Name: 암의 환자 유래 오가노이드 모델에서 약물 반응을 위한 다중 라이브 셀 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 학습하세요 환자 유래 종양 오가노이드에서 다중 라이브 셀 이미징을 이용한 약물 반응 평가 방법을. 이 기술은 분자 특성 분석과 임상시험 치료제 우선순위 선정에 활용됩니다.

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환자 종양 표본을 제공해준 아이오와 대학의 조직 조달 코어(Tissue Procurement Core)와 크리스틴 콜먼(Kristen Coleman) 박사, PDO 모델 생성에 도움을 준 산부인과의 소피아 가브릴로비치(Sofia Gabrilovich) 박사에게 감사드립니다. 또한 원고를 비판적으로 분석해 주신 Valerie Salvatico 박사(미국 애질런트)에게도 감사드립니다. 우리는 다음과 같은 자금 출처를 인정합니다 : NIH / NCI CA263783 및 DOD CDMRP CA220729P1 KWT로; 영국 암 연구(Cancer Research UK), 영국 전립선암 협회(Prostate Cancer UK), 전립선암 재단(Prostate Cancer Foundation) 및 의학 연구 위원회(Medical Research Council)에서 JSdB로 이동합니다. 연구비 지원자들은 실험의 설계나 분석, 출판 결정에 아무런 역할도 하지 않았다.

환자 유래 종양 오가노이드의 약물 평가를 위한 자동 Kinetic Imaging

<ol><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
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<li>Herpers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+patient-derived+organoid+screenings+identify+MCLA-158+as+a+therapeutic+EGFR+x+LGR5+bispecific+antibody+with+efficacy+in+epithelial+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cancer%22%5BJournal%5D)">Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors.</a> Nat Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).</li>
<li>Ramm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+live+and+fixed+cell+imaging+method+to+screen+matrigel-embedded+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Organoids%22%5BJournal%5D)">High-throughput live and fixed cell imaging method to screen matrigel-embedded organoids.</a> Organoids. 2 (1), 1-19 (2023).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>Van Hemelryk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+analysis+and+high-content+live-cell+imaging+for+drug+testing+in+prostate+cancer+xenograft-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Viability analysis and high-content live-cell imaging for drug testing in prostate cancer xenograft-derived organoids.</a> Cells. 12 (10), 1377(2023).</li>
<li>Bi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+tyrosine+kinase+anti-angiogenic+cediranib+over+bevacizumab%3A+Cell+cycle+abrogation+and+synergy+with+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Advantages of tyrosine kinase anti-angiogenic cediranib over bevacizumab: Cell cycle abrogation and synergy with chemotherapy.</a> Pharmaceuticals (Basel). 14 (7), 682(2021).</li>
<li>Bi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+autophagy+overcomes+resistance+to+dual+histone+deacetylase+and+proteasome+inhibition+in+gynecologic+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Blocking autophagy overcomes resistance to dual histone deacetylase and proteasome inhibition in gynecologic cancer).</a> Cell Death Dis. 13 (1), 59(2022).</li>
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</ol>

KWT는 Immortagen Inc.의 공동 소유주이며, CJD는 애질런트의 직원입니다. JSdB는 Amgen, Astra Zeneca, Astellas, Bayer, Bioxcel Therapeutics, Boehringer Ingelheim, Cellcentric, Daiichi, Eisai, Genentech/Roche, Genmab, GSK, Harpoon, ImCheck Therapeutics, Janssen, Merck Serono, Merck Sharp & Dohme, Menarini/Silicon Biosystems, Orion, Pfizer, Qiagen, Sanofi Aventis, Sierra Oncology, Taiho, Terumo 및 Vertex Pharmaceuticals로부터 자문 위원회에서 활동하며 수수료를 받았습니다. AZ, 아스텔라스, 바이엘, 셀센트릭, 다이이치, 제넨테크, 젠맙, GSK, 얀센, 머크 세로노, MSD, 메나리니/실리콘 바이오시스템즈, 오리온, 사노피 아벤티스, 시에라 온콜로지, 타이호, 화이자, 버텍스로부터 연구 연구에 대한 자금 지원 또는 기타 지원을 받은 암 연구소(ICR)의 직원이며, DNA 복구 결함 암에서 아비라테론, PARP 억제에 상업적 관심을 가지고 있습니다. 및 PI3K/AKT 경로 억제제(개인 소득 없음); 코르티코스테로이드와 함께 아비라테론 아세테이트의 사용을 다루는 Janssen이 제출한 특허 8 822 438에 대한 재정적 이해관계가 없는 발명자로 지명되었습니다. 많은 업계 후원 임상 시험의 CI/PI였습니다. 미국 국립보건연구소(NIHR) 선임 연구원입니다. 다른 저자는 공개할 잠재적인 이해 상충이 없습니다.

