Name: 쥐에서 편측 경추 척수 반절개 후 완충 횡격막 활동의 기능적 회복 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: 배우세요 쥐의 편측 C2 척수 반절개 후 횡격막 근육 활동의 기능적 회복을 평가하는 방법을. BDNF 신호전달과 신경가소성의 역할을 탐구하여 경추 척수 손상 후 호흡 기능 회복 메커니즘을 이해합니다.

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저자는 NIH 자금 출처(NIH R01HL146114)를 인정합니다.

변동성을 최소화하기 위해 쥐에서 DIAm EMG Post-C2SH의 표준화된 평가

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

C2 척추 반절개 이 기사에서 설명하는 절차는 등쪽 funiculi를 보존하면서 lateral and ventral funiculi를 가로지르는 C2 척추 병변의 검증 역할을 하는 DIAm EMG 활성의 평가를 강조합니다(그림 2A). 제안된 수술 접근법에는 두 가지 주요 이점이 있습니다. 첫째, 쥐의 보행 기능을 보존하는 등쪽 funiculi를 보존하면서 횡격막 운동 뉴런에 대한 동측 입력을 여전히 절단합니다. 둘째, DIAm EMG를 모니터링함으로써 동물이 마취되는 동안 수술 중 초기에 완곡성 iDIAm EMG 활성을 제거하는 C2 병변의 효능을 검증할 수 있습니다. 부상 후 3일째에 동물이 마취되는 동안 완곡한 iDIAm EMG 활동이 실제로 계속 침묵하는지 확인합니다. 이전에 횡격막 운동 뉴런에 대한 rVRG 흥분성 입력과 횡격막 운동 뉴런의 NMDA 수용체 발현은 손상 후 3-7일에 감소하고 글루타마터직 시냅스 입력과 NMDA 수용체 발현은 모두 부상 후 7일 후에 시간이 지남에 따라 증가하는 것으로 나타났습니다33,42. 이러한 데이터는 C2 병변 10,13,29,30,33의 조직 학적 확인과 결합되어 손상 후 3 일째에 마취하에 지속적인 비활동이 초기 C2SH의 효능에 대한 정보를 제공한다는 것을 시사합니다. 여러 해에 걸쳐 수행 된 연구에서 30 % -40 % 사이의 마취 하에서의 자연 회복률은 C2SH 후 14 일째에 상대적으로 안정적인 속도로 나타났습니다 도 18,19,20,29,31,43에 도시된 바와 같이,C2SH의 성공을 검증하는 이 방법이 재현 가능하고 신뢰할 수 있음을 시사한다.
C2SH 절차에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 중요한 것은, 여기에서 제안된 C2SH 모델은 등쪽 funiculi를 살려 주어 사지 운동 결손을 일으키지 않는다는 것입니다. 등쪽 funiculi를 포함하는 전체 C2 척추 반절부 모델에서, 사지 운동 결손은 상당히 더 큽니다 3,4,5,6,7,37. 따라서,C2SH모델(그림 2A)의 추가적인 이점은 마취된C2 병변 쥐에서 완곡한 iDIAm EMG 활성을 침묵시키는 것 외에도, 쥐가 보행 및 기타 기능 측면에서 가짜 후궁절제술 쥐와 기능적으로 유사하다는 것이다. 따라서 일반적으로 스스로 먹이를 먹고 몸을 손질할 수 있으며, 이는 돌봄 부담을 줄이는 동시에 DIAm 신경 운동 제어 및 호흡 신경 가소성에 대한 연구를 가능하게 합니다. C2 모델이 적절하게 구현되도록 하려면 과도한 병변을 피하기 위해 세심한 주의를 기울여야 합니다. 등뿌리가 척수로 들어가는 곳 바로 아래에 절개 칼을 삽입하는 것과 복부 부분을 아껴서 자르는 것은 모두 유용한 경험 법칙입니다. 목표는 eupneic iDIAm EMG 활동이 중단되도록 하는 것입니다. 필요한 경우 여러 개의 작은 절단으로 이 작업을 수행할 수 있습니다. 실제로, C2SH 다음 주에는 동물이 보행에 어려움을 겪고 음식 알갱이에 손을 뻗는 데 어려움을 겪는 경우 척수에 과도한 손상이 있었는지 여부가 명확해질 것입니다.
