Name: 자폐 스펙트럼 장애의 초파리 모델에서 행동 평가를 위한 패러다임 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 학습하세요 초파리 자폐 스펙트럼 장애 모델에서 공격성, 사회적 간격, 구애, 그루밍, 적응 행동을 평가하는 5가지 표준 행동 분석 기법을 사용하는 방법. 이 방법은 유전자와 행동 결손 간 관계를 정량화하여 신경과학 연구에 활용됩니다.

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습관화 및 냄새 선택 분석 설정을 해준 Mani Ramaswami(NCBS, 방갈로르)와 Baskar Bakthavachalu(IIT Mandi), 공격성 분석에 대한 귀중한 제안을 해준 Pavan Agrawal(MAHE), 구애 분석 챔버 프로토타입 및 Fmr1 돌연변이 플라이 라인을 공유해 준 Amitava Majumdar(NCCS, Pune), MB247-GAL4 라인을 공유해 준 Gaurav Das(NCCS, 푸네)에게 깊은 감사를 드립니다. Bloomington Drosophila Stock Center(BDSC, 인디애나, 미국), National Institute of Genetics(NIG, 교토, 일본), Banaras Hindu University(BHU, 바라나시, 인도) 및 National Center for Biological Science(NCBS, 방갈로르, 인도)에 초파리 계통에 감사드립니다. 실험실에서의 연구는 SERB-DST (ECR/2017/002963)에서 AD에 수여한 보조금, AD에 수여된 DBT Ramalingaswami 펠로우십(BT/RLF/재진입/2016년 11월) 및 인도 IIT Kharagpur의 기관 지원으로 지원되었습니다. SD와 SM은 CSIR-Senior Research Fellowship에서 박사 학위를 받습니다. PM은 인도 MHRD에서 박사 학위 펠로우십을 받았습니다.