PDO 배양은 세포 반응과 거동을 반영할 수 있는 능력으로 인해 체외 모델 시스템에서 점점 더 인기를 얻고 있다2. PDO 생성, 배양 및 확장 기술에서 상당한 발전이 이루어졌지만 치료 반응을 분석하는 방법은 뒤처져 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 3D 생존도 키트는 용해 종말점 분석으로, 잠재적으로 가치 있는 역학 반응 데이터를 놓치고 다른 방법에 의한 후속 분석을 제한한다8. 새로운 연구에서는 PDO 모델에서 약물 반응을 평가하기 위해 라이브 셀 이미징을 적용하고 있습니다. 여기에서는 다중 형광 생세포 이미징을 활용하여 시간 경과에 따른 PDO 치료 반응을 평가하는 방법을 제시합니다. 형광 염료를 다중화하면 서로 다른 세포 반응을 동시에 정량화할 수 있습니다. 세포사멸 및 세포독성 외에도 이 접근법은 PDO의 다른 표현형 효과를 조사하기 위해 향후 연구에서 확장될 수 있을 것으로 예상합니다.
여기에 제시된 프로토콜은 96웰 플레이트에서 돔으로 도금된 PDO의 동역학적 명시야 및 형광 이미지를 획득하도록 설계되었습니다. 주요 단계에는 1) 도금, 2) 염료 및 약물 처리, 3) 이미징 파라미터 정의, 4) 키네틱 이미지 획득 완료 시 이미지 전처리 및 분석, 5) 다른 통계 소프트웨어에서 분석을 위한 데이터 내보내기가 포함됩니다(그림 1). 원형(intact) PDO는 BME와 오가노이드 배양 배지(Organoid Culture Media)의 사전 정의된 비율(일반적으로 1:1)로 구성된 5μL BME 돔으로 96웰 플레이트에 도금됩니다. 여기에 제시된 프로토콜은 배치 간 변동성이 최소화되고 이미징을 위한 우수한 광학 특성으로 인해 UltiMatrix를 BME로 사용합니다. Matrigel과 같은 다른 BME에서 배양된 PDO 수확을 위한 수정뿐만 아니라 덩어리가 많고 해리하기 어려운 모델에 대한 수정이 필요할 수 있습니다( 예제 보충 그림 4 참조). 다음으로, 형광 염료를 100μL 부피의 2배 농도로 도금 시(-1일)에 오가노이드 배양 배지에 첨가하고 밤새 배양하여 기준선 세포 사멸을 결정합니다. 다음 날(0일)에 약물 또는 기타 처리제를 100μL 용량의 2배 농도로 오가노이드 배양 배지에 첨가한 다음 각 웰에 추가하여 최종 부피 200μL를 만듭니다. 200μL의 최종 부피는 이미징으로 메니스커스 효과를 줄입니다. Kinetic 이미지는 BioSpa 탁상용 인큐베이터와 함께 Cytation 5 플레이트 리더를 사용하여 획득합니다. BioSpa 인큐베이터는 37°C의 고정 온도 및 5%CO2 환경에서 실험용 플레이트를 배양할 수 있습니다. BioSpa에는 최대 8개의 플레이트를 보관할 수 있으며, 이를 통해 8개의 실험을 동시에 수행할 수 있습니다. 각 플레이트에 대한 이미징 매개변수는 "Imager Manual Mode"를 사용하여 Gen5 소프트웨어에서 설정되고 프로토콜로 저장됩니다. 그런 다음 프로토콜이 스케줄링 소프트웨어(BioSpa OnDemand)에 로드됩니다. BioSpa OnDemand 소프트웨어는 BioSpa 인큐베이터에서 Cytation 5로 플레이트를 물리적으로 옮기고 데이터 수집을 위해 Gen5에서 실행할 프로토콜을 지시하는 등 키네틱 이미지 획득을 위한 워크플로우를 자동화합니다. 이미지는 Gen5 소프트웨어의 세포 분석 기능을 사용하여 분석됩니다(그림 2). 형광 및 명시야 이미지의 Z 투영을 분석하는 구체적인 방법을 설명합니다. 단일 Z 평면 및/또는 명시야 이미지만 분석하는 구체적인 방법은 보충 파일 1에 나와 있습니다. 마지막으로, 사용자는 PDO 면적, 개수 및 평균 형광 강도와 같은 특정 데이터 기능을 정의하여 약물 효과에 대한 후속 통계 분석을 위해 Excel 스프레드시트로 내보낼 수 있습니다.
