Name: 역번역 뇌 연구를 위한 인간 혈액 유도 미세아교세포 유사 세포 엔지니어링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 배우세요 인간 혈액 유도 미세아교세포 유사 세포 기술을 활용한 뇌 염증 평가 방법을. 이 모델은 신경정신 질환의 병태생리 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 다음과 같은 과학 연구 보조금(Grants-in-Aid for Scientific Research)의 지원을 부분적으로 받았습니다: (1) 일본 과학 진흥 협회(KAKENHI; JP18H04042, JP19K21591, JP20H01773 및 JP22H00494에서 TAK로, JP22H03000에서 M.O.로); (2) 일본의료연구개발기구(AMED; JP21wm0425010 - TAK, JP22dk0207065 - M.O.) (3) 일본 과학 기술 기구 CREST (JPMJCR22N5 to TAK). 연구비 지원 기관은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 어떠한 역할도 맡지 않았다. 영어 편집을 담당해 주신 에디티지(www.editage.jp)에 감사드립니다.

연구 프로토콜은 규슈 대학 윤리 위원회의 승인을 받았으며 헬싱키 선언의 모든 조항을 준수했습니다. 건강한 지원자와 환자를 포함한 모든 참가자로부터 혈액을 분석하고 데이터를 게시하기 위해 서면 동의서를 받았습니다. 재료 및 장비는 재료 표에 나열되어 있으며 용액의 구성은 표 1에 자세히 설명되어 있습니다.
1. 실험을 위한 배지 및 완충액 준비
<ol><li>RPMI-1640에 10% 열불활성화 소 태아 혈청(56°C, 30분) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충하여 분리 배지를 준비합니다.</li>
	<li>염기성 완충액에 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 원액을 보충하여 분리 완충액을 준비하고 여과(0.22μm)를 통해 멸균합니다.</li>
</ol>2. 전혈에서 단핵 세포의 분리
<ol><li>15mL의 밀도 그래디언트 매체를 50mL 밀도 그래디언트 원심분리 튜브에 옮기고 20°C에서 1분 동안 1,000× g 으로 원심분리합니다. 참고: 50mL 밀도 구배 원심분리 튜브당 15mL의 혈액을 분리합니다. 혈액량이 많을 때는 튜브의 수를 늘립니다.</li>
	<li>헤파린 튜브에 수집된 혈액을 반전으로 균질화하고 화재 멸균 핀셋으로 채혈 튜브의 뚜껑을 제거합니다.</li>
	<li>밀도 구배 원심분리 튜브의 밀도 구배 배지에 동일한 부피(10-15mL)의 혈액을 분주합니다.</li>
	<li>원심분리기의 감속 수준을 1단계 중 4단계로 설정하고 실온(RT)에서 1,000 ×g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 알림: 이 감속 속도에서 180× g (1,000rpm)의 회전 속도가 3분 내에 정지합니다.</li>
	<li>50mL 밀도 구배 원심분리 튜브와 동일한 수의 50mL 원심분리기 튜브를 준비하고 각 튜브에 10mL의 PBS(-)를 채웁니다.</li>
	<li>원심분리 후 버피 코트에서 약 1cm 위까지 플라즈마의 최상층을 제거합니다. 알림: 흡입 피펫을 튜브에 수직으로 삽입하고 액체 표면의 중심에서 조심스럽게 흡입합니다. 버피 코트를 방해하지 않도록 과도하게 흡입하지 마십시오.</li>
	<li>50mL 밀도 구배 원심분리 튜브에 남아 있는 모든 상층액을 10mL의 PBS(-)가 포함된 원심분리 튜브로 디캔팅합니다.</li>
	<li>원심분리기의 감속 수준을 3단계 중 4단계로 재설정하고 RT에서 250× g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 이 단계에서 50mL 원심분리기 튜브 1개와 15mL 원심분리기 튜브 2개와 100μm 세포 여과기를 준비합니다.</li>
	<li>원심분리 후 원심분리기의 온도를 4°C로 설정합니다. 원심분리기 튜브 바닥에 빨간색 둘레가 있는 흰색 펠릿을 검색합니다. 흡인으로 상층액을 제거하고 두드려 펠릿을 부드럽게 풉니다.</li>
	<li>화염 멸균 핀셋을 사용하여 50mL 코니컬 튜브에 100μm 세포 여과기를 배치합니다.</li>
	<li>13mL의 분리 배지를 원심분리 튜브 중 하나에 통합하고 내벽을 세척하여 세포를 제대로 수집합니다. 셀 현탁액을 가져와서 나머지 원심분리 튜브를 연속적으로 세척합니다. 모든 튜브에서 세포를 수집한 후 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과하여 50mL 원뿔형 튜브로 넣습니다. 알림: 분리 매체는 분리 프로세스 전반에 걸쳐 냉각되어야 합니다(단계 2.11-2.16).</li>
	<li>2.11단계에서 설명한 대로 각 튜브를 13mL의 분리 매체로 다시 세척합니다. 총 26mL의 세포 현탁액을 수집합니다.</li>
	<li>두 개의 15mL 코니컬 튜브에 동일한 양을 분주하고, 세포를 열거하고, 2.16단계에서 격리 완충액의 적절한 농도(총 세포10,7 개당 완충액 60μL)를 계산합니다. 참고: 15mL 원뿔형 튜브는 2.16단계에서 피펫팅할 때 액체 부피가 작고 액체 거품이 쉽게 발생하기 때문에 작업하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>250× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>원심분리하는 동안 마그네틱 스탠드(특히 컬럼과 접촉하는 부분)를 70% 에탄올로 철저히 소독하고 벤치에 올려 자연 건조시킵니다. 절연 버퍼를 얼음 위에 유지하십시오.</li>