초파리 자폐 스펙트럼 장애의 유전 및 행동 특성에 대한 모델

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

초파리(Drosophila )는 파리와 인간 질병 유전자 사이의 유전자 염기서열 보존이 높기 때문에 인간 신경 질환 연구를 위한 훌륭한 모델 유기체로 사용된다9. 수많은 강력한 행동 패러다임은 인간의 질병을 요약하는 돌연변이에서 나타나는 표현형을 연구하기 위한 매력적인 모델입니다. 수백 개의 유전자가 자폐 스펙트럼 장애(ASD)와 관련이 있기 때문에 어떤 모델 유기체에도 공통된 ASD 모델이 존재하지 않습니다. 따라서 각 돌연변이에 대해 연구자들은 먼저 즉석에서 ASD와 유사한 표현형을 확립해야 합니다. 이 논문에서 우리는 이러한 평가를 위해 5가지 파리 행동 패러다임을 함께 사용할 것을 제안함으로써 프로세스를 간소화하려고 노력했습니다. 이러한 패러다임은 인간 ASD 환자의 주요하고 일반적으로 발생하는 행동 결함, 즉 사회적 및 의사소통 결함, 반복적 행동의 향상, 습관화 결함을 평가하기 위해 파리에 사용됩니다. 파리 유전자 돌연변이가 이 다섯 가지 패러다임 전부 또는 대부분에서 결함을 보인다면, 이는 ASD와 유사한 시나리오의 강력한 징후일 수 있습니다.
여기에 설명된 대부분의 행동 패러다임은 다양한 연구 질문을 해결하기 위해 이전 문헌에서 여러 번 사용되었습니다. 서로 다른 연구에서 기술의 변형을 찾는 것은 드문 일이 아닙니다. 기술의 조정은 연구 필요성과 해결하려는 특정 질문의 요구에 맞게 이루어졌습니다. 예를 들어, 구애 분석에서, 타고난 구애 행동뿐만 아니라 학습된 구애 행동은 미성숙한 수컷(65), 처녀 암컷(66,67), 미리 교미된 암컷(68,69,70), 동결 살해된 처녀 암컷(65), 또는 심지어 목이 잘린 암컷(19)일 수 있는 테스터 파리에 대해 정량화될 수 있다. 이 논문에 기술된 방법에서는, 수컷 ASD 모델 파리의 구애 패턴을 확인하기 위한 테스터로 야생형 미리 짝짓기된 암컷을 사용하였다. 미리 교미된 암컷의 exual수용성은 처녀 파리(virgin fly) 71보다 상대적으로 낮다. 결과적으로, 남성의 구애 시합 횟수와 지속 시간은 처녀보다 짝을 이룬 암컷에 더 가깝습니다. 마찬가지로, 교미에 대한 잠복기도 처녀 테스터 암컷보다 길며, 이 경우 조기 교미는 구애 지수를 감소시켜 유전자형 간의 효과적인 비교의 범위를 줄입니다. 따라서 미리 짝을 이룬 암컷을 테스터로 사용하면 ASD 파리와 야생형 파리의 구애 행동에 대한 더 나은 비교 분석을 제공합니다. 반면에, 처녀 암컷의 사용은 짝짓기된 암컷이 사용될 때 가려질 수 있는 추가 정보를 제공할 수 있다. 짝짓기 한 암컷의 사용은 또한 수컷의 구애 행동에 영향을 미치고 바꿀 수 있습니다. 요컨대, 연구자는 특정 실험의 필요성에 따라 실험 전략과 세부 사항을 선택하는 것이 좋습니다.
ASD 유전자의 일부 또는 모든 파리 상동체에 이 기술을 적용하기 전에 여기에서 주의해야 합니다. 이러한 모든 행동 패러다임은 특정하고 적은 수의 뉴런에 의해 조절됩니다. 특정 유전자의 발현은 특정 행동 패러다임으로 진행하기 전에 먼저 확립되어야 합니다. 예를 들어, ASD 관련 유전자의 파리 상동체(fly homolog)가 버섯 몸체 뉴런(mushroom body neuron) 또는 글루타마터기성 뉴런(glutamatergic neuron)에서 발현되지 않는 경우, 구애 및 그루밍 행동은 돌연변이에서 영향을 받지 않을 수 있습니다.
연구자들이 주의해야 할 또 다른 점은 결함이 없다고 해서 항상 돌연변이가 아무런 역할도 하지 않는다는 것을 의미하지는 않는다는 점이다. 예를 들어, Fmr1 돌연변이를 이용한 그루밍 행동 실험에서 총 그루밍 시합 수는 돌연변이가 대조군보다 유의하게 낮지 않은 반면, 그루밍 지수 등과 같은 다른 매개변수는 그루밍 행동의 결함을 보여줍니다. 이는 Fmr1 돌연변이에서 각 그루밍 시합이 연장되어 총 시합 지속 시간이 훨씬 더 길음에도 불구하고 총 시합 수의 수가 적어지는 것으로 설명될 수 있습니다. 이는 각 행동 패턴에 대한 여러 매개변수의 정량화의 필요성을 강조합니다. 더욱이, ASD라는 용어는 수백 개의 유전자 중 어느 하나의 변이로 인해 발생하는 광범위한 질병을 포괄하며, 이로 인해 영향을 받는 개인들 사이에 다양한 정도의 침투도를 가진 이질적인 표현형이 생성된다는 점을 기억해야 합니다. 예를 들어, 습관화 결핍은 일부 환자에서 관찰되지만 모든 환자에서 관찰되는 것은 아닙니다. 이 질병의 파리 모델에서도 동일한 현상이 나타날 것으로 예상된다.
공격적 행동을 분석하기 위해 이 연구에서는 돌진, 날개 위협, 몸싸움 등 다양한 유형의 공격적 매개변수를 고려했습니다(그림 1)30. 각 시합은 개별 시합 유형 또는 총 시합 수로 식별되고 계산되어야 합니다. 먼저 수컷 파리의 공격성 패턴에 대해 알아가는 것이 중요한데, 이는59,72에 설명되어 있고 그림 1에 나와 있습니다. 공격적인 시합 횟수를 세는 동안, 단일 공격적인 사건의 시작점과 끝점을 명확하게 식별해야 합니다. 여러 유형의 공격 패턴이 한 번의 시합 내에서 나타날 수 있으며, 시합이 끝날 때까지 나타날 수 있습니다. 공격성 시합은 파리가 2초 동안 공격적인 행동이나 움직임을 보이지 않거나 시합을 멈추고 떠나기 시작할 때 끝난 것으로 간주됩니다.
이러한 행동 패러다임의 대부분은 여러 실험실에서 설명한 여러 변형과 발전을 가지고 있습니다. 각각의 특정 수정 사항은 특정 목적의 요구 사항을 충족하기 위해 만들어졌습니다. 마찬가지로, 자동화된 알고리즘 기반 정량화 또는 분석 기법은 이러한 기법을 수동 오류의 가능성에서 해방시켰습니다. 이 논문에서는 가장 적은 재료 요구 사항으로 가장 기본적인 기술을 입증했으며, 이러한 기술이 최대한 많은 연구자에 의해 쉽게 채택되고 사용될 수 있기를 희망합니다.