PDO 모델이 약물 효과를 조사하는 비교적 새로운 모델 시스템이라는 점을 감안할 때, 배양 조건, 특히 BME의 증가를 수용하는 방법은 여전히 등장하고 있다16. 약물 치료에 대한 PDO 반응을 평가하는 대부분의 연구는 세포 건강을 위한 대리물로 ATP 기반 종말점 분석(CellTiter-Glo 3D)에 의존합니다. 이 방법은 세포 용해가 필요하므로 후속 다운스트림 분석이 필요하지 않습니다. 형광 염색, 단일 시점 이미징 및 형태학적 추적과 같은 대체 종말점 분석은 약물 반응을 특성화하는 동시에 추가 목적으로 샘플을 사용할 수 있는 다른 지표를 제공했습니다. 예를 들어, 약물 효과의 고처리량 분석을 위해 인플레이트(in-plate) 종말점 고정 프로토콜이 적용되었다17,18. 이 방법의 장점은 일반적인 면역조직화학 및 면역형광 이미징19에 필요한 광범위한 처리를 우회하고 PDO 모델의 경우와 같이 샘플이 제한될 때 특히 유용하다는 것입니다. 또한 컨포칼 현미경을 사용한 고해상도 이미징이 가능합니다. 세포 용해가 필요하지 않은 또 다른 종점 분석법은 propidium iodide 또는 acridine orange와 같은 시약을 사용한 살아있는 세포 이미징입니다. 세포 생존율 및 사멸 평가를 위해 세포 용해가 필요하지 않은 CellTiter-Glo 3D와 AOPI의 비교 분석(그림 6C)은 PDO 모델에서 살아있는 세포 이미징 염료를 사용할 때의 이점을 강조합니다. 이 방법은 실험 18,19,20의 결론에서 표현형 효과를 평가하기 위해 우리를 포함한 여러 그룹에 의해 적용되었습니다. 그러나 인웰 고정(in-well fixation) 또는 종말점 라이브 셀 이미징 방법을 사용한 키네틱 데이터 수집에는 상당한 샘플이 필요합니다. 시간 경과에 따른 PDO의 무표지 형태학적 평가는 부분적으로 이러한 한계를 극복하고 광범위한 이미징 양식(8,10,17,18)을 사용하여 평가할 수 있지만, 형태학의 변화는 세포사멸 및 세포 생존율의 변화와 같은 잠재적인 약물 효과의 스펙트럼을 대표하지 않을 수 있습니다. 우리는 약물에 대한 반응의 형태학적 변화에서 상당한 모델 간 가변성을 관찰했습니다. 예를 들어, 일부 PDO는 세포 사멸을 겪으면서 면적이 증가하는 반면 다른 모델은 줄어들 수 있습니다. Kinetic morphologic assessments는 제한된 수의 연구에서 고정 또는 살아있는 세포 형광 종점 분석으로 다중화되었습니다18,20. 여기에 제시된 분석법은 고처리량 시스템에서 여러 세포 효과를 동시에 평가하기 위해 다양한 형광 염료를 다중화한 최초의 방법 중 하나입니다.