	<li>흡인으로 상층액을 제거하고(이 단계에서 적혈구가 존재하기 때문에 ~1mm 두께의 빨간색 펠릿을 찾으십시오), 적절한 양의 분리 완충액을 추가한 다음 ~20x 피펫팅하여 펠릿을 부드럽게 풉니다.</li>
</ol>3. CD11b 마이크로비드를 이용한 단핵구 분리
<ol><li>적용 전 10초 동안 Vortex human FcR 차단 시약. 필요한 양의 시약(총 세포 10,7개당 20μL의 FcR 차단 시약)을 통합하고 4°C의 챔버에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>적용하기 전에 CD11b 마이크로비즈를 10초 동안 소용돌이시킵니다. 필요한 양의 시약(총 7 개 세포당 20μL의 CD11b 마이크로비드)을 넣고 4°C 챔버에서 20분 동안 배양하면서 5분마다 손으로 교반합니다.</li>
	<li>배양 후 10mL의 분리 완충액을 추가하고 부드러운 피펫팅으로 현탁시킨 다음 300× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>원심분리하는 동안 마그네틱 컬럼을 마그네틱 스탠드에 놓고 3mL의 분리 버퍼로 헹굽니다. 알림: 기둥의 자기 부분을 만지지 말고 기둥을 올바르게 배치하십시오. 기둥에 기포가 들어가면 피펫으로 제거하십시오. 격리 버퍼는 분리 프로세스 전반에 걸쳐 냉각되어야 합니다(단계 3.4-3.9).</li>
	<li>흡인으로 원심분리 후 상층액을 제거하고, 1mL의 분리 완충액을 주입하고, 피펫팅으로 부드럽게 혼합한 다음 현탁액을 컬럼에 적용합니다.</li>
	<li>컬럼 리저버가 비워질 때마다 3mL의 분리 완충액을 추가하여 컬럼을 3번 세척합니다.</li>
	<li>자기 부분을 건드리지 않고 15mL 원뿔형 튜브에 컬럼을 놓습니다. 5mL의 분리 완충액을 컬럼에 통합하고 플런저를 튜브에 삽입하여 컬럼을 통해 액체를 밀어냅니다.</li>
	<li>튜브에 수집된 셀 현탁액을 300× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 흡인하고 세포를 분리 배지에 재현탁시킵니다. 5단계에서 계산된 셀 수의 ~10~2.13%가 복구되므로 셀 수에 따라 현탁액을 조정합니다. 알림: 절연 매체는 RT에서 사용해야 하며 4°C의 급격한 온도 변화를 피하기 위해 가열하지 않아야 합니다.</li>
	<li>세포를 열거하고 500μL의 세포 현탁액을 40 × 104 cells/mL의 농도로 24웰 플레이트의 각 웰에 분주하고 밤새 배양합니다. 알림: 셀 현탁액은 다른 플레이트에 필요한 조정된 파종 부피에 따라 적절하게 피펫팅해야 합니다. 예를 들어, 12웰 플레이트의 웰 1개에 대해 1mL, 8웰 챔버 슬라이드의 웰 1개에 대해 250μL입니다.</li>
	<li>마지막으로, 시설에서 정한 감염성 폐기물 처리 정책에 따라 오염된 장비를 폐기하거나 소독합니다.</li>
</ol>4. 단핵구에서 iMG 세포 유도
<ol><li>1% 항생제-항진균 용액, 10ng/mL 재조합 인간 GM-CSF 및 100ng/mL 재조합 인간 IL-34를 기저 유도 배지에 보충하여 유도 배지를 준비합니다.</li>
	<li>전날의 파종에서 분리 매체를 유도 매체로 교체합니다. 플레이트를 앞으로 기울이고 파스퇴르 피펫으로 웰 바닥의 앞쪽 가장자리에서 고갈된 매체를 즉시 흡입합니다. 한 번에 최대 1개의 플레이트(= 24웰)의 비율로 매체를 교체하고 즉시 500μL의 유도 매체를 부드럽게 통합합니다. 참고: 이 단계에서는 부착된 단핵구를 선택해야 합니다.</li>
	<li>유도를 완료하기 위해 14일 동안 세포를 배양합니다.</li>
	<li>14일 후에 배지를 500μL의 유도 매체로 다시 교체합니다. 그 후, 세포의 유도 후 유지 관리를 위해 유도 매체를 매주 500μL의 새로운 유도 매체로 교체합니다.</li>
</ol>5. 면역세포화학(Immunocytochemistry)
<ol><li>8단계에서 세포로 파종된 3.10웰 챔버 슬라이드에서 배지를 흡인으로 제거하고 PBS(-)로 헹굽니다.</li>
	<li>4% 파라포름알데히드로 RT에서 20분 동안 세포를 고정합니다.</li>
	<li>정착 시약을 제거하고 PBS(-)로 3 x 5분 동안 세포를 헹굽니다.</li>
	<li>RT에서 0.1% Triton X-100을 포함하는 PBS(-)로 세포를 투과시킵니다.</li>
	<li>투과된 세포를 RT에서 1시간 동안 차단 용액(3% BSA/PBS(-))으로 배양합니다.</li>
	<li>4 °C에서 1 차 항체 (Table of Materials)로 세포를 밤새 배양합니다. 참고: 모든 항체는 차단 용액에 희석됩니다.</li>
	<li>PBS(-)로 3 x 5분 동안 세포를 각각 5분 동안 헹굽니다.</li>
	<li>헹굼 된 세포를 RT (Table of Materials)에서 1 시간 동안 적절한 형광 태그 된 2 차 항체로 배양합니다.</li>
	<li>PBS(-)로 세포를 3 x 5분 동안 헹구어 2차 항체를 제거합니다.</li>
	<li>PBS(-)로 희석한 DAPI(1:10,000) 용액으로 RT에서 5분 동안 세포를 배양합니다.</li>
	<li>PBS (-)로 3 x 5 분 동안 세포를 헹굽니다.</li>
	<li>장착 매체를 사용하여 웰을 장착하고 형광 현미경으로 세포를 시각화합니다.</li>
</ol>