전극 배치 및 EMG 기록 만성 DIAm EMG 전극은 다른 접근법에 비해 몇 가지 분명한 이점이 있습니다. 전극은 C2SH 시술 몇 일 전에 이식할 수 있으며(이식해야 함) 회복을 위한 충분한 시간을 허용하고 동일한 수술 세션 동안 개복술과 C2SH가 필요하지 않습니다. 이는 개복술이 DIAm35,36의 억제를 유발한다는 것이 잘 알려져 있기 때문에 중요합니다. 만성 DIAm 전극을 이식함으로써, 이전 작업10,13에서 수행된 반복적인 개복술도 필요하지 않습니다. 또한 각 세션 동안 전극이 DIAm에 삽입되지 않기 때문에 기흉의 위험이 줄어듭니다. 그러나 전극 배치의 결과로 잠재적으로 심각한 여러 부작용이 발생할 수 있습니다. 반복적인 전극 삽입을 피함으로써 기흉의 위험이 감소하지만 완전히 무효화되는 것은 아니며 실제로 기흉이 발생하여 즉각적인 사망이나 장기적인 문제를 일으킬 수 있습니다. 이러한 위험을 줄이려면 DIAm을 통해 나사산을 끼우는 바늘이 DIAm의 상부 표면에 구멍을 뚫지 않도록 하는 것이 가장 좋습니다. 또한 전극 와이어를 조작하는 동안 DIAm에 손상을 줄 수 있는 날카로운 집게를 사용하지 마십시오. 때때로 쥐는 복부의 실밥을 씹을 수 있으며, 자신의 장치에 맡기면 잠재적으로 스스로 내장을 제거할 수 있습니다. 쥐는 이러한 유형의 행동을 조기에 감지하기 위해 전극 배치 후 정기적으로 관찰해야 합니다. 어떤 경우에는 바늘 손상을 복구하기 위해 쥐를 마취시키는 것이 가능할 수 있습니다. 그러나 수술 중과 수술 후에 적절한 통증 완화를 제공하고 수술 중 멸균 필드가 파손되지 않도록 하여 이러한 행동을 완화하는 것이 가장 좋습니다. 극단적인 경우, 실밥을 반복적으로 제거하는 쥐를 안락사시켜야 할 수도 있습니다.
EMG 신호의 기록 및 분석은 본 연구의 주요 초점이 아니며 각 실험실에서 사용할 수 있는 특정 장비 및 소프트웨어에 크게 의존합니다. 장비 정보는 재료 표에 제공되지만 EMG 활동을 증폭하고 기록하기 위한 다양한 하드웨어 옵션이 존재하며 세부 사항은 각 실험실의 기능, 가용성 및 경제성의 조합에 따라 달라집니다. 그러나 언급해야 할 중요한 EMG 기록의 몇 가지 일반적인 원칙이 있습니다. 한 가지 잠재적인 문제는 이식된 전극의 이동 또는 파괴이며, 이는 DIAm EMG의 정량적 평가를 제한할 수 있습니다. 전극이 DIAm에서 떨어져 나갔거나 쥐가 외부화된 와이어를 섭취하거나 손상시킨 경우 EMG 활동을 기록할 수 없거나 소음 수준이 변경될 수 있습니다. 이는 전극이 DIAm에 단단히 고정되어 있는지 확인함으로써 피할 수 있으며, DIAm 전극 배치 수술 중에 높은 신호 대 잡음비(SNR)를 가진 신호를 기록할 수 있습니다. 또한, 전극 와이어를 등쪽 높은 곳에 외부화하고 쥐가 전극 와이어에 접근할 수 없도록 과도한 와이어를 차단하는 것은 모두 만성 전극의 성공에 도움이 됩니다. 외부화된 전선에 대한 대안으로서, 헤드 캡(37) 또는 텔레메트리(44,45)가 합리적인 선택일 수 있다. 두 가지 방법 모두 깨어 있는 동물에서 녹음을 더 쉽게 얻을 수 있지만 단순히 다중 가닥 와이어를 외부화하는 것보다 구현하기가 약간 더 어려울 수 있습니다. 근처의 모든 전자 소스는 잠재적으로 소음의 원인이 될 수 있습니다. 모든 장비를 적절하게 접지하고, 차폐 케이블을 사용하고, 활성 녹음이 진행되는 동안 쥐를 만지지 않는 것이 가장 중요합니다. 녹음 중에 전자 열 패드를 끄는 것 외에도 조명, 주변 장비, 전기적으로 작동되는 수술 테이블 및 기타 이러한 장치는 저소음 녹음을 위해 일시적으로 꺼야 할 수 있습니다. 환경적 영향을 최소화하려면 DIAm EMG 녹음을 위해 켤 필요가 없는 전자 장비를 꺼야 합니다. 가능하면 녹음은 전기적으로 차폐된 방에서 이루어져야 합니다. 시간이 지남에 따라 DIAm EMG 전극 주변의 조직 흉터와 섬유화는 전극의 전도도를 감소시켜 SNR을 감소시킬 수 있습니다. 또한 자세가 약간만 바뀌어도 DIAm EMG 신호에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 잠재적으로 복잡할 수 있는 문제를 최소화하기 위해 DIAm EMG는 기록 세션 전반에 걸쳐 동일한 자세의 쥐와 함께 기록해야 합니다.
또 다른 중요한 고려 사항은 필터링 및 샘플링 설정입니다. 전극의 유형(즉, 근육 내 대 식도/표면)은 신호의 주파수 함량을 결정하고 결과적으로 신호에 적합한 고역 및 저역 통과 필터를 결정하는 데 매우 중요합니다. 표면/식도 DIAm EMG46에 대한 최적의 필터를 결정하기 위해 상당한 노력이 기울여졌습니다. 쥐 DIAm에 대한 유사한 연구는 수행되지 않았지만 이전에 우리는 쥐에서 만성 근육 내 전극을 사용하여 기록된 DIAm EMG의 전체 주파수 함량이 1000Hz 미만이고 중심 주파수는 약 300Hz47임을 효과적으로 보여주었습니다. 표면 및 근육 내 전극을 통해 얻은 인간의 상완 이두근 근근 파워 스펙트럼의 평균 및 중간 주파수를 직접 비교한 결과, Christensen et al.48은 표면 전극에 비해 근육 내 전극의 평균 및 중간 주파수가 약 3배 더 높다는 것을 발견했습니다. DIAm에서 연구자들은 양극성 식도 전극 49,50,51,52,53,54를 사용할 때 약 100Hz의 중심 주파수를 보고했으며, 이는 이전에 근육 내 전극에 대해 결정된 300Hz가 Christensen et al.48이 보여준 것과 거의 일치함을 시사합니다. 