자폐 스펙트럼 장애(Autism Spectrum Disorder, ASD)는 이질적인 신경 장애 그룹을 포함합니다. 여기에는 사회적 의사소통 및 사회적 상호 작용의 다맥락적이고 지속적인 결핍과 제한적이고 반복적인 행동 및 활동 패턴과 관심의 존재를 특징으로 하는 다양한 복잡한 신경 발달 장애가 포함됩니다1. 세계보건기구(WHO)에 따르면 전 세계적으로 아동 100명 중 1명이 ASD 진단을 받고 있으며, 남성과 여성의 비율은 4.2입니다2. 이 병은 생후 2년이나 3년째에 뚜렷하게 나타난다. ASD 아동은 사회-정서적 호혜성, 비언어적 의사소통 및 관계 기술에 대한 관심이 부족합니다. 그들은 정형화된 운동 운동, 융통성 없고 의례적인 일상 추종, 제한된 관심사에 대한 강렬한 집중과 같은 반복적인 행동을 보입니다. ASD 아동은 촉각, 후각, 소리, 미각에 대한 반응이 높은 반면, 통증과 온도 반응은 상대적으로 낮습니다1. 이 장애의 침투율은 ASD를 앓고 있는 환자마다 다르기 때문에 변동성이 증가합니다.
현재 ASD의 임상적 진단은 모든 형태의 ASD를 포괄하는 확증적인 바이오마커 기반 또는 일반적인 유전자 검사가 없기 때문에 개인의 행동 평가를 기반으로 합니다3. 유전적 및 신경생리학적 기반을 해독하는 것은 치료 전략을 표적으로 삼는 데 도움이 될 것입니다. 지난 10년 동안 대규모 연구를 통해 ASD 환자에서 삭제되거나 돌연변이가 발생하거나 발현 수준이 변경된 수백 개의 유전자를 확인할 수 있었습니다. 현재 진행 중인 연구는 생쥐나 초파리와 같은 모델 유기체를 사용하여 이러한 후보 유전자의 기여도를 검증하는 데 중점을 두고 있으며, 이러한 유전자를 녹아웃하거나 녹다운시킨 후 ASD와 같은 행동 결함을 검사하고 이상을 유발하는 기저 유전 및 분자 경로를 규명합니다. 인간 염색체 유전자좌 16p11.2에서 복제 수 변이(CNV)를 요약한 마우스 모델은 ASD 행동 결함 중 일부를 보여줍니다 4,5,6. 기형 유발 약물인 발프로산(VPA)에 대한 태아 노출은 인간 ASD 7,8과 유사한 특성을 나타내는 또 다른 마우스 모델입니다. 또한, 유전적 증후군 관련 자폐증을 나타내는 다양한 마우스 모델이 존재하는데, 예를 들어, Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c의 돌연변이에 의한 단일 유전자 증후군 모델과 Cntnap2, Shank, Neurexin 또는 Neuroligin 유전자와 같은 유전자의 돌연변이에 의한 단일 유전자 비증후군 모델5.
초파리(Drosophila melanogaster)는 ASD를 포함한 다양한 인간 질환9의 세포, 분자 및 유전적 기반을 연구하기 위한 또 다른 저명한 모델 유기체이다. 초파리와 인간은 분자, 세포 및 시냅스 수준에서 고도로 보존된 생물학적 과정을 공유합니다. 초파리는 ASD 연구에서 성공적으로 사용되어 왔다10,11,12 ASD와 연결된 유전자를 특성화하고 시냅스 형성, 시냅스 기능 및 가소성, 신경 회로 조립 및 성숙에서 그들의 정확한 역할을 해독하기 위해; ASD 관련 유전자의 파리 상동체는 사회적 및/또는 반복적 행동의 조절에 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. 초파리는 또한 ASD 유전자 및 그 변이체 15,22,23의 스크리닝을 위한 모델로 작용했습니다. 파리에 대한 ASD 연구의 가장 큰 과제는 다른 질병 모델과 달리 단일 ASD 파리 모델이 없다는 것입니다. 돌연변이 또는 특정 ASD 유전자의 파괴의 영향을 이해하기 위해 연구자는 행동 표현형이 ASD 환자의 증상을 충분히 모방하는지 검증한 다음 표현형의 분자 또는 생리학적 토대를 이해해야 합니다.
따라서 ASD와 유사한 표현형을 검출하는 것은 플라이 모델에서 ASD 연구에 매우 중요합니다. 사회적 행동/상호 작용, 의사 소통, 반복적 행동 및 자극에 대한 반응의 결함과 같은 이상을 감지할 수 있는 몇 가지 행동 기술이 수년에 걸쳐 등장했습니다. 또한 이러한 행동 기법의 여러 수정 및 업그레이드는 업스케일링, 분석 자동화, 판독, 정량화 및 비교 방법과 같은 특정 요구 사항에 맞게 여러 실험실에서 이루어졌습니다. 이 비디오 기사에서는 5가지 행동 패러다임의 가장 기본적인 버전을 보여주며, 이를 조합하여 가장 쉬운 방법으로 ASD와 유사한 행동 결과를 감지하는 데 사용할 수 있습니다.
공격성은 생존과 번식에 영향을 미치는 진화적으로 보존된 타고난 행동이다24. 동족에 대한 공격적 행동은 '사회화 동기'25,26 및 '의사소통'27에 의해 영향을 받으며, 둘 다 ASD의 영향을 받은 개인에서 손상됩니다. 공격적인 행동은 초파리(Drosophila)에 잘 설명되어 있으며, 강력한 공격성 분석법(aggressive assay)28,29,30을 통한 정량화(quantifiability)와 잘 이해된 유전적 및 신경생물학적 기반(neurobiological basis)31은 파리 모델에서 ASD 표현형을 평가하기 위한 적합한 행동 패러다임(behavioral paradigm)32을 만든다. 공격성은 사회적 환경으로부터 멀리 떨어진 사회적 고립에 의해 영향을 받으며, 이는 공격성을 강화합니다. 수컷 파리가 며칠 동안 고립되어 있을 때도 동일한 현상이 관찰되었다33,34. 파리의 사교성을 정량화하는 또 다른 행동 분석법은 소셜 스페이스 어세이 (Social Space Assay) (35)로, 이는 작은 파리 그룹에서 가장 가까운 이웃과 파리 사이의 거리를 측정하여 파리 12,21,36,37 및 환경적으로 유도 된 ASD 파리 모델(38)에서 ASD 유전자 ortholog의 역할을 테스트하는 데 완벽하게 적합합니다. 39.
 Drosophila courtship assay는 자폐증 관련 유전자 18,19,21,40을 포함하여 회로 또는 유전자 조작에 따른 사회적 및 의사 소통 기술의 변화를 분석하는 데 자주 사용되는 또 다른 행동 패러다임입니다. ASD 환자에서는 반복적인 행동 패턴이 널리 나타나며, 이는 청소 및 기타 목적을 위해 수행되는 일련의 뚜렷하고 정형화된 행동인 그루밍 행동에 의해 파리에서 재현됩니다. 그것은 파리21,41에서 ASD 유전자 돌연변이의 영향과 화학 물질 38,39에 대한 노출을 분석하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 분석의 여러 발전 및 자동화는 16,41,42,43 이전에 설명되었습니다. 여기에서는 채택하고 정량화하기 쉬운 가장 기본적인 분석 패턴을 시연합니다.
ASD는 일부 환자44,45,46,47,48,49,50, ASD 모델 유기체(51,52)에서 습관화, 학습 및 기억 능력에 영향을 미치며 다양한 후각 행동(50)에서 결함을 유발하는 것으로 알려져 있다. 초파리(Drosophila)의 빛-떨어짐 점프 습관화(Drosophila light-off jump habituation)는 이전에 ASD 유전자를 선별하기 위해 사용되었다23. 습관화는 후각 습관화 분석법(53,54,55)의 간단한 방법으로 분석할 수 있다. ASD 유전자 돌연변이 또는 유전자 녹다운 조건에서 습관화의 결함을 감지하는 데 사용할 수 있는 고전적인 Y-maze-based binary odor-choice assay56을 사용하여 후각 습관화를 유도하고 결과를 분석하는 방법을 설명합니다. 돌연변이(또는 유전자 녹다운) 또는 약리학적 치료가 파리의 행동에 미치는 영향이 ASD와 유사한 표현형에 해당하는지 평가하기 위해 여기에 설명된 이 5가지 분석을 조합하여 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Aggression 경기장 : </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>투명 폴리스티렌 <td></td><td></td> 12cm x 8cm x 2cm<td>로 만든 표준 24 웰 플레이트</td><td>. 