인간의 뇌 질환을 연구하기 위한 혈액 유도 미세아교세포 유사 세포 개발

<ol><li>Steiner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+aspects+in+the+neurobiology+of+suicide%3A+elevated+microglial+density+in+schizophrenia+and+depression+is+associated+with+suicide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Psychiatr+Res%22%5BJournal%5D)">Immunological aspects in the neurobiology of suicide: elevated microglial density in schizophrenia and depression is associated with suicide.</a> J Psychiatr Res. 42 (2), 151-157 (2008).</li>
<li>Setiawan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+translocator+protein+total+distribution+volume+with+duration+of+untreated+major+depressive+disorder%3A+a+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Association of translocator protein total distribution volume with duration of untreated major depressive disorder: a cross-sectional study.</a> Lancet Psychiatry. 5 (4), 339-347 (2018).</li>
<li>Holmes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+translocator+protein+in+anterior+cingulate+in+major+depression+and+a+role+for+inflammation+in+suicidal+thinking%3A+a+positron+emission+tomography+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Elevated translocator protein in anterior cingulate in major depression and a role for inflammation in suicidal thinking: a positron emission tomography study.</a> Biol Psychiatry. 83 (1), 61-69 (2018).</li>
<li>Meyer, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+in+psychiatric+disorders%3A+PET+imaging+and+promising+new+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation in psychiatric disorders: PET imaging and promising new targets.</a> Lancet Psychiatry. 7 (12), 1064-1074 (2020).</li>
<li>Ohgidani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+induction+of+ramified+microglia-like+cells+from+human+monocytes%3A+dynamic+microglial+dysfunction+in+Nasu-Hakola+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease.</a> Sci Rep. 4, 4957(2014).</li>
<li>Method of producing microglial cells. France patent EP. , 3 092 305 B1 (2023).</li>
<li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li>
<li>Mattis, V. B., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+a+new+revolution+for+clinical+neurology%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: a new revolution for clinical neurology.</a> Lancet Neurol. 10 (4), 383-394 (2011).</li>
<li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).</li>
<li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10343-10348 (2011).</li>
<li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-34+is+a+tissue-restricted+ligand+of+CSF1R+required+for+the+development+of+Langerhans+cells+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia.</a> Nat Immunol. 13 (8), 753-760 (2012).</li>
<li>Aloisi, F., De Simone, R., Columba-Cabezas, S., Penna, G., Adorini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+adult+mouse+resting+microglia+into+an+APC+is+promoted+by+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+and+interaction+with+Th1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of adult mouse resting microglia into an APC is promoted by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interaction with Th1 cells.</a> J Immunol. 164 (4), 1705-1712 (2000).</li>
<li>Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+colony+stimulation+factor-1+receptor+results+in+loss+of+microglia%2C+disrupted+brain+development+and+olfactory+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits.</a> PLoS One. 6 (10), e26317(2011).</li>
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저자는 밝힐 것이 없습니다.