kinetic live-cell 이미징이 제공하는 가장 큰 개선 사항 중 하나는 종말점 분석과 관련된 주요 한계를 극복한다는 것입니다. 예를 들어, 웰당 동일한 수의 PDO를 도금하는 것은 기술적으로 어려운데, 대부분의 자동화된 셀 카운터는 60μm보다 작은 물체에 대해 게이트(gated)되기 때문입니다. 살아있는 세포 이미징을 통해 각 웰에서 시간 0시간에 PDO 수 또는 면적을 정규화할 수 있으며, 이를 사용하여 웰 간 도금 변화를 조정할 수 있습니다. PDO에 대한 최적 표준 종점 분석은 세포 생존율에 대한 대리물로 ATP를 측정하는 CellTiter-Glo 3D 키트입니다. 우리는 부인과 및 전립선암 PDO 13,21,22,23,24의 연구에서 이 분석을 광범위하게 사용했습니다. ATP 측정을 위해 세포 용해가 필요할 뿐만 아니라 약물 및 기타 치료 방식은 ATP 수치를 변화시켜 잠재적으로 치료 반응에 대한 부정확한 평가를 제공할 수 있습니다. 살아있는 세포 이미징 염료를 활용하면 세포 사멸 및 세포 독성과 같은 특정 세포 반응의 더 넓은 범위를 정량화할 수 있습니다. 중요한 것은 이러한 시약이 프로피듐 요오드화물의 경우와 같이 세포 생존력을 교란하거나 DNA 손상을 유도하지 않는다는 것입니다. 이를 통해 시간 경과에 따른 PDO 응답을 반복적으로 평가할 수 있습니다. 우리는 운동 측정을 위한 아크리딘 오렌지(AO)의 사용을 탐구하지 않았지만, AO에 대한 작용 메커니즘은 향후 그러한 적용을 배제해서는 안 됩니다.
종양은 다양한 게놈 프로필과 형태를 가진 여러 개의 별개의 세포 집단으로 구성됩니다. PDO 모델의 복잡한 이질성으로 인해 개별 PDO 응답은 다를 수 있으며 이러한 응답을 추적하는 것은 어렵습니다. 당사의 프로토콜은 웰 단위로 여러 PDO 응답 메트릭을 평가하는 방법을 제공합니다. 그러나 특정 기술적 고려 사항은 여전히 살아있는 세포 이미징에 적용됩니다. 96웰 플레이트를 시드하는 데 필요한 24웰 플레이트의 웰 수는 각 PDO 모델의 밀도와 성장률에 따라 달라집니다. 응집은 이미지 분석을 혼란스럽게 할 수 있기 때문에(보충 그림 4) PDO 모델은 도금 전에 추가 처리 단계가 필요할 수 있습니다. 필요한 경우, PDO는 넓지 않은 보어 p200 팁을 사용한 격렬한 피펫팅을 통해 가공 중에 기계적으로 전단될 수 있습니다. TrypLE Express를 사용한 효소 분해는 PDO 해리를 촉진하고 응집을 줄이기 위해 도금 전에 사용할 수도 있습니다. 경험에 비추어 볼 때, TrypLE 배양 기간은 모델에 따라 매우 다양합니다. 따라서 TrypLE 배양은 특히 연구자가 단일 세포 현탁액을 얻고자 하는 경우 각 모델에 맞게 최적화되어야 합니다. 효소 분해에 특히 민감한 PDO 모델의 경우 치료를 시작하기 전의 회복 시간이 필요할 수 있습니다.
특정 live-cell imaging 시약에 대한 방법을 제시합니다. 본원에 제시된 방법의 광범위한 적용 가능성에 있어서의 한계는 BME와 상용성이 있는 시약의 부족이다. PDO에 사용하도록 아직 최적화되지 않은 다른 염료/시약의 경우 최적의 농도를 결정하고 용매 효과를 최소화하기 위해 추가 문제 해결이 필요할 수 있습니다. 관심 판독값(예: 세포사멸 또는 세포독성)에 따라 시약 조건을 최적화하기 위해 스타우로스포린 또는 다우노루비신13 과 같이 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려진 화합물을 사용한 처리를 사용해야 합니다. 추가 고려 사항은 염료를 BME 돔에 통합하기 위한 최적의 시간입니다. 실험에서는 염료를 돔에 완전히 흡수하고 기본 세포 건강을 결정하기 위해 처리 전에 하룻밤 배양을 수행합니다. 신호 강도는 시간이 지남에 따라 증가하기 때문에 연구원은 과다 노출 이미지를 피하기 위해 실험이 끝날 때 이상적인 노출 시간을 결정하기 위해 염료로 파일럿 연구를 수행해야 합니다. 마지막으로, 시약은 세포 과정을 방해해서는 안 됩니다. 예를 들어, DNA에 삽입되는 염료는 키네틱 이미징과 호환되지 않습니다. 그러나 라이브 셀 이미징은 종말점 분석에서 데이터 정규화에 사용할 수 있습니다. 실제로, 우리는 AOPI를 사용하여 세포 생존율과 생존 가능: 죽은 세포 비율을 정량화하는 보충 방법을 제시합니다. 이 실험에서 형광 신호는 0일째(치료일, 그림 6)에 살아있는 세포 이미징에 의해 결정되고 각 웰에 대한 PDO 번호로 정규화됩니다.