단일 웰의 직경 = 18cm. Sigma-aldrich #Z707791; 깊이 = 1cm</td></tr><tr><td>투명 플라스틱 / 아크릴 시트</td><td></td><td></td><td>대안 : 세포 배양 플레이트의 천공 뚜껑</td></tr> <tr><td>Social Space Assay : </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>바인더 클립</td><td></td><td></td><td>19mm</td></tr><tr><td>유리 시트 및 맞춤형 크기의</td><td></td><td></td> 아크릴 시트 <td>두께 = 5mm</td></tr><tr><td><강>구애 분석:</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr>맞춤형 모양의 <tr><td></td> 스레딩 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>퍼스펙스 시트</td>가 있는 너트 및 볼트 <td></td><td></td><td>i) 뚜껑 : 주변 영역에 하나의 로딩 구멍이 있고 중앙에 다른 나사 구멍이있는 맞춤형 원형 투명 퍼스펙스 디스크 (2-3mm 두께, 직경 70mm) (각각 직경 ~ 3mm); ii) 중심에서 등거리에 직경 15mm의 6-8개의 천공이 있는 두 번째 투명하고 두꺼운 방풍 디스크(두께 3-4mm, 직경 70mm); iii) 베이스: 로딩 홀이 없는 경우를 제외하고는 뚜껑과 동일</td></tr><tr><td><강>그루밍 분석:</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>확산 유리로 덮인 LED 패널</td><td></td><td></td><td>10&ndash; 15와트 천장 장착형 LED 패널</td></tr><tr><td>Habituation 및 Y-maze 분석</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Climbing chambers</td><td></td><td></td><td>x2,</td></tr><tr><td>Y-maze를 엔트리 바이알</td><td></td><td></td> Perspex와 연결하기 위한 붕규산 유리 어댑터<td>, 맞춤형, Figure 5A</td></tr><tr><td>Clear 시약 병</td><td></td><td></td><td>Borosil #1500017</td></tr><tr><td>가스 세척 마개</td><td></td><td></td><td>Borosil #1761021</td></tr><tr><td>유리 바이알</td><td></td><td></td><td>OD= 25 mm x 높이= 85 mm; 붕규산 유리</td></tr><tr><td>취취제(에틸 부티레이트)</td><td></td><td></td><td>Merck #E15701</td></tr><tr><td>파라핀 왁스(액체) 라이트</td><td></td><td></td><td>SRL #18211</td></tr><tr><td>롤러 클램프</td><td></td><td></td><td>Polymed #14098</td></tr><tr><td>실리콘 튜브</td><td></td><td></td><td>OD = 0.6 cm, ID = 0.3 cm; 흐름 제어용 롤러 클램프</td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td></td><td></td><td>Hana #HN-648 (흐름 방향이 있는 모든 수족관 펌프 수동 반전)</td></tr><tr><td>Y-미로</td><td></td><td></td><td>붕규산 유리</td></tr><tr><td>Y형 유리관(붕규산 유리)</td><td></td><td></td><td>맞춤 제작, <강한>그림 5A</강한></td></tr><tr><td><강한> 공통 항목:</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>비디오 재생을 위한 모든 소프트웨어(예: VLC 미디어 플레이어)</td><td></td><td></td><td>https://www.videolan.org/vlc/</td></tr><tr><td>비디오 데이터 분석</td><td></td><td></td><td></td>용 컴퓨터</tr><tr><td>플라이 병</td><td></td><td></td><td>OD= 60 mm x 높이 = 140 mm; 유리/폴리프로필렌</td></tr><tr><td>플라이 바이알</td><td></td><td></td><td>OD= 25 mm x 높이 = 85 mm; 붕규산 유리</td></tr><tr><td>그래프 패드 프리즘 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td></tr> <tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>타이머</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>비디오 녹화 기능이 있는 비디오 카메라,</td><td></td><td></td><td>캠코더 또는 휴대폰 카메라를 설정할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Fly 흡인기:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton</td><td></td><td></td><td>흡수제, 오토클레이브</td></tr><tr><td>파라필름</td><td></td><td></td><td>Sigma-aldrich #P7793</td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td></td><td></td><td>200 &마이크로; L 또는 1000 & 마이크로; L, 실리콘 튜브의 외경에 depeding을 선택하십시오</td></tr><tr><td>실리콘 / 고무 튜브</td><td></td><td></td><td>길이 = 30-50cm. 튜브는 무취</td></tr><tr><td><강해야 합니다>플라이 푸드의 구성: </강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>성분(식품 1L의 양)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>한천(8g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 19661(CAS : 9002-18-0)</td></tr><tr><td>옥수수 가루(80g)</td><td></td><td></td><td>유기농, 현지 조달</td></tr><tr><td>D-글루코스(20g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 51758(CAS: 50-99-7)</td></tr><tr><td>프로피온산 (4 g)</td><td></td><td></td> <td>SRL # 43883 (CAS : 79-09-4)</td></tr> <tr><td>자당 (40 g)</td><td></td><td></td> <td>SRL # 90701 (CAS : 57-50-1)</td></tr> <tr><td>Tego (메틸 파라 히드 록시 벤조 에이트) (1.25 g)</td><td></td><td></td> <td>SRL # 60905 (CAS : 5026-62-0)</td></tr> <tr><td>효모 분말 (10 g)</td><td></td><td></td> <td>HIMEDIA # RM027</td></tr><tr><td>Fly lines 본 연구의 실험에 사용 된 : </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>야생형 (Canton S 또는 CS)</td><td></td><td></td><td>BDSC # 64349</td></tr><tr><td>w1118</td><td></td><td></td><td>BDSC # 3605</td></tr><tr><td>w[1118]; fmr1[&델타; 50M]/TM6B, Tb[+]</td><td></td><td></td><td>BDSC # 6930</td></tr><tr><td>w[*]; fmr1[&델타; 113M]/TM6B, Tb[1]</td><td></td><td></td><td>BDSC # 67403</td></tr><tr><td>MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, India)</td><td></td><td></td><td>BDSC # 50742</td></tr><tr><td>LN1-GAL4</td><td></td><td></td><td>NP1227, NP 컨소시엄, 일본</td></tr><tr><td>row-shRNA</td><td></td><td></td><td>BDSC # 25971</td></tr></tbody></table>