iMG 세포를 이용한 분석 기법은 강력한 역번역 연구 도구로 작용할 수 있다 5,6. 충분한 양의 인간 iMG 세포를 생성하기 위해 실험자는 특정 문제를 고려하여 연구를 설계해야 합니다. 인간에서 추출한 혈액 샘플은 매우 민감합니다. 결과적으로, 얻어진 샘플은 신속한 처리와 오염을 방지하기 위한 세심한 취급을 보증합니다. 특히, 혈액 샘플은 채취 후 즉시 분리해야 하며 장기간 방치해서는 안 됩니다. 실험은 일반적으로 타당성을 확인하기 위해 혈액 채취 후 3시간 이내에 시작됩니다. 그러나 혈액 샘플을 4°C에서 3시간 이상 보관하고 분리 프로토콜을 시작하기 전에 실온으로 가져올 수 있습니다.
안정적인 결과를 보장하기 위해 배양 배지와 같은 시약은 밀봉 해제 후 한 달 이내에 사용하고 만료 시 폐기하는 것이 좋습니다. 밀도 구배 원심분리를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포를 분리할 때 특정 검체에서 세포 응집이 관찰될 수 있습니다. 이러한 경우 응집을 방지하기 위해 전혈 샘플을 PBS(-)로 희석해야 합니다. 미세아교세포로의 분화가 유도되는 동안, 세포의 불필요한 자극을 피하기 위해 배양 배지를 14일 동안 교체하지 않습니다. 분화 유도가 완료된 후 배지를 새로운 배지로 교체하면 약화된 세포가 복원되고 한동안 생존력을 유지할 수 있습니다.
이 연구에서 확립된 iMG 기법은 한계가 있습니다. 실험적으로 유도된 "미세아교세포(microglia-like cells)"는 인간 뇌에 있는 실제 미세아교세포(microglial cell)와 비슷하지만 완전히 동일하지는 않습니다. 또한, 선행 연구는 인간 단핵구 유래 미세아교세포(microglia-like cells)의 유도를 위한 방법론을 문서화했으며, 다른 연구 그룹은 원래의 iMG 방법에 따라 고유한 프로토콜과 이름을 제안했다28. 예를 들어, 특정 프로토콜은 M-CSF 29,30,31,32 또는 TGF-β 33을 사용하며, 이는 iPSC 유래 미세아교세포 배양 또는 Geltrex24,34와 같은 코팅에서 미세아교세포와 유사한 표현형을 촉진하는 것으로 보고되었습니다. 이러한 인자는 미세아교세포(microglia-like cell)를 유도하는 데 효과적일 수 있습니다.
기존의 iMG 기술은 코팅이 없는 단 2개의 사이토카인으로 간단하고 재현이 용이한 프로토콜로 인해 인간의 혈액을 이용한 다양한 역번역 실험이 가능하다는 장점이 있습니다. 반대로, 기술의 발전은 많은 제품의 개발을 촉진했습니다. 자기 분리 방법에는 당사의 프로토콜과 유사한 컬럼 기반 포지티브 선택(column-based positive selection)과 네거티브 선택(negative selection) 및 컬럼 프리(column-free) 분석법이 포함됩니다. 더욱이, 자기 분리 대신에, 플라스틱 접착을 사용하는 분리의 대안적인 방법이 고려될 수 있다. 컬럼 기반 양성 선택은 순도를 보장하지만 이 기술은 시간이 많이 걸리고 마그네틱 비드에 의한 자극은 세포에 상당한 영향을 미칩니다35. 반대로, negative selection 및 plastic adhesion은 세포에 덜 해로울 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 접근 방식은 덜 순수할 수있습니다 35,36. 향후 다른 프로토콜에 따라 추가 수정이 필요할 수 있습니다.
앞서 언급한 연구 결과는 이 iMG 기술의 주요 장점이 짧은 기간, 비용 효율적인 방법론 및 고처리량 연구를 위해 많은 수의 시료를 처리할 수 있는 능력임을 입증합니다. 따라서 이 기술은 인간 샘플에서 지식을 얻은 다음 다른 동물 모델을 사용하여 추가 검증 연구를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, iMG 기법을 적용하여 세포 및 동물 모델에 대해 수행된 조사에서 얻은 결과가 도움이 될 수 있습니다. 이러한 방식으로, 당사의 iMG 기법은 병상에서 벤치로, 벤치에서 침상으로 이어지는 양방향 중개 연구에 적용할 수 있습니다.