그럼에도 불구하고 설치류 모델에서 근육 내 DIAm EMG를 사용하는 여러 발표된 연구에서는 고역 통과 필터를 300Hz 4,37,55,56에 배치했으며 일부는 500Hz 57까지 높였습니다. 이러한 필터링 접근 방식이 DIAm EMG 신호의 진폭을 적어도 1/2까지 실질적으로 줄일 수 있다는 것은 논란의 여지가 없습니다. 우리는 훨씬 덜 파괴적인 접근법을 제안합니다: (1) ECG 파워 스펙트럼의 대부분이 100Hz 미만이고 DIAm EMG 파워 스펙트럼의 비교적 적은 수가 100Hz 미만이기 때문에 100Hz에서 고역 통과 필터링을 하고(51,52) (2) 파형 정합58에 의해 남은 ECG를 제거합니다. 따라서 대부분의 연구에서 DIAm EMG에 적합한 필터는 100Hz에서 1000Hz 사이로 설정할 수 있으며, 데이터 내의 모든 관련 기능을 캡처하기 위해 최소 2000Hz의 샘플링 주파수를 설정할 수 있습니다. 그런 다음 이전 보고서40,41,47,58에 게시된 기술을 사용하여 DIAm EMG의 상세한 분석을 수행할 수 있습니다.
깨어 있거나 마취된 동물 특히, 일부 연구에서는 cSCI의C2SH모델이 eupneic iDIAm EMG23,37의 완전한 비활성으로 이어지지 않는다는 점을 강조했습니다. 어떤 의미에서, 이것은 놀라운 일이 아닌데, 이전에 언급했듯이, "돌파적" 활동은 더 높은 추진력을 필요로 하는 행동(예: 심호흡 및 기도 폐색에 대한 반응) 중에 발생한다는 것입니다.4,7,29,42. 이러한 데이터는 C2SH 모델을 지속적인 비활성의 실제 모델로 생각하는 것이 적절하지 않을 수 있음을 시사합니다. 실제로, 충동은 완전한 C2SH37 후 4일 후에 빠르면 나타날 수 있도록 깨어 있는 동물에서 충분히 높은 것으로 보이지만, 부상 후 1일에도 일관되게 존재하지는 않는다23. 모든 경우에, 마취는 이전 보고서23,38에서 강조되고 그림 4 및 그림 5에서 나타난 바와 같이, 상부 경추 척추 반절개 후 iDIAm 활동을 억제한다. 본 원고에서 제안된 예비 등쪽 funiculi를 가진 C2SH를 가진 깨어 있는 쥐의 DIAm EMG 활성에 대한 발표된 데이터는 없습니다(그림 2A). 향후 연구에서는 이 C2SH 모델을 사용하여 깨어 있는 동물에서 DIAm EMG 활동의 시간 경과에 대한 자세한 특성을 제공해야 합니다. 그렇긴 하지만, 손상 후 3일째에 마취 하에 완충 iDIAm 비활성이 계속 나타나지 않는 것에 대한 검증을 수행하여 척수가 처음에 병변화/절제된 실험 조건을 모방하는 것은 여전히 신중합니다. 부상 후 3일째에 깨어 있는 동물에서 완구심 iDIAm EMG 활성이 나타날 수 있는 경우, 마취제를 절반만 투여해도 일반적으로 완곡성 iDIAm EMG 활성이 완전히 중단된다는 점에 유의해야 합니다. 이 복용량으로 동물들은 침착하고 진정됩니다. C2SH동안과 부상 후 3일째에 완충성 iDIAm EMG 활동의 침묵을 확인하는 것 외에도,C2SH 9,29,59의 부위 및 범위에 대한 조직학적 확인을 수행하기 위해 말단 실험 후에 척수를 추출하는 것이 권장됩니다. 손상에 대한 조직학적 확인은 침묵된 완곡성 iDIAm EMG 활동의 기능적 확인과 결합될 때 성공적인 C2SH의 강력한 증거를 제공합니다.
본 논문은 쥐에서 cSCI의 C2SH를 제시하며, 이는 부상 후 3일째에 마취 하에 계속 침묵하면서 완곡한 iDIAm EMG 활동의 즉각적인 침묵으로 이어집니다. 본 원고에서 제안된C2SH모델에서 등쪽 funiculus의 보존으로 인해, 사지 운동 기능이 보존되어 off-target 효과를 피할 수 있다. 이를 통해 상대적으로 건강한 쥐에서 높은 자궁경부 병변이 DIAm 신경 운동 조절에 미치는 영향에 대한 종단 연구를 수행할 수 있으므로 연구자의 관리 부담을 최소화할 수 있습니다. 부상 후 3일째에 마취 상태에서 비활성을 검증하면 완혈성 iDIAm EMG의 후속 회복 정도를 평가하기 위한 명확한 기준선이 설정됩니다. 이 접근법은 쥐에서 C2SH를 수행하기위한 엄격하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 방법을 제공합니다. 이 모델은 호흡기 신경가소성의 시간 경과와 잠재적인 치료 전략과의 교차점에 대한 이해를 크게 향상시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