자폐 스펙트럼 장애의 초파리 모델에서 행동 평가를 위한 패러다임

Paradigms for Behavioral Assessment in Drosophila Model of Autism Spectrum Disorder

자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 사회적 상호 작용 및 의사 소통 능력의 결핍, 제한적이거나 반복적인 행동 증가, 경우에 따라 학습 장애 및 운동 장애를 포함한 일반적인 행동 증상을 가진 이질적인 신경 발달 장애 그룹을 포함합니다. 초파리(Drosophila )는 수많은 인간 질병을 모델링하는 데 있어 타의 추종을 불허하는 모델 유기체 역할을 해왔습니다. 많은 유전자가 ASD와 관련이 있음에 따라, 초파리는 이 장애와 관련이 있는 것으로 추정되는 유전자를 검사할 수 있는 강력하고 효율적인 방법으로 부상했습니다. 다양한 기능적 역할을 가진 수백 개의 유전자가 ASD와 관련되어 있기 때문에 ASD의 단일 유전적 파리 모델은 실현 불가능합니다. 대신, 개별 유전적 돌연변이, 유전자 녹다운 또는 ASD 관련 유전자의 파리 상동체에 대한 과발현 기반 연구는 이러한 유전자 산물의 기저에 있는 분자 경로에 대한 통찰력을 얻기 위한 일반적인 수단입니다. Drosophila 에서는 특정 행동 구성 요소의 결함을 쉽게 읽을 수 있는 다양한 행동 기술을 사용할 수 있습니다. 파리의 사회적 공간 분석과 공격성 및 구애 분석은 사회적 상호 작용 또는 의사 소통의 결함을 평가하는 데 유용한 것으로 나타났습니다. 파리의 그루밍 행동은 반복적인 행동을 잘 읽을 수 있습니다. 습관화 분석은 파리에서 습관화 학습 능력을 추정하는 데 사용되며, 이는 일부 ASD 환자에서 영향을 받는 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 행동 패러다임의 조합은 파리의 인간 ASD와 유사한 질병 상태를 철저히 평가하는 데 활용될 수 있습니다. Fmr1 돌연변이 파리를 사용하여 인간의 Fragile-X 증후군을 요약하고 파리 뉴런의 POGZ-homolog row knockdown을 사용하여 사회적 간격, 공격성, 구애 행동, 그루밍 행동 및 습관화에서 정량화 가능한 결함을 보여주었습니다. 이러한 행동 패러다임은 파리 모델에서 ASD 및 기타 신경 발달 장애에 대한 연구에 널리 사용될 수 있다는 가정과 함께 가장 간단하고 직접적인 형태로 입증되었습니다.