최근 몇 년 동안 뇌 염증은 다양한 뇌 및 신경 정신 질환의 병태 생리학에서 중추적인 역할을 하는 것으로 제안되었습니다. 미세아교세포는 인간의 사후 뇌 분석 및 양전자 방출 단층촬영(PET) 기반 생체 영상 기법 1,2,3,4에 의해 주요 면역조절 세포로 각광받고 있습니다. 사후 뇌 및 PET 영상 분석에서 중요한 결과가 밝혀졌습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 접근 방식은 뇌에서 인간 미세아교세포의 역동적인 분자 활동을 전체적으로 포착하는 측면에서 비효율적입니다. 따라서 분자 및 세포 수준에서 인간의 미세아교세포 기능과 기능 장애를 종합적으로 평가할 수 있는 새로운 전략이 필요합니다.
2014년에 우리는 원래 직접 유도된 미세아교세포(iMG) 세포 5,6을 생산하는 새로운 기술을 설계했으며, 2016년에 인간 유도 만능줄기세포(iPSC) 유래 미세아교세포 유사 세포가 처음 발표되기 전이었습니다7. 단 2주 만에 사이토카인, 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF) 및 인터루킨 34(IL-34)를 최적화하여 인간 말초 혈액 단핵구를 iMG 세포로 전환하는 데 성공했습니다. 우리가 이 기술을 개발했을 때, iPS 세포 또는 섬유아세포로부터 신경 세포를 유도하는 혁신적인 재프로그래밍 방법이 전 세계적으로 막 널리 보급되기 시작했습니다 8,9,10,11. 그러나, 당시에는 iPS 유래 소교세포를 유도하는 방법이 아직 보고되지 않았으며, 인간 체세포 유래 소교세포 모델의 생성이 요구되고 있었다. 대식세포 집락 자극 인자인 GM-CSF 및 IL-34와 같은 사이토카인이 미세아교세포12,13,14,15의 발달 및 유지에 필요한 것으로 보고되었기 때문에 이러한 사이토카인의 조합을 직접 적용하여 혈액 단핵구에서 미세아교세포 모델을 생성할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 마지막으로 GM-CSF와 IL-345를 결합하여 단핵구에서 유래한 미세아교세포 모델을 개발하는 데 성공했다. 또한, 이러한 사이토카인 조합 중 일부는 iPS 세포(7,16)로부터 미세아교세포를 유도하기 위해 사용되며, 미세아교세포 특성을 획득하는데 중요한 인자로 가정된다.
iPSC 방법과 달리 iMG 세포는 유전자 변형이 필요하지 않으며 간단한 화학적 유도로 매우 짧은 시간에 생성할 수 있어 시간과 재정적 비용이 절감됩니다. 또한 iMG 세포는 유전자 재프로그래밍이 필요하지 않기 때문에 iMG 세포는 인간 미세아교세포의 특성뿐만 아니라 상태도 평가할 수 있는 강력한 대리 세포라고 생각합니다. 2014년 iMG 기술에 대한 초기 논문에서 iMG 세포가 단핵구 및 대식세포와 구별될 수 있는 인간 미세아교세포의 표현형을 나타낸다는 것을 확인했습니다. 예를 들어, iMG 세포는 막관통 단백질 119(TMEM 119) 및 퓨린성 수용체 P2RY12 5,17을 포함한 단핵구 및 전형적인 미세아교세포 마커보다 CX3C 케모카인 수용체 1(CX3CR1) 및 C-C 케모카인 수용체 2형(CCR2)의 과발현 비율을 나타냈습니다. 최근에는 뇌 수술을 받은 동일한 환자에서 말초 혈액 유래 iMG 세포가 잘 알려진 미세아교세포 마커의 유전자 발현 프로필에서 뇌 미세아교세포와 유사하다는 것을 확인했습니다18. iMG 세포는 식세포작용(phagocytosis) 및 사이토카인(cytokine) 생성과 같은 분자 수준의 동적 기능을 분석할 수 있으며, 사후 뇌 연구 및 PET 연구의 단점을 보완할 수 있을 것으로 기대됩니다.
우리는 Nasu-Hakola병 5, 섬유 근육통19, 양극성 장애20,21 또는 Moyamoya병 22로 진단된 환자에서 미세아교세포와 관련된 이전에 알려지지 않은 동적 병태생리학적 메커니즘을 발견했습니다. 더욱이, 우리의 독창적인 방법론에 기초하여, 다양한 실험실에서 iMG 세포(특정 실험실은 이러한 세포에 대한 대체 이름을 지정함)를 중요한 역번역 연구 도구로 사용하였다(23,24,25,26,27). Sellgren et al.은 우리의 권고에 따라 iMG 세포를 성공적으로 생성하고 마이크로어레이 분석을 수행하여 이러한 세포가 인간의 뇌 미세아교세포(23)와 매우 유사하다는 것을 밝혔습니다. 최근에는 RNA 염기서열 분석18을 사용하여 인간 iMG 세포와 뇌 원발성 미세아교세포의 유사성을 확인했습니다.
이 연구는 신경 정신 질환에 초점을 맞춘 역번역 연구를 촉진하기 위해 인간 말초 혈액에서 iMG 세포를 생성하는 방법론을 문서화하는 것을 목표로 했습니다. 이 기술은 유전자 전달 장치나 숙련된 인력이 부족한 열악한 실험실에서도 짧은 기간 내에 미세아교세포 모델을 쉽게 생성할 수 있는 합리적인 분석 도구로서의 잠재력을 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>0.1% 트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>30-5140-5</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09154-14</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제(100x)</td><td>gibco</td><td>15240-062</td><td>"항생제-항진균제 용액"으로 설명됨</td></tr><tr><td>autoMACS 헹굼 용액</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>"기본 버퍼 용액"으로 설명되며 "절연 버퍼"에 사용됩니다</td></tr><tr><td>. CD11b MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130&ndash; 049-601</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 솔루션</td><td>DOJINDO</td><td>28718-90-3</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14249-24</td><td>"PBS (&마이너스;)"</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>biowest</td><td>S1760-500</td><td></td></tr><tr><td>인간 FcR 차단 시약</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130&ndash; 059-901</td><td></td></tr><tr><td>Leucosep</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227290</td>은 <td>"밀도 구배 원심분리 튜브"로 설명</td></tr>됨<tr><td>MACS LS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td>은 <td>"자기 기둥"으로 설명</td></tr>됨<tr><td>MACS BSA 스톡 솔루션</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td>은 <td>"소 혈청 알부민(BSA) 스톡 솔루션"으로 설명됨</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>은 "자기 스탠드"로 설명됩니다.</td></tr> <tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253&ndash; 84</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td>는 <td>"마운팅 미디어"로 설명됨</td></tr><tr><td>재조합 인간 GM-CSF</td><td>R & D 시스템</td><td>215-GM</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-34</td><td>R& D Systems</td><td>5265-IL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61870036</td><td>"기초 유도 매체"로 설명됨</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Nacalai Tesque</td><td>30264-56</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-P2RY12 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA014518</td><td>1차 항체, 토끼, 1:100</td></tr><tr><td>항TMEM119 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA051870</td><td>1차 항체, 토끼, 1:100</td></tr><tr><td>염소 항토끼 IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 568</td><td>invitrogen</td><td>A-11011</td><td>2차 항체, 토끼, 1:1000</td></tr></tbody></table>

