 95% oxygen과 5% CO2를 버블링하여 공급합니다.

그다음, 용액을 관류 챔버로 펌핑하여 37°C로 가열하며, 이곳에 흉선 엽을 침전시킵니다. 이 시스템을 통해 4시간의 이미징 동안 흉선 내의 세포들을 건강한 상태로 유지할 수 있습니다. 지금까지 이광자 현미경의 이미징 설정 방법을 보여드렸습니다.

이제 반복 재생되는 이 영상에서 일부 결과물을 살펴보겠습니다. 여기 네 가지 서로 다른 색상으로 촬영된 흉선을 볼 수 있습니다. 빨간색은 흉선의 혈관이며, 노란색은 흉선 특이적 프로모터의 제어 하에 노란색 형광 단백질을 발현하는 호스트 유래 수지상 세포입니다.

여기 보이는 파란색과 초록색 흉선세포는 Ena가 앞서 보여준 입양 전이 기술을 사용하여 신생아 키메라를 만들기 위해 사용한 두 명의 서로 다른 공여자로부터 얻은 것입니다. 초록색 세포는 녹색 형광 단백질을 발현하는 흉선세포이며, 파란색 세포는 청록색 형광 단백질을 발현하는 공여자의 흉선세포입니다. 이것은 이전에 보여드렸던 것과 동일한 루핑 영상입니다만, 이러한 영상을 얻기 위해 우리가 수집하는 데이터 세트의 3차원성을 보여드리고자 합니다.

특정 평면에 초점을 맞춰 이미지를 촬영한 다음, 초점 거리를 조금 더 깊게 조절하여 또 다른 이미지를 촬영하고, 다시 더 깊은 곳의 이미지를 촬영하는 과정을 반복합니다. 본 영상의 경우, 약 60 µm 깊이까지 내려가며 이미지 볼륨을 생성했으며, 움직이는 볼륨을 얻기 위해 약 30초마다 이 과정을 반복했습니다. 이 영상은 약 20분에 걸쳐 촬영되었습니다.

따라서 시간에 따른 세포의 3차원적 이동을 추적할 수 있습니다. 지금까지 이광자 현미경을 이용한 흉선 이미징 방법을 살펴보았습니다. 이 과정에서 가장 중요한 단계는 첫째, 신생 마우스에 공여자의 골수를 주입하는 것입니다.

둘째, 흉선의 구조를 손상시키지 않으면서 흉선을 박리합니다. 셋째, 두 광자 현미경 촬영을 위해 흉선을 커버 글라스에 단단히 부착합니다. 흉선 내 영상 촬영을 통해 흉선 세포의 발달과 다양한 T-세포 레퍼토리의 생성에 관한 많은 질문에 답을 얻을 수 있습니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.