공격성 분석 파리 ASD 모델로, Fmr1 돌연변이 파리는63,64 번 사용되었습니다. w1118 수컷을 대조군으로 사용하고 Fmr1 트랜스 이형 접합체 Fmr1Δ113M / Fmr1Δ50M57 수컷 파리를 실험 파리로 사용했습니다. 성인 남성은 5일 동안 격리 튜브에 수용되었습니다. 동형형 수컷(동일한 유전자형, 동일한 주거 조건)을 공격성 영역에 도입하고 그들의 행동을 20분 동안 기록했습니다. 20분 동안의 총 공격적인 시합 횟수는 각 유전자형에 대해 계산되었습니다. 20분 동안의 공격적인 시합 횟수는 돌연변이 수컷의 경우 대조군 수컷보다 현저히 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 1E). Fmr1 파리의 이러한 공격성 감소는 다른 파리와의 사회적 상호 작용에 대한 관심이 감소했기 때문일 수 있습니다. 대조적으로, 집단/사회적으로 수용된 Fmr1 돌연변이 수컷 파리는 사회적으로 수용된 w1118 마리의 파리와 유사한 공격성 시합 수를 보였는데(데이터는 표시되지 않음), 이는 아마도 사회적 행동 유도에서 사회적 환경의 긍정적인 역할을 나타낼 수 있습니다.
소셜 공간 분석 사회적 공간 분석은 w1118 및 ASD 모델(Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M) 에서 수행되었습니다. 각 파리에 대해 가장 가까운 이웃까지의 거리를 계산하고 각 유전자형에 대해 10개의 생물학적 복제를 수행했습니다. 돌연변이 파리는 대조군 파리보다 훨씬 더 가까운 이웃 거리를 보여주는데(그림 2D), 이는 다른 파리와 더 큰 거리를 선호하는 것을 나타냅니다.
구애 분석 두 개의 개별 ASD 모델 파리의 타고난 구애 행동을 정량화하기 위해 단일 수용 수컷 파리의 구애 분석을 수행했습니다. 첫째, Fmr1 transheterozygous 파리의 구애 행동을 w1118의 구애 행동과 비교하였다; Fmr1 파리는 교미 시도 횟수가 감소했을 뿐만 아니라 구애 지수가 현저히 낮았다(그림 3E1). 두 번째 실험에서, 인간 POGZ 유전자(매우 흔한 ASD 위험 유전자20)의 Drosophila ortholog인 row는 MB247-GAL4 드라이버 라인을 사용하여 버섯 몸체 뉴런의 row에 대해 짧은 헤어핀 microRNA를 발현함으로써 녹다운되었습니다. 이 row-knockdown ASD 모델 파리는 타고난 구애 패턴의 결함에 대해 테스트되었습니다. 구애 지수와 성교 시도 횟수는 15분 비디오에서 계산되었습니다. 줄 넉다운 파리는 구애 지수와 교미 시도 횟수가 현저히 감소한 것으로 나타났으며(그림 3E2), 이는 암컷에 대한 의사소통에 결함이 있음을 나타냅니다.
그루밍 행동 그루밍 행동은 Drosophila 16,42,43에서 반복적 행동에 대한 판독 값으로 사용됩니다. 그루밍 행동은 Fmr1 트랜스헤테로접합 파리에서 정량화하고 w1118의 그것과 비교하였다. 첫 그루밍에 대한 잠복기는 Fmr1 파리에서 유의하게 감소하는 반면, 평균 그루밍 시합 기간과 그루밍 지수는 Fmr1 파리에서 유의하게 증가하며(그림 4C), 이는 ASD 모델 파리에서 그루밍(또는 반복적) 행동이 향상되었음을 나타냅니다. 대조적으로, 돌연변이 파리의 그루밍 시합 총수는 대조 파리의 횟수에 비해 유의하게 변경되지 않은 것으로 나타났습니다.
후각 습관화 분석 습관화는 많은 수의 자폐증 환자에서 결함이 있는 것으로 밝혀졌으며 Drosophila23에서 동일한 분석법으로 사용할 수 있습니다. 여기에서 LN1-GAL4에 의해 구동되는 후각 국소 인터뉴런의 행 을 녹다운하여 ASD 모델에서 후각 습관화를 테스트했습니다. 혐오스러운 냄새 유발제인 20% 에틸 부티레이트가 이 실험에서 사용되어 이 파리의 습성을 유도했습니다. 그 결과, 3일 동안 에틸 부티레이트에 노출된 후 전형적인 습성을 보이는 야생형 파리와 비교하여( 그림 5E 의 그래프의 마지막 두 막대는 순진한 파리와 습관화된 파리 사이에 유의미한 차이를 보여주지 않음) 줄-넉다운 파리는 3일 동안 에틸 부티레이트에 노출된 후 전형적인 습성을 보이는 야생형 파리와 비교되었습니다(노출된 파리는 순진한 파리에 비해 성능 지수가 크게 감소함). 이는 줄-넉다운 파리가 에틸 부티레이트에 3일 동안 노출된 후에도 습성되지 않고 혐오스러운 냄새 물질에 의해 혐오감을 느낀다는 것을 나타내며, 이러한 ASD 파리가 습성 결핍임을 증명합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig01.jpg"> 그림 1: 공격성 영역과 대표적인 행동 패턴. (A) 파리 진입을 위한 구멍이 뚫린 뚜껑이 있는 24웰 플레이트에 설치된 공격 영역. 삽입 사진: 플라이 먹이가 있는 단일 경기장의 크기. (B) 고립된 수컷 파리 한 마리가 들어 있는 단일 수용 튜브와 수컷과 암컷 파리가 들어 있는 집단 수용 유리병의 사진으로 사회적 환경을 요약합니다. (C) 파리의 구강 흡인 기반 이동을 위한 흡인기. 플라이 진입을 위한 튜브의 측면(플라이 끝)과 입에 삽입될 측면(입 끝)(C1) 및 조립된 플라이 흡인기(C2)를 나타내는 플라이 흡인기(C2)를 조립하는 데 필요한 품목. (D) 대표적인 남성-남성의 공격적 행동 패턴: 접근, 날개 위협, 펜싱, 홀딩, 돌진, 복싱, 몸싸움. (E) Fmr1 돌연변이 수컷 파리는 대조군에 비해 다른 수컷에 대한 공격적인 행동이 적습니다. w1118 (대조군)의 사회적으로 고립된 수컷과 Fmr1 이형접합 파리(Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M)의 공격적인 시합 횟수를 보여주는 상자 그림. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig02.jpg"> 그림 2: 소셜 공간 분석 경기장 설정. (A) 유리판과 아크릴 스페이서의 치수와 배열을 보여주는 다이어그램. (B) 아크릴 스페이서가 유리 조각 사이에 끼워져 바닥에 파리 진입을 위한 작은 틈을 남기는 경기장 구성 요소의 최종 배치. 유리 조각과 스페이서 사이에 만들어진 삼각형 공간은 파리를 위한 SSA 영역이며, 여기서 파리는 2차원으로만 움직일 수 있습니다. (C) 챔버 내부에 파리가 있는 최종 SSA 경기장 설치 사진. 약어: SSA = social space array. (D) ASD 모델(Fmr1 transheterozygous) 파리는 w1118에 비해 사회적 공간 분석에서 서로 더 멀리 떨어져 있음을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig03v2.jpg"> 그림 3: 구애 영역과 대표적인 행동 패턴. 구애 분석 경기장에서 디스크의 (A) 설계 및 (B) 배열을 보여주는 다이어그램. (C) 최종 합의 후의 구혼 경기장 사진. (D) 짝짓기를 한 암컷에 대한 순진한 수컷의 구애 행동 패턴을 보여주는 대표적인 이미지: 쫓기, 방향, 날개 깜박임, 핥기, 교미 시도 및 교미. (E) 두 가지 ASD 모델에서 구애 지수와 교미 시도 횟수를 보여주는 플롯: (E1) w1118 대조군에 비해 구애 지수와 교미 시도가 현저히 감소한 Fmr1 돌연변이 파리. (2회) row knockdown flies는 row-shRNA가 버섯 body 뉴런(MB247-GAL4)에서 발현되는 또 다른 ASD 모델로 사용되었습니다. 구애 행동의 현저한 감소는 Row Knockdown에서 관찰되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig03largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig04.jpg"> 그림 4: 경기장 설정 및 그루밍 행동의 대표적인 행동 패턴. (A) 디스크 또는 바퀴 모양의 경기장( 그림 3과 동일한 구애 경기장)은 아래에서 균일한 조명을 위해 디퓨저가 있는 LED 패널에 설치되었으며 비디오는 위에서 캡처되었습니다. 이것은 그루밍 중 부속지의 미세한 움직임을 식별하는 데 필요한 더 높은 대비를 보장합니다. (B) 다 자란 수컷 파리에서 관찰된 그루밍 행동 패턴의 사진. T1 =1 쌍 의 다리, T2 =2 쌍 의 다리, T3 = 세 번째 다리 쌍. 직관적 인 축약 명명법은 B의 그루밍 패턴에 사용됩니다 : T1-head = 첫 번째 다리로 머리를 문지릅니다. T1-T1 = 첫 번째 다리 쌍을 함께 문지른 식입니다. 약어: LED = 발광 다이오드. (C) Fmr1 trans-heterozygous flies에서 수행된 그루밍 분석 결과를 w1118과 비교한 그래프. Fmr1 돌연변이 파리는 대조군에 비해 그루밍이 일찍 시작되었음을 나타내는 첫 번째 그루밍 시합에서 현저히 감소된 대기 시간을 보여주었습니다. 또한, Fmr1 돌연변이에서 평균 그루밍 시합 기간과 그루밍 지수가 유의하게 증가했는데, 이는 ASD 모델 파리에서 반복적 행동이 향상되었음을 나타냅니다. 대조적으로, 그루밍 시합의 총 횟수는 대조군에 비해 돌연변이 파리에서 크게 변경되지 않았습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig05.jpg"> 그림 5: 후각 습관화를 위한 유도 및 분석 설정 및 분석 후 대표 결과. (A) 이진 냄새 선택 분석 설정의 구성 요소: (A1) Y-미로, (A2) 어댑터, (A3) 이 둘의 배열, (A4) Y-미로 암의 상단에 부착하기 위한 한 쌍의 수집 튜브, (A5) Y-미로로 넘어가기 전에 공기가 거품을 일으키는 냄새 용액 또는 물을 보관하기 위한 유리병과 유리관. (B) 후각 습관화 유도를 위한 플라이 푸드 병 설정; 만화 다이어그램 (B1)은 냄새 물질이 함유 된 마이크로 프리지 튜브가 병 내부의 중간에 구리선에 매달려 있음을 보여줍니다. (B2) 마지막으로, 병의 입구는 면으로 덮여 있고 갈색 종이 봉투로 밀봉되어 있습니다. (C) Y-미로 설정의 전체 배치 사진. (D) 실험 종료 후 채취 챔버에서 파리의 분포를 보여주는 사진. (디1) 순진한 파리(무취 파라핀에만 노출됨, 대조군)는 혐오스러운 냄새 물질(이 연구에서 습관화 유도를 위해 사용된 20% 에틸 부티레이트)에 대한 혐오감을 보이고 규칙적인 공기로 채워진 Y-미로의 팔을 선택하는 반면, (D2) 노출된(습관화된) 파리는 양쪽 팔에 고르게 분포합니다. 약어: ID = 내경. (E) row-knockdown 파리의 후각 습관화 분석 결과는 습관화 결함을 보였다. 야생형(Canton S) 파리는 에틸 부티레이트에 3일 노출된 후 순진한 파리에 비해 성능 지수가 현저히 감소한 것으로 나타났으며, 이는 습성을 나타냅니다. LN1-GAL4 x row-shRNA 파리의 자손을 3일 동안 노출시켰을 때, 성능 지수는 naive flys와 유의하게 다르지 않은 것으로 확인되었습니다. 이는 이 줄무늬 파리가 냄새에 3일 동안 노출되었을 때 습관화되지 않았다는 것을 보여주며, 인간의 ASD와 유사한 증상을 요약합니다. 약어: ASD = 자폐 스펙트럼 장애; shRNA = 짧은 헤어핀 RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 사회적 및 의사소통 행동의 장애 및 반복적 행동의 출현과 관련이 있습니다. 초파리 모델에서 ASD 유전자와 행동 결핍 사이의 상관 관계를 연구하기 위해 이 논문에서는 사회적 간격, 공격성, 구애, 그루밍 및 습관화 행동을 분석하기 위한 5가지 행동 패러다임을 설명합니다.