역번역 뇌 연구를 위한 인간 혈액 유도 미세아교세포 유사 세포 엔지니어링

Engineering of Human Blood-Induced Microglia-like Cells for Reverse-Translational Brain Research

동물 모델을 사용한 최근 연구는 다양한 신경정신과 및 신체 질환에서 중요한 면역학적 조절인자로서 미세아교세포의 중요성을 강조했습니다. 사후 뇌 분석 및 양전자 방출 단층 촬영 영상은 인간 환자의 미세아교세포 활성화를 평가하는 대표적인 연구 방법입니다. 이 연구 결과는 다양한 신경 정신 질환과 만성 통증을 나타내는 환자의 뇌에서 미세아교세포의 활성화를 밝혔습니다. 그럼에도 불구하고, 앞서 언급한 기법은 단지 미세아교세포 활성화의 제한된 측면의 평가를 용이하게 할 뿐입니다. 
뇌 생검과 유도만능줄기세포 기법 대신, 초기에는 갓 유래한 인간 말초혈액 단핵구에서 직접 유도된 미세아교세포(iMG)를 생성하여 과립구-대식세포 집락 자극 인자와 인터루킨 34를 2주 동안 보충하는 기술을 고안했습니다. 이러한 iMG 세포는 세포 수준 스트레스 자극 후 식세포 용량 및 사이토카인 방출에 관한 동적 형태학적 및 분자 수준 분석을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 최근에는 인간 iMG 세포와 뇌 원발성 미세아교세포의 유사성을 확인하기 위해 종합적인 전사체 분석이 사용되고 있습니다. 
환자 유래 iMG 세포는 인간 뇌의 미세아교세포 활성화를 예측하기 위한 주요 대리 마커 역할을 할 수 있으며, Nasu-Hakola 병, 섬유근육통, 양극성 장애 및 Moyamoya 병 환자에서 이전에 알려지지 않은 미세아교세포의 동적 병태생리를 밝히는 데 도움이 되었습니다. 따라서 iMG 기반 기법은 가치 있는 역번역 도구 역할을 하며 다양한 정신 및 신체 질환에서 미세아교세포의 분자 병태생리를 역학적으로 규명하기 위한 새로운 통찰력을 제공합니다.