이 방법 논문의 또 다른 한계는 실험을 위해 수동 피펫팅에 의존한다는 것인데, 이는 기술 반복에서 더 큰 편차를 초래할 수 있습니다. 데이터 재현성의 추가적인 개선은 다른 사람들에 의해 입증된 바와 같이, 도금 및 약물 분배를 위한 자동화된 액체 핸들러의 사용과 같은 실험 공정의 다른 단계에 자동화를 추가함으로써 달성될 수 있다 8,10. 그러나 이러한 추가에는 모든 연구자가 사용할 수 없는 연구 인프라에 대한 추가 투자가 필요합니다. 각 모델에 대한 PDO 영역의 이질성을 감안할 때 시간 0h에서 초기 PDO 번호 또는 영역으로 결과를 정규화하는 것은 자동화된 시드를 사용하는 여전히 유용한 접근 방식입니다.
다른 살아있는 세포 이미징 플랫폼에 비해 Cytation 5의 주요 장점은 이미지 및 분석 기능을 맞춤화할 수 있다는 것입니다. 그러나 Cytation 5/Gen5 소프트웨어는 학습 곡선이 가파르며 사용자가 이미징에 대한 기초 지식을 가지고 있다고 가정합니다. 이 방법 논문의 목표 중 하나는 다른 연구자들이 PDO 연구 프로그램에 정교한 라이브 셀 이미징 기술을 통합하는 장벽을 줄이기 위한 단계별 지침을 제공하는 것입니다. 여기에 제시된 특정 분석 단계는 하나의 시스템에 대한 것이지만 사용자는 다운스트림 분석을 위해 NIH ImageJ와 같은 타사 소프트웨어를 사용해야 할 수 있다는 점을 이해하고 멀티플렉싱 원칙을 다른 플랫폼에 적용할 수 있습니다.
분석 지표는 실험 목표와 도금 조건을 모두 기준으로 선택해야 합니다. 예를 들어, 세포 사멸을 정량화하기 위해 형광 염료를 사용하여 실험을 수행하는 경우 형광 강도가 효과적인 판독 방법입니다. 가장 효과적인 형광 메트릭(Total Fluorescence vs. Object Mean Intensity)은 도금 조건에 따라 달라집니다(보충 그림 4). PDO가 고르게 분산되어 있고 더 원형적이고 응집력 있는 형태를 갖는 경우 정의된 PDO 부분집단에서 형광을 측정할 수 있습니다. Gen5 소프트웨어의 특정 기능은 Cellular Analysis이며 출력은 Object Mean Intensity입니다. 그러나 PDO 모델이 덩어리져 있거나 원반형 형태가 있는 경우 이미지 수준에서 형광 신호를 정량화하는 것이 좋습니다. 이 기능은 Image Statistics(이미지 통계)에서 찾을 수 있으며 출력은 Total Fluorescence Intensity(총 형광 강도)입니다. 이 방법은 개별 웰 레벨에서 변화를 관찰하는 데 유용하지만, 이 지표는 관심 객체에만 국한되지 않으며 실험 기간 동안 PDO가 지정된 플러그 밖으로 이동할 경우 잘못 변경될 수 있습니다. 상당한 파편이나 죽은 단일 세포가 있는 시나리오에서는 PDO와 특별히 관련되지 않은 형광 신호를 차단하기 위해 세포 분석을 사용하는 것이 좋습니다. 세포 분석과 이미지 통계를 사용한 차등 결과의 예는 보충 그림 5에 나와 있습니다.
이미지 통계 기능에 대한 최적의 임계값을 결정하기 위해 라인 도구를 사용할 수 있습니다. 라인 도구를 사용하여 사용자는 이미지 내의 형광 강도 범위를 결정할 수 있습니다. 하한 임계값을 이미지 내 피크 강도의 25% 값으로 설정합니다. 지정된 임계값에 포함된 형광 영역을 보려면 "Threshold Outliers" 상자를 선택합니다. 더 낮은 임계값의 추가 미세 조정이 필요할 수 있습니다.