미국에는 300,000명 이상의 척수 손상(SCI) 환자가 있으며, 그 중 약 절반이 경추 손상을 가지고 있습니다1. 이러한 부상은 심각한 웰빙 손실을 초래하고 개인, 가족 및 의료 시스템에 재정적 부담을 줍니다. 다행히도 대부분의 SCI는 불완전하여 예비 경로를 강화할 수 있는 잠재력을 제공합니다1. 이러한 신경가소성은 인공호흡 및 비인공호흡 행동에 중요한 DIAm 활동을 포함한 적어도 일부 기능의 회복을 허용할 수 있습니다. 따라서 신경 가소성을 촉진하는 것은 SCI2 환자를 돕기 위한 유망한 연구 방법입니다.
SCI의 설치류 모델은 인간의 건강을 개선하기 위한 치료법의 발견에 실질적으로 기여할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 신경 가소성을 연구하는 데 사용되는 SCI의 고전적인 모델 중 하나는 C2 (C2SH)에서 척수의 편측 횡단 (반절개)으로, 반대쪽은 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13을 그대로 유지합니다. 횡격막 출력에 대한 C2SH의 효과와 보존된 반대측 경로의 중요성은 100여 년 전 Porter12에 의해 처음 밝혀졌으며, 그의 중요한 논문은 호흡 신경 가소성에 대한 현대 연구의 토대를 마련했습니다. C2SH모델은 호흡 리듬 생성14의 출력을 전달하는 전운동 뉴런을 포함하는 수질의 rVRG(rostral ventral respiratory group)로부터의 하강 입력을 중단한다. 이러한 rVRG 전운동 뉴런은 또한 흥분성 신경 드라이브를 횡격막 운동 뉴런으로 전달합니다(그림 1). 여러 연구자들이 C2SH 모델10,11,15,16에 대해 다른 접근 방식을 취했으며, 이는 연구 간 회복의 변동성 중 일부를 부분적으로 설명할 수 있습니다. 간단히 말해서, 접근 방식은 등쪽 funiculi를 보존하거나, 완전한 반절개를 수행하거나, 동측 rVRG의 하강 입력을 완전히 중단하지 않는 측면 부분 횡단을 수행하는 측면에서 다양합니다. 일반적으로,C2SH모델은 시간이 지남에 따라 완납 iDIAm 근전도(EMG) 활성의 자발적 회복 속도 때문에 호흡기 신경가소성을 연구하는 데 특히 유용하며, 이는 신경영양성 신호전달을 포함한 여러 요인에 의해 개선될 수 있다 17,18,19,20,21. 그러나 완곡한 iDIAm EMG 활동의 침묵으로 정의되는 초기 기능 상실은 회복을 명확하게 분류하기 전에 먼저 확립되어야 합니다. C2SH시점에서의 비활성에 대한 이러한 검증은 여러 연구 3,4,6,7,11,22,23에서 수행되지 않는다.
절제된 척수의 조직학적 평가는 척수의 횡격막 운동 뉴런을 자극하는 동측 흥분성 구근 경로의 적절한 위치에 대한 손상의 증거만 제공하지만, 조직학은 생리학적 증거(예: DIAm EMG)를 대체하지 않습니다. 또한, 조직학적 평가는 최종 시점(종종 부상 후 몇 주에서 몇 달)에 생체 외에서 수행되며 "실시간" 정보를 제공하지 않습니다. 일부 연구자들은 병변의 크기가 기능적 결함 또는 그 결핍의 양과 관련이 있다고 지적했다 5,24,25,26. 이러한 주장의 타당성은 "기능"을 분류하는 방법(즉, 기능적 작업이 무엇이며 어떻게 정량화되는지)에 따라 크게 달라질 수 있으며, 연구 간의 차이는 동물 간에 기능적으로 동일한 병변을 생성하는 것이 어렵다는 점을 강조한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 실제로, 연구자들은 부상 정도와 사지 근육 운동 기능 사이의 관계(Basso, Beattie, and Bresnahan(BBB) 점수24로 정량화됨)가 선형이 아니라는 점을 강조했습니다27,28. 