중요한 것은 형태학 및 유전자 발현을 포함하여 iMG 세포의 특성에는 많은 개인 수준 및 타이밍 수준의 이질성이 있다는 것입니다. 특정 개체의 iMG 세포는 수많은 분지 모양을 취하는 반면(그림 1A) 다른 개체에서는 구형 상태를 유지합니다(그림 1B). iMG 특성은 단일 개체 내에서도 다를 수 있으므로 iMG 세포는 질병 상태 바이오마커를 검출하기 위한 중추적인 도구로 사용됩니다. 반대로, 이러한 개인 간 차이에 대한 검사는 기술적 오류의 감소를 보증합니다. iMG 세포는 최소 14일 동안 GM-CSF 및 IL-34로 유도된 단핵구로 정의됩니다. 기술적 오류를 최소화하기 위해서는 유도 시간을 표준화하고, 동일한 양의 시약을 사용하며, 만료된 시약의 사용을 자제하는 것이 좋습니다.
또한 면역염색의 검증을 통해 iMG 세포가 P2RY12 및 TMEM119를 포함한 미세아교세포 마커를 발현한다는 것을 확인할 수 있습니다(그림 2). 선행 연구는 iMG 세포의 형태학적 및 유전자 발현 특성이 양극성 장애의 병태생리학과 관련이 있음을 입증했다20,21. GM-CSF 및 IL-34 처리 후 3일째에 가장 빠른 분지 세포가 관찰되었으며, 최적의 상태에 있는 iMG 세포는 일주일에 한 번 배지 교환을 수행하면 1개월 이상 생존할 수 있습니다. iMG 세포는 유전자 발현 분석에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 인터페론 감마 또는 IL-4로 자극을 받으면 iMG 세포는 유전자 발현 패턴을 변경하여 M1 및 M2 편광 미세아교세포 5,22의 기능 평가에 사용할 수 있습니다. 또한, FITC 비드는 아메보이드와 같은 형태학적 변형을 유발하고 TNFα 및 기타 유전자의 발현을 상향 조절한다5. 또한, phagocytosis는 beads 5,22의 형광 강도를 측정하여 평가할 수 있습니다. 또한 iMG 세포는 생존 가능한 세포이기 때문에 세포 사진(그림 3) 또는 타임랩스 사진(비디오 1)을 통해 실제 움직임과 형태학적 변화를 관찰할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66819/66819fig01.jpg"> 그림 1: iMG 세포의 형태. (A) 전형적인 파급 iMG는 미세한 소체체와 수많은 분지 측부를 나타냈습니다. (B) 특정 샘플은 아메바이드형과 같이 모양이 다양했습니다. 눈금 막대, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/66819fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66819/66819fig02.jpg"> 그림 2: iMG 세포의 면역세포염색. iMG 세포는 전형적인 미세아교세포 마커를 발현합니다: (A) TMEM 119, (B) P2RY12. 핵은 DAPI(파란색)로 염색되었습니다. 스케일 바 = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/66819fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66819/66819fig03.jpg"> 그림 3: iMG 세포의 형태학적 변형. iMG는 유도 과정에서 형태를 변경합니다. 세포 돌출부는 (A) 3일째 경에 나타나고 유도가 진행됨에 따라 (B) 7일 및 (C) 14일째에 늘어납니다. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/66819fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 1: iMG 세포의 타임랩스 사진. 중앙의 파열된 iMG 세포는 주변 세포와 접촉을 이루는 동시에 그 과정을 확장하고 수축하는 것으로 보였다. 또한, 세포는 손상된 세포의 식세포작용(phagocytosis)을 수행했습니다. 이미지 획득 간격은 46초, 촬영 시간은 약 14시간이었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/Mov.1.zip" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 솔루션의 구성 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/66819_Table%201.zip" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 연구는 뇌 염증의 간접 평가를 가능하게 하는 인간 단핵구 유래 미세아교세포(iMG) 세포의 확립을 위한 새로운 접근 방식을 설명합니다. 이는 뇌의 잠재적 염증 및 관련 신경 정신 질환에 초점을 맞춘 연구에 도움이 될 수 있는 세포 모델을 제시합니다.

Recent investigations employing animal models have highlighted the significance of microglia as crucial immunological modulators in various ...

규슈 대학의 우리 연구실은 다양한 신경 정신 질환에서 미세아교세포 기능 장애의 역할을 명확히 하는 것을 목표로 했습니다. 우리는 iMG 세포 기술이 사후 연구 및 애완 동물 뇌 연구와 같은 인간 뇌 분석의 한계를 넘어 인간의 세포 수준에서의 미세아교세포 역학 기능 및 기능 장애에 대한 새로운 빛을 비출 것이라고 믿습니다. 지금도 동물실험은 정신질환의 뇌병태생리학을 규명하는 데 필수적이지만, 설치류 데이터가 인간의 병태생리학에 얼마나 잘 적용될 수 있을지는 미지수다.우리의 인간 혈액 유도 iMG 세포 기술은 설치류 데이터, 임상 데이터, 미세아교세포 기능 및/또는 기능 장애 사이의 이러한 격차를 해소할 것입니다. 다른 인간 유래 세포 질환 모델인 인간 iPS 세포 유래 미세아교세포도 개발되고 있으며, 이는 개발하는 데 많은 시간과 비용이 필요하고 형질 마커는 평가할 수 있지만 상태 마커는 평가할 수 없습니다. 우리의 iMG 방법의 장점은 훨씬 간단하고 시간이 덜 걸리며 비용 효율적이라는 것입니다.우리는 이미 치매 질환, 양극성 장애, 섬유 근육통, 신경교종 및 질병과 같은 신경 정신 질환에 초점을 맞춘 역번역 iMG 연구를 통해 여러 후보 분자 요인을 밝혔습니다. 우리는 우리의 iMG 세포 기술이 다양한 신경 정신 질환에서 세포 수준의 미세아교세포 동적 기능 및 기능 장애에 대한 새로운 빛을 비출 것이라고 믿습니다.

engineering-human-blood-induced-microglia-like-cells-for-reverse

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Parajuli, B., et.al. 비침습적 경비강 경로를 통한 면역 적격 마우스 뇌에 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 미세아교세포의 이식. J. Vis. 경험. (2022).이 비디오는 유도 만능 줄기 세포 유래 인간 미세아교세포(iPSMG) 세포를 마우스 뇌로 경비강 이식하는 방법을 보여줍니다. 히알루로니다아제는 미세아교세포가 고갈된 마우스의 콧구멍에 적용되어 투과성을 향상시킵니다. iPSMG 현탁액을 비강 내로 투여하고 마우스를 회복시킵니다. 성장 인자가 풍부한 배지는 뇌 조직에서 iPSMG 생존을 지원하기 위해 정기적으로 투여됩니다.