Autism Spectrum Disorder (ASD) encompasses a heterogeneous group of neurodevelopmental disorders with common behavioral symptoms including deficits in ...

자폐 스펙트럼 장애는 아이들에게 영향을 미쳐 의사 소통, 사회적 행동 및 반복 행동 강화로 이어집니다. 초파리(Drosophila)는 근본적인 분자 경로를 해독하기 위한 자폐증 연구에서 점점 더 인기 있는 모델입니다. 우리는 파리 자폐증 모델의 행동 특성화를 위한 일련의 표준 기술을 설명합니다.파리의 자폐 스펙트럼 장애의 분자적 토대를 해독하기 위해서는 파리의 행동 징후가 정확하게 규명되어야 합니다. Drosophila melanogaster에서 자폐증의 인간 행동 특성을 정량화하는 것은 상당히 어려운 작업입니다. 이 장애의 모든 행동 이상을 다루는 파리의 단일 행동 패러다임은 없습니다.우리는 Drosophila에서 잘 확립 된 5 가지 행동 패러다임, 즉 공격성 분석, 사회적 공간 분석, 털 모양, 그루밍 및 습관화 분석을 설명했습니다. 이 모든 것은 ASD 플라이 모델에서 의사 소통 행동, 반복 행동 및 사회적 행동의 장애 수준을 특성화하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이 다섯 가지 기술을 최소한의 파리 연구 시설을 갖춘 모든 실험실에서 쉽게 채택하고 자폐 스펙트럼 장애의 비행 모델 실험을 수행할 수 있도록 가장 간단한 형태로 설명했으며 이 질병에 대한 우리의 이해를 발전시키는 데 기여했습니다.

paradigms-for-behavioral-assessment-drosophila-model-autism-spectrum

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기에서는 스트레스를 받는 개인의 회피를 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 패러다임은 강력하면서도 사용자 친화적이며 Drosophila melanogaster의 한 종류의 사회적 상호 작용에 대한 유전자와 환경의 영향을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

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고차원적 제한, 반복적 행동(RRB)은 영향을 받는 개인의 삶을 방해합니다.  이러한 행동은 설치류에서 모델링하기 어렵기 때문에 RRB에 대한 잠재적 치료법이나 개입에 대한 기본적인 생물 의학 연구를 어렵게 만듭니다.  여기에서는 새로운 물체 탐사를 마우스의 고차 RRB에 대한 잠재적 분석으로 설명합니다.

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