이전 연구에서는C2SH의 정도와 손상 후 완청색 iDIAm EMG 활동의 회복 정도 사이에 관계가 없음을 발견했지만10,29,30,31 다른 연구자들은 환기 기능과 백질 보존 정도 사이의 관계를 보고했습니다 5. 따라서,C2SH모델의 경우, 수술 시점 및 바람직하게는 만성 척수 손상 실험의 시간 경과 초기에 iDIAm 비활성의 기능적 검증을 위한 접근법이 유익하고 필요하다.
본 논문은 부상 후 3일(3일)에 후속 확인 평가뿐만 아니라 C2SH 후 호흡 중 DIAm EMG의 초기 손실을 실시간으로 확인하고 부상 후 3일(3일)에 후속 확인 평가를 위해 DIAm EMG를 사용하는 것을 강조합니다 18,21,31,32,33. C2SH 모델을 사용한 초기 연구에서는 DIAm EMG 10,13,30,34를 기록하기 위해 반복적인 개복술을 수행했습니다. 그러나 보다 최근의 연구는 만성 근전도 전극을 사용하여 마취되고 깨어 있는 쥐에서 근전도를 기록할 수 있습니다. 또한 만성 전극은 기흉의 위험을 줄이고 DIAm35,36의 억제를 유발할 수 있는 반복적인 개복술이 필요하지 않습니다. 많은 연구자들이C2SH모델의 버전을 사용했지만, 수술 당시에는 iDIAm 활성의 침묵에 대한 확인이 이루어지지 않았다 3,4,6,7,11,22,23. 이러한 비활성에 대한 확인이 없으면 후속 회복의 어느 부분이 동측 경로와 반대측 경로의 신경 가소성에 기인하는지 알기 어려우며, 이는 차별적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이것은 rVRG에서 횡격막 운동 뉴런으로의 흡기 신경 드라이브가 주로 동측성이기 때문에 중요한 고려 사항이며, C2SH33 이후 횡막 운동 뉴런에 대한 흥분성 글루타마테르 입력의 약 50%가 손실됩니다. 그러나 반대측 rVRG에서 병변 부위 아래로 감소하여 동측 횡격막 운동 뉴런을 자극하고 신경 가소성을 통해 강화하여 기능 회복을 촉진할 수 있는 흡기 흥분성 입력이 남아 있습니다. 횡격막 운동 뉴런에 대한 우세한 동측 흥분성 입력을 제거함으로써, 완납 iDIAm EMG 활성은 (적어도 마취 하에서) 손실되는 반면, cDIAm의 활성은 계속되고 심지어 향상됩니다. 따라서 호흡 중 iDIAm EMG 활동의 손실은 성공적인 C2SH의 척도입니다 (그림 2).
일부 수준의 iDIAm EMG 활동은 깨어 있는 동물에서 C2SH 후 1-4일 이내에 존재합니다23,37. 또한, decerebrate 동물에서, iDIAm 활성은 상부 경추 반절제 후 몇 분 내지 몇 시간 내에 존재하며, 마취에 의해 억제된다38. 또한, C2SH의 성공은 부상 후 3일째에 마취된 쥐에서 호흡(유프니아) 중 iDIAm EMG 활성이 없음을 확인함으로써 검증됩니다. 공초점 이미징 연구는 이 손상의 초기 단계에서 횡격막 운동 뉴런의 글루타마테르직 시냅스 입력의 손실을 확인했다37. 부상 후 3일째에 잔류 완청성 iDIAm EMG 활동이 있는 경우 이는 rVRG에서 동측 하강 흡기 드라이브가 불완전하게 제거되었다는 증거로 해석됩니다. 본 논문은 (1) 만성 DIAm EMG 기록, (2) C2SH 및 (3) 깨어 있는 동물 및 마취된 동물에서의 EMG 데이터 수집의 세 섹션으로 나뉩니다. 이 프로토콜은 쥐에서 cSCI의 엄격하고 재현 가능하며 신뢰할 수 있는 C2SH 모델을 설명하며, 이는 호흡기 신경 가소성, 보상적 cDIAm 활성, 치료 전략 및 약물을 연구하기 위한 훌륭한 플랫폼입니다.