살아있는 세포 이미징의 중요한 과제는 각 실험에서 생성된 방대한 양의 데이터를 저장하는 것입니다. 이는 Z-Stack을 사용하여 여러 초점면에 걸쳐 이미지를 생성하고 Z 투영을 생성하는 PDO 문화의 경우 특히 관련이 있습니다. 이 문제를 극복하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 첫째, 적절한 저장 용량을 확보하십시오. 총 17TB의 솔리드 스테이트 하드 드라이브 3개를 설치했습니다. 다른 옵션으로는 실험용 파일을 외장 하드 드라이브 또는 네트워크 스토리지로 전송하는 것이 있습니다. 클라우드 기반 스토리지에 파일을 직접 쓰는 것은 권장되지 않습니다. 외장 드라이브에 저장된 데이터를 분석하려면 실험 및 이미지 파일을 Gen5 소프트웨어가 장착된 컴퓨터로 전송하기만 하면 됩니다(참고: 대용량 파일은 전송하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있음). 분석하기 전에 이미지를 실험에 다시 연결해야 합니다. 실험 파일을 열고, 도구 모음에서 프로토콜을 클릭하고, 프로토콜 옵션을 선택합니다. 이미지 저장 옵션(Image Save Options)을 클릭하고 새 이미지 폴더 선택(Select new image folder)을 클릭합니다. 이미지 파일을 찾아 다시 연결할 폴더 선택을 클릭합니다.
실험의 목표에 따라 Gen5 내에서 범주화 기능을 사용하는 것이 적합할 수도 있습니다. 범주화는 픽셀 수를 줄여 파일 크기를 줄여 이미지 해상도를 낮춥니다(3.5.3.2단계 참조). 따라서 고해상도 이미지가 필요한 경우 범주화하지 않는 것이 좋습니다. 비닝 기능을 사용할 때 노출 설정을 조정해야 합니다. 실험 파일이 생성되면 이미지 섹션을 두 번 클릭하고 현미경 아이콘을 클릭하여 Imager Manual Mode를 다시 엽니다. 자동 노출 기능을 사용하거나 필요에 따라 노출을 수동으로 조정합니다.
요약하면, 세포독성 물질에 반응하여 PDO의 세포 사멸 및 세포 건강을 평가하는 방법을 제시합니다. 향후 연구는 방법을 최적화하고 세포독성이 아닌 세포증식 억제 약물의 다른 표현형 및 효과와 같은 PDO의 키네틱 이미징을 위한 추가 분석 전략을 개발하는 데 필요합니다. 주요 장애물은 BME와 호환되는 염료 및 시약의 상업적 가용성입니다. 이러한 모델에서 가장 많은 데이터를 추출하기 위해 kinetic live-cell 이미징을 최대한 활용할 수 있는 방법을 더 잘 이해하려면 아직 더 많은 작업이 필요합니다.

환자 유래 종양 오가노이드(PDO)는 암 발생 및 치료 반응을 연구하기 위한 강력한 모델 시스템으로 빠르게 부상하고 있습니다. PDO는 원발성 종양 1,2의 복잡한 게놈 프로필과 구조를 재현하는 3차원(3D) 세포 배양 시스템입니다. 불멸화된 암 세포주의 전통적인 2차원(2D) 배양과 달리, PDO는 종양 내 이질성 3,4을 포착하고 유지하므로 기계론적 연구와 중개 연구 모두에 유용한 도구입니다. PDO가 점점 더 대중화된 모델 시스템이 되고 있지만, PDO 배양과 호환되는 세포 효과에 대한 상업적으로 이용 가능한 시약 및 분석 방법은 제한적입니다.
치료 반응의 미묘한 변화를 분석할 수 있는 강력한 방법이 없기 때문에 임상 번역이 방해를 받습니다. 3D 배양에서 최고의 세포 건강 시약인 CellTiter-Glo 3D는 ATP 수준을 세포 생존율의 결정 요인으로 활용합니다 5,6. 이 시약은 종말점 분석에 유용하지만 몇 가지 주의 사항이 있으며, 특히 분석 완료 후 다른 목적으로 샘플을 사용할 수 없다는 점이 가장 두드러집니다.
살아있는 세포 이미징은 형광 시약과 결합할 때 세포사멸 7,8,9 및 세포 독성10을 포함하여 PDO 모델 내에서 다양한 세포 건강 판독값을 정량화할 수 있는 정교한 형태의 키네틱 현미경입니다. 실제로, 살아있는 세포 이미징은 2D 플랫폼에서 화합물의 고처리량 스크리닝에 필수적이었습니다11,12. Incucyte와 같은 시스템은 기술을 저렴하게 만들어 다양한 환경에서 연구 그룹에 액세스할 수 있도록 했습니다. 그러나 3D 배양을 분석하기 위한 이러한 시스템의 적용은 아직 초기 단계에 있습니다.