유도만능줄기세포 유래 인간 미세아교세포를 마우스 뇌로 경비강 이식

여기, 우리는 시험 관내 실험에 대한 출생 마우스 새끼에서 미세 아교 세포를 분리하는 프로토콜 (1 일)을 제시한다. 단리 방법이 즉석에서 모두 높은 수율 및 순도, 소교 생물학의 해명을 목적으로 다양한 실험을 허용 다른 방법에 비해 상당한 이점을 생성한다.

향상된 순도와 다양성에 차 미세 아교 세포의 신속하고 세련된 CD11b를 자기 절연

우리는 성인 마우스 뇌 반구의 다른 해부 된 영역에서 microglia의 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 전체 길이 전사체의 깊은 단일 세포 RNA 시퀀싱을위한 반자동 라이브러리 준비를 제공합니다. 이 방법은 건강과 질병에서 microglia의 기능적 이질성을 해명하는 데 도움이됩니다.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

이 프로토콜은 살아있는, 성인, 인간의 뇌 조직에서 기본 microglia를 격리하는 효율적이고 비용 효율적이며 강력한 방법입니다. 고립 된 1 차적인 인간 microglia는 항상성 및 질병에 있는 세포 프로세스를 공부하기 위한 공구역할을 할 수 있습니다.

성인 인간 뇌 조직에서 인간 마이크로글리아 획득

우리는 유전자 변형되지 않은 (GM 무료) 방법을 제시하여 재프로그래밍 된 말초 혈액 세포에서 신경 표현형을 가진 세포를 얻습니다. 새로운 인간 GPI 연결 단백질에 연결 된 신호 경로의 활성화 인간의 다능 한 줄기 세포를 얻기 위한 효율적인 GM 무료 방법을 밝혀.

혈액 유래 신경 세포의 GM 무료 생성

여기에 제시된 프로토콜은 면역적격 마우스에서 경비강 경로를 통해 유도된 만능 줄기 세포 유래 인간 미세아교세포(iPSMG)를 뇌로 이식하는 것을 허용한다. iPSMG의 유지를 위한 세포의 제조 및 경비강 이식 및 사이토카인 혼합물의 투여를 위한 방법이 제시된다.

비침습적 경비강 경로를 통한 면역적격 마우스 뇌에서 인간 유도 만능 줄기세포 유래 미세아교세포의 이식

이 프로토콜은 시험관 내 실험을 위해 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 미세 아교 세포와 같은 세포로의 분화 과정을 설명합니다. 또한 라이브 셀 이미징 시스템을 사용하여 체외 식균 작용 분석의 기질로 사용할 수 있는 iPSC 유래 하부 운동 뉴런에서 인간 시냅토솜을 생성하는 자세한 절차도 포함되어 있습니다.

인간 미세아교세포 유사 세포: 유도만능줄기세포로부터의 분화 및 인간 시냅토좀을 이용한 체외 생세포 식균작용 분석

미세아교세포는 망막에 존재하는 독특한 면역 세포로, 다양한 망막 퇴행성 질환에서 중요한 역할을 합니다. 미세아교세포와 망막 오가노이드의 공동 배양 모델을 생성하면 망막 질환의 발병 기전 및 발병 진행 상황을 더 잘 이해할 수 있습니다.

미세아교세포(Microglia)를 이용한 망막 오가노이드 조립

우리는 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 조혈전구세포(HPC)를 오가노이드 개발에 통합하여 상주 미세아교세포를 가진 인간 뇌 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

Microglia 발달을 통한 인간 뇌 오가노이드의 유도

유도 및 항원에 특정한 T 세포의 확장을위한 새로운 DC 독립적인 방법을 설명합니다. HLA A2 - IG 기반의 인공 항원 제시 세포 (aAPC)을 효율적으로 다양한 항원 특이성의 CTL 확장 HLA - A2 제한 펩티드와 함께로드됩니다. 이 기술은 CTL 기반 입양 immunotherapy에 대한 잠재력을 보유하고 있습니다.

효율에 대한 HLA - IG 기반 인공 항원 제시 세포 예 생체내</em인간 CTL의> 확장

배우세요 인간 혈액 유도 미세아교세포 유사 세포 기술을 활용한 뇌 염증 평가 방법을. 이 모델은 신경정신 질환의 병태생리 연구에 활용됩니다.

역번역 뇌 연구를 위한 인간 혈액 유도 미세아교세포 유사 세포 엔지니어링

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