<table><tbody><tr><td>25 G 바늘</td><td>Cardinal Health</td><td>1188825100</td><td>Covidien Monoject Hypdermic 표준 바늘 : 25 G x 1 "(0.508 mm x 2.5 cm) A</td></tr><tr><td>3-0 Vicryl Violet Braided</td><td>Ethicon</td><td>J774D</td><td>3-0 봉합</td></tr>사 <tr><td>Adson-Brown 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11627-12</td><td>팁 모양 : 직선, 팁 : 상어 이빨, 팁 너비 : 1.4mm, 팁 크기 : 2 x 1.4 m, 합금 / 재질 : 스테인레스 스틸, 길이 : 12cm</td></tr><tr><td>Bowman 스타일 케이지</td><td>Braintree Scientific</td><td>POR-530</td><td>무게 범위: 250 최대 750g; 최대 길이: 9"(228mm); 기본 장치는 .5"(123mm) 보석 아크릴로 구성됩니다.</td></tr><tr><td>Castroviejo 바늘 홀더</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>12565-14</td><td>팁 모양: 직선, 팁 너비: 1.5 mm, 클램핑 길이: 10 mm, 잠금: 예, 가위: 아니오, 합금 / 재질: 스테인레스 스틸, 길이: 14 cm, 톱니 모양: 예, 특징: 텅스텐 카바이드</td></tr><tr><td>클립 리드 1m TP 차폐</td><td>Biopac Systems, Inc</td><td>LEAD110S</td> EMG 데이터 수집 소프트웨어<td>용 차폐 리드선</td></tr><tr><td></td><td>LabChart</td><td>LabChart LabChart 7.3.8</td><td>다중 채널 기록 및 실시간 평가를 위한 데이터 기록, 시각화 및 분석</td></tr><tr><td>소프트웨어 데이터 분석 소프트웨어 - Matlab 2023b</td><td>Mathworks, Inc.</td><td>버전 23.2</td><td>사후 분석을 위한 범용 프로그래밍 언어</td></tr><tr><td>Dissecting Knife</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>절삭날: 4mm, 두께: 0.5mm, 합금/재질: 스테인리스강, 길이: 12.5cm, 블레이드 모양: 각도 30°C;</td></tr><tr><td>Dumont #3 포셉스</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11293-00</td><td>스타일: #3, 팁 모양: 직선, 팁: 표준, 팁 치수: 0.17 x 0.1 mm, 길이: 12 cm, 합금 / 재질: Dumostar</td></tr><tr><td>근전도 증폭기</td><td>Biopac Systems, Inc</td><td>EMG100C</td><td>EMG 증폭기</td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td>팁 모양: 곡선, 컵 크기: 2.5mm, 합금 / 재질: 스테인리스 스틸, 길이: 13cm, 조인트 액션: 단일</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>합금 / 재질: 스테인리스 스틸, 길이: 14cm, 조인트 액션: 단일, 컵 크기: 1mm, 팁 모양: 곡선형</td></tr><tr><td>절연 전원 공급 장치 모듈</td><td>Biopac Systems, Inc</td><td>IPS100C</td><td>Biopac Systems, Inc.의 MP 시리즈 데이터 수집 시스템</td></tr><tr><td>Kelly Hemostats</td><td>Fine Science Tools</td><td>와 독립적으로 100 시리즈 증폭기 모듈을 운영합니다.13019-14</td><td>팁 : 톱니 모양, 팁 너비 : 1.5mm, 클램핑 길이 : 22mm, 합금 / 재질 : 스테인레스 스틸, 길이 : 14cm, 팁 모양 : 곡선</td></tr><tr><td>나이프 큐렛</td><td>V. Mueller</td><td>VM101-4414</td><td>팁 : 날카로움, 팁 직경 : 2mm</td></tr><tr><td>마이크로 해부 가위</td><td>Biomedical Research Instruments, Inc.</td><td>11-2420</td><td>길이: 4", 각도: 스트레이트, 블레이드 길이: 23mm</td></tr><tr><td>다중 가닥 스테인리스 스틸 와이어</td><td>Cooner Wire, Inc.</td><td>AS 631</td><td>AWG 40; 전체 직경 : 0.011 mm (절연 포함), 0.008 mm (절연 제외).</td></tr><tr><td>PowerLab 8/35</td><td>ADInstruments</td><td>PL3508</td><td>데이터 수집 시스템</td></tr><tr><td>메스 블레이드 #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>블레이드 모양: 각짐, 절삭날: 20mm, 두께: 0.4mm, 합금/재질: 탄소강</td></tr><tr><td>메스 핸들 #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>합금 / 재질: 스테인리스강, 길이: 12cm</td></tr><tr><td>Sprague Dawley Rat</td><td>Inotiv</td><td>주문 코드: 002</td><td>Sprague Dawley는 근친 쥐 (암컷과 수컷)를 이월했습니다.</td></tr> 수술용 <tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td>수술용 현미경&nbsp;</td></tr><tr><td>봉합사 절단 가위</td><td>George Tiemann & Co.</td><td>110-1250SB</td><td>합금 / 재질: 스테인리스강, 팁 모양: 직선, 팁: 샤프/블런트, 길이: 4.5"</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>팁: 날카로움, 절삭날: 2.5mm, 팁 직경: 0.05mm, 길이: 8cm, 합금/재질: 스테인리스강, 톱니 모양: 아니오, 팁 모양: 스트레이트</td></tr><tr><td>Weitlaner 리트랙터</td><td>코드만</td><td>50-5647</td><td>프롱: 2 x 3 블런트, 길이: 4.5"</td></tr></tbody></table>