여기에서는 다중 생세포 이미징을 사용하여 암의 PDO 모델에서 약물 반응을 평가하는 방법을 설명합니다(그림 1). 명시야 이미지 분석을 통해 PDO 크기 및 형태 변화를 운동학적으로 모니터링할 수 있습니다. 또한 세포 사멸을 위한 Annexin V Red Dye 및 세포 독성을 위한 Cytotox Green Dye와 같은 형광 시약을 사용하여 시간 경과에 따라 세포 과정을 동시에 정량화할 수 있습니다. 제시된 분석법은 Cytation 5 live-cell imaging system에 최적화되어 있지만, 이 프로토콜은 다양한 live-cell imaging 플랫폼에 적용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>1008113</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.100</td><td></td></tr><tr><td>554 NM LED 큐브</td><td>애질런트</td><td>1225012</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>Corning Costar</td><td>3596 37</td>°<td>도로 예열됨; C</td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Agilent</td><td>204626-100</td><td>37°C로 예열됨; C</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>최종 농도는 500 nM (오가노이드 배양 배지의 성분)</td></tr><tr><td>고급 DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td>오가노이드 배양 배지의 성분</td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>최종 농도는 1x(유기노이드 배양 배지의 성분)</td></tr><tr><td>BioTek BioSpa 8 자동 인큐베이터</td><td>Agilent</td><td>BIOSPAG-SN</td><td>탁상 인큐베이터; BioSpa OnDemand 스케줄링 소프트웨어는 Gen5와 결합하여 이미징을 위해 BioSpa와 Cytation 5 간에 플레이트를 전송합니다(이 프로토콜은 버전 1.01.10 사용)</td></tr><tr><td>BioTek Cytation 5 세포 이미징 멀티모드 리더</td><td>, Agilent</td><td>CYT5PW-SN</td><td>플레이트 리더; 이 장치에는 Gen5 소프트웨어가 사용됩니다(이 프로토콜은 버전 3.12.08 사용)</td></tr><tr><td>Cultrex UltiMatrix 저성장 인자 기저막 추출물</td><td>R& D Systems</td><td>BME001-10</td><td></td></tr><tr><td>Daunorubicin HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3035</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris</td><td>1099</td><td>최종 농도는 10 &micro입니다. M (오가노이드 배양 배지의 성분)</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>최종 농도는 1x (오가노이드 배양 배지의 성분)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>최종 농도는 10 mM (오가노이드 배양 배지의 성분)</td></tr><tr><td>인간 EGF, 동물 무첨가 재조합 단백질</td><td>Gibco</td><td>AF-100-15-1MG</td><td>최종 농도는 0.5 ng/mL (오가노이드 배양 배지의 성분)입니다.</td></tr><tr><td>Human FGF-10 Recombinant Protein</td><td>Gibco</td><td>100-26-1MG</td><td>최종 농도는 10ng/mL(오가노이드 배양 배지의 성분)</td></tr><tr><td>Human R-Spondin 1 Recombinant Protein</td><td>Gibco</td><td>120-38-5UG</td><td>최종 농도는 250ng/mL(오가노이드 배양 배지의 성분)</td></tr><tr><td>Hydrocortisone Stock Solution</td><td>StemCell Technologies</td><td>7926</td><td>최종 농도는 500ng/mL(오가노이드 배양 배지의 성분)입니다.</td></tr><tr><td>이미징 필터 큐브 - GFP</td><td>Agilent</td><td>1225101</td><td></td></tr><tr><td>이미징 필터 큐브 - TRITC</td><td>Agilent</td><td>1225125</td><td></td></tr><tr><td>Imaging LED GFP/CFP</td><td>Agilent</td><td>1225001</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte Annexin V Red Dye</td><td>Sartorius</td><td>4641</td><td>오가노이드 배양 배지에서 재구성</td></tr><tr><td>Incucyte Cytotox Green Dye</td><td>Sartorius</td><td>4633</td><td>DMSO 솔루션</td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td>최종 농도는 1.25mM(오가노이드 배양 배지의 구성 