쥐에서 편측 경추 척수 반절개 후 완충 횡격막 활동의 기능적 회복 평가

Assessing Functional Recovery of Eupneic Diaphragm Activity Following Unilateral Cervical Spinal Cord Hemisection in Rats

cSCI 후 DIAm의 활성화는 부상 정도에 따라 영향을 받을 수 있습니다. 본 논문은 쥐에서 호흡하는 동안 완곡성 동측 횡격막(iDIAm) 근전도(EMG) 활동을 방해하는 cSCI의 일방적C2 반절개(C2SH) 모델을 설명합니다. DIAm 모터 제어의 회복을 평가하려면 먼저C2SH로 인한 적자 정도를 명확하게 설정해야 합니다. 호흡 중 iDIAm EMG의 완전한 초기 손실을 확인함으로써 후속 회복은 부재 또는 존재로 분류할 수 있으며 EMG 진폭을 사용하여 회복 정도를 추정할 수 있습니다. 또한,C2SH후 급성 척추 쇼크 기간 후 호흡 중 iDIAm EMG 활성이 지속적으로 부재하는 것을 측정함으로써 초기C2SH의 성공을 검증할 수 있습니다. 반대측 횡격막(cDIAm) EMG 활성을 측정하면 신경 가소성을 반영하는 C2SH의 보상 효과에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 더욱이, 깨어 있는 동물의 DIAm EMG 기록은 C2SH 이후 DIAm의 운동 제어에 대한 중요한 생리학적 정보를 제공할 수 있습니다. 이 기사에서는 쥐에서 cSCI의 엄격하고 재현 가능하며 신뢰할 수 있는 C2SH 모델을 위한 방법을 설명하며, 이는 호흡 신경 가소성, 보상적 cDIAm 활성, 치료 전략 및 약물을 연구하기 위한 훌륭한 플랫폼입니다.

이 기사에서 제시된 접근 방식은 C2SH의 랫 모델에서 DIAm EMG를 평가하기 위한 명확한 기준을 설정하여 작업자 간 변동성을 최소화합니다. 첫째, 그림 2와 같이C2SH직후 완곡한 iDIAm EMG 활성의 중단을 관찰해야 합니다. 그렇지 않은 경우 eupneic iDIAm 활성이 사라질 때까지 2차 횡단을 수행할 수 있습니다. 둘째,C-2SH 후 3일째에 동물을 마취하는 동안 완곡한 iDIAm EMG가 계속 없는지 확인해야 합니다. 그림 4A는 부상 후 3일째에 마취 하에 완곡한 iDIAm EMG 활동이 지속적으로 부재한 것으로 결정된 성공적인 C2SH의 예를 보여줍니다. 그림 4B는 마취되지 않은 깨어 있는 상태에서 동일한 동물에서 DIAm EMG 활동을 보여주며, 부상 전 기준선과 비교하여 iDIAm 활성의 감소(부재는 아님)를 강조합니다. 특히, cDIAm EMG 활성은 깨어 있는 상태와 마취된 상태 모두에서 증가합니다. 3일째의 마취된 기록은 초기 C2SH가 성공적이었음을 입증하지만, 깨어 있는 동물에서 정량 분석을 수행해야 합니다. 깨어 있는 동물에서C-2SH 후 3일차의 DIAm EMG 활동은 회복의 시작점을 나타냅니다. 그림 4B는 깨어 있는 쥐에서 3일째에 iDIAm EMG 활동이 감소하지만 없는 것은 아님을 보여줍니다.
일부 경우에,C2SH는 완곡한 iDIAm EMG 활성의 완전한 중단을 동반하지 않는다(그림 5A). 부적절한C2SH는 본 원고에 요약된 접근법을 사용하는 모든 사례의 5% 미만에서 발생한다; 그러나 C2SH 후 3 일째에 DIAm EMG 활성에 대한 평가를 각 쥐에 대해 수행하여 C2SH의 성공을 검증하는 것이 중요합니다. 그림 5A는 손상 후 3 일째에 쥐의 DIAm EMG 활동의 예를 보여주며, C2SH는 3 일째까지 완곡한 iDIAm EMG 활동을 제거하는 데 부적절했습니다. C2SH의 효능에 대한 검증은 동물이 마취된 상태에서 수행되었다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 지속적인 완곡성 근전도 활동은 하행 동측 척추 경로의 적어도 일부가 보존되었음을 시사하며, 이는 결과의 해석을 복잡하게 만들 수 있습니다. 그림 5B는 깨어 있는 쥐에서 3일째에 iDIAm EMG 활성이 감소하지만 없는 것은 아님을 보여줍니다. 그러나 동측 하강 입력을 절약하면 초기 적자를 줄일 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66828/66828fig01.jpg"> 그림 1: 개념적 프레임워크. rVRG(rostral ventral respiratory group)는 경추 척수(cervical spinal cord)의 횡격막 운동 뉴런(phrenic motor neuron)에 하강 입력을 보냅니다(C3-C 5). 이러한 하강 축삭의 대부분은 동측 횡격막 운동 뉴런 풀을 자극하지만 작은 부분은 정중선을 건너 반대쪽 운동 뉴런 풀을 활성화합니다. C2SH 직후, rVRG에서 동측 횡격막 운동 뉴런 풀로의 하강 입력이 중단됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66828/66828fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66828/66828fig02.jpg"> 그림 2: 대표적인 C2SH 및 DIAm EMG 활동. (A) 중요한 구조가 표시된 쥐의 척수와 tran site(빨간색 음영)의 횡단도가 표시됩니다. 척추 병변은 등뿌리가 들어가는 지점 바로 아래에 절개 칼을 삽입하고 대략 정중선(음영 처리된 반투명 빨간색 영역)까지 절단하여 수행됩니다. 외측 및 복부 funiculi의 주요 운동 기관이 절단되지만 dorsal funiculi는 보존됩니다. (B) 동측 운동 뉴런 활동의 침묵을 묘사하는 종단도는 만족스러운 병변의 실시간 확인에 사용되는 원시 EMG 추적을 보완합니다(C). 척수에 병변이 생기면 완납 iDIAm EMG 활동이 중단되며, 이는 횡격막 운동 뉴런에 대한 동측 입력이 절단되었음을 시사합니다. 한편, cDIAm EMG는 그림과 같이 즉시 활성을 증가시킵니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66828/66828fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66828/66828fig03.jpg"> 그림 3: 전극 제조. DIAm EMG 전극을 제조하는 공정이 표시됩니다. 기본 프로세스에는 적절한 길이의 와이어 측정 및 절단(1단계), 고정 매듭을 묶고 절연체를 벗겨 전극을 노출시키고(2단계), 와이어에 25게이지 바늘을 부착(3단계 및 4단계), 바늘을 구부려 수술용 봉합사 바늘과 유사한 곡률을 부여(5단계)하는 작업이 포함되었습니다. 그리고 절연체를 벗겨내어 EMG를 기록하기 위한 증폭기에 연결될 전선의 일부를 노출시킵니다(6단계). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66828/66828fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66828/66828fig04.jpg"> 그림 4: 성공적인 척추 반절제. (A) DIAm EMG 활성은 마취된 쥐에서 C2SH 이전과 부상 후 3일째에 나타납니다. 부상 후 3일째에 이 쥐에서 완곡한 iDIAm EMG 활동의 증거는 없으며, 이는 초기 C2SH가 성공적이었음을 나타냅니다. 부상 전 상태와 비교하여 cDIAm EMG 활동의 보상적 증가와 호흡수의 증가에 유의하십시오. (B) DIAm EMG 활성은C-2SH 후 3일차에 마취되지 않은 깨어 있는 상태에서 동일한 쥐에서 나타났습니다. 완전히 침묵하지는 않았지만 iDIAm EMG 활동이 감소했다는 명백한 증거가 있습니다. 부상 전 상태와 비교하여 cDIAm EMG 활동의 보상적 증가와 호흡수의 증가에 유의하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66828/66828fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66828/66828fig05.jpg"> 그림 5: 척추 반절리 실패. (A) DIAm EMG 활성은 마취된 쥐에서 C2SH 이전과 부상 후 3일째에 나타납니다. 이 쥐에서 eupneic iDIAm EMG 활동은 부상 후 3일째까지 지속되었으며, 이는 초기C2SH가 부적절했음을 나타냅니다. 따라서, 이 쥐는 기능 회복에 대한 추가 분석에서 제외되었다. C2SH가 실패했음에도 불구하고 cDIAm EMG 활성의 보상적 증가에유의하지만, 호흡수의 증가는 미미하다. (B) DIAm EMG 활성은C-2SH 후 3일차에 마취되지 않은 깨어 있는 상태에서 동일한 실행으로 표시됩니다. iDIAm EMG 감소, cDIAm EMG 활동 증가, 호흡수의 약간의 증가에 대한 증거가 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66828/66828fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

호흡기 합병증은 경추 척수 손상(cSCI)이 있는 개인의 주요 사망 원인입니다. cSCI의 동물 모델은 기계론적 평가 및 전임상 연구에 필수적입니다. 여기에서는 쥐에서 편측 C2 척추 반절 (C2SH) 후 횡격막 근육 (DIAm) 활동의 기능적 회복을 평가하는 재현 가능한 방법을 소개합니다.

Following cSCI, activation of the DIAm can be impacted depending on the extent of the injury. The present manuscript describes a unilateral C2 hemisection ...

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

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후 병변 호흡 신경 가소성을 연구하기 위해 자궁 경부 척수 손상의 생쥐 모델

Compound muscle action potential recording은 횡격막 운동 뉴런에 의한 기능적 횡격막 신경 분포를 정량적으로 평가합니다. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry는 개별 신경근 접합부에서 형태학적 신경 분포를 평가합니다. 이 프로토콜의 목표는 이 두 가지 강력한 방법론이 척수 질환의 다양한 설치류 모델에서 어떻게 사용될 수 있는지 보여주는 것입니다.

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