요소)</td></tr><tr><td>Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI 염색 용액</td><td>Fisher-Scientific</td><td>13366169</td><td>1:50 부피</td></tr><tr><td>추가 Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>최종 농도는 10mM(오가노이드 배양 배지의 구성 요소)</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R& D Systems</td><td>6057-NG</td><td>최종 농도는 100ng/mL(오가노이드 배양 배지의 구성 요소)</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>최종 농도는 10 units/mL(오가노이드 배양 배지의 구성 요소)</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-05</td><td>최종 농도는 100 &micro입니다. g/mL (오가노이드 배양 배지의 성분)</td></tr><tr><td>재조합 인간 헤레굴린&베타;-1</td><td>Pepro Tech</td><td>100-03</td><td>최종 농도는 37.5 ng/mL (오가노이드 배양 배지의 성분)</td></tr><tr><td>스트렙토마이세스 sp.의 스타우로스포린 용액입니다.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6942</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632, CAS 331752-47-7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>688000</td><td>최종 농도는 5 &마이크로입니다. M (오가노이드 배양 배지의 성분)</td></tr> <tr><td>&beta; -Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td>최종 농도는 100 nM (오가노이드 배양 배지의 성분)입니다.</td></tr></tbody></table>

암의 환자 유래 오가노이드 모델에서 약물 반응을 위한 다중 라이브 셀 이미징

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

암 환자 유래 오가노이드(PDO) 모델은 암 세포주와 비교하여 인간 질병을 더 잘 재현하는 다기능 연구 시스템입니다. PDO 모델은 세포외 기저막 추출물(BME)에서 환자 종양 세포를 배양하고 3차원 돔으로 도금하여 생성할 수 있습니다. 그러나 단층 배양에서 표현형 분석에 최적화된 시판되는 시약은 BME와 호환되지 않는 경우가 많습니다. 여기에서는 자동화된 라이브 셀 이미징 시스템을 사용하여 PDO 모델을 도금하고 약물 효과를 평가하는 방법을 설명합니다. 또한 kinetic 측정과 호환되는 형광 염료를 적용하여 세포 건강과 세포 사멸을 동시에 정량화합니다. 이미지 캡처는 며칠에 걸쳐 일정한 시간 간격으로 발생하도록 사용자 지정할 수 있습니다. 사용자는 개별 Z 평면 이미지 또는 여러 초점면의 연속 이미지의 Z 프로젝션에서 약물 효과를 분석할 수 있습니다. 마스킹을 사용하여 PDO 번호, 면적 및 형광 강도와 같은 특정 관심 파라미터를 계산합니다. 당사는 세포 독성 물질이 세포 건강, 세포 사멸 및 생존력에 미치는 영향을 입증하는 개념 증명 데이터를 제공합니다. 이 자동화된 키네틱 이미징 플랫폼은 암의 PDO 모델에서 다양한 치료 효과를 이해하기 위해 다른 표현형 판독으로 확장될 수 있습니다.

환자 유래 종양 오가노이드는 기초 및 중개 연구를 위한 정교한 모델 시스템입니다. 이 방법 기사에서는 다양한 오가노이드 표현형의 동시 역학 평가를 위한 다중 형광 라이브 셀 이미징의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

실제 환자 종양 표본에서 생성된 환자 유래 오가노이드 모델을 적용하여 종양이 약물에 어떻게 반응하는지 조사합니다. 또한 반응과 상관 관계가 있는 분자 특성을 정의할 수 있습니다. 이러한 결과는 향후 임상시험에서 발전할 최고의 신치료법의 우선 순위를 정하는 데 사용됩니다.환자 유래 오가노이드 모델을 사용할 때 가장 큰 어려움 중 하나는 오가노이드 모델이 한정된 리소스라는 것입니다. 또한 전사체 프로파일링과 같은 다른 다운스트림 분석을 허용하는 형식으로 샘플을 보존하는 오가노이드 모델에서 약물 반응을 평가하기 위한 기성 키트는 거의 없습니다. 우리는 오가노이드 모델에서 치료 반응을 운동학적으로 모니터링하기 위한 다중화 접근법을 개발했습니다.우리는 다양한 세포 과정에 특이적인 형광 염료를 사용하여 각 오가노이드 모델의 약물 활성 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 단일 실험에서 기능 및 시간 경과 데이터를 모두 수집하며 샘플은 다른 분석에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 방사선 민감도를 포함하여 저분자 억제제를 넘어 광범위한 치료 양식에 대한 반응을 평가하는 데 적용할 수 있습니다.우리는 또한 노화와 같이 운동학적으로 측정할 수 있는 다른 세포 표현형을 위한 도구를 개발하여 혁신을 계속하고 있습니다.

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GFP Lentivirus 불리고 Organoids 환자 파생 결 장 종양에서 경작에 의해 생성 된 Micrometastases의 고감도 검출

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