HeLa 세포를 이용한 항-MDA5 자가항체 검출 및 광학 현미경을 이용한 면역세포화학(Immunocytochemistry)

우리는 항-MDA5를 검출하기 위한 단계별 면역세포화학(ICC) 방법론을 제공합니다. 이 접근법에는 세포 고정, 투과화, 항체 배양 및 이미징 기술이 포함되며, 이를 통해 항-MDA5 자가항체를 정확하게 검출할 수 있어 근염 환자에서 빠르게 진행되는 간질성 폐질환의 진단에 도움이 됩니다.

다음 실험의 주요 목적은 면역세포화학을 사용하여 항-MDA5 항체를 스크리닝하는 것입니다. 이것은 HeLa 세포를 사용하여 수행된 다음 MDA5 구조물로 HeLa 세포를 형질감염시킵니다. 따라서 HeLa 세포는 MDA5 항체에 의해 부착될 수 있는 MDA5 단백질을 생성합니다.

MDA5 구조물에 HeLa 세포를 포함시킨 후, Triton 시약을 사용하여 HeLa 세포의 막을 투과화하여 항-MDA5 항체가 통과할 수 있도록 합니다. 그 후, 항-MDA5 항체를 함유한 환자 혈청을 첨가합니다. 그런 다음 항-MDA5 항체는 HeLa 세포 내부의 MDA5 단백질에 부착됩니다.

그 후, 양 고추냉이 과산화효소가 부착된 2차 항체가 세포에 배치되고 2차 항체는 항-MDA5 항체에 부착됩니다. 마지막으로, 발색원을 세포에 첨가하고 양 고추냉이 과산화효소 접합 2차 항체의 존재 하에서 산화되어 광학 현미경에서 가시적인 색상을 생성합니다. 긍정적인 스탠딩 결과는 위 그림과 같은 것을 보여줍니다.

오늘의 비디오 시연에서는 의학 연구의 중요한 영역인 항-MDA5 항체라고도 하는 항-흑색종 분화 관련 유전자 5 항체의 검출로 넘어갑니다. 이러한 자가항체는 간질성 폐질환 환자, 특히 빠르게 진행되는 환자에게 간단한 진단 지표의 중요한 역할을 합니다. 이 연구의 중요성은 환자 결과에 대한 잠재적인 영향에 있습니다. MDA5 자가항체의 조기 및 정확한 검출은 이 심각한 자가면역 질환을 효과적으로 관리하는 데 필수적입니다.

우리가 시연한 방법의 주요 장점은 항-MDA5 자가항체를 스크리닝하는 황금 방법에 비해 기존의 방사성 표지 면역방문 분석에 비해 더 빠르게 수행할 수 있고 시간과 노력을 절약할 수 있다는 것입니다. 이러한 향상된 효율성을 통해 더 많은 샘플을 처리하고 신속하게 결과를 생성할 수 있습니다. 또한, 우리의 방법은 과도기 면역침전 분석과 비교할 때 우수한 효율성을 제공할 뿐만 아니라 안전성과 비용 효율성 측면에서도 우수하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

이제 어떻게 이루어지는지 살펴보겠습니다. 저의 연구 조교인 Teo Kai Fa가 절차를 이끌 것입니다. 가습된 5%CO2 분위기에서 섭씨 37도에서 10% 소 태아 혈청과 1% 항생제 항진균제를 함유한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium으로 HeLa 세포를 유지합니다.

2-3일마다 또는 세포가 90-100% 융합성에 도달하면 세포를 계대합니다. 24웰 플레이트에서 각 웰에 70, 000개의 HeLa 세포를 놓습니다. 형질감염 24시간 전에 세포를 그물로 삼아 약 90% 융합성.

500나노그램의 플라스민과 1.5마이크로리터의 형질감염 시약을 각각 25마이크로리터의 환원 혈청 배지에 희석합니다. 희석된 DNA를 추가하고 희석된 형질감염 시약을 1:1 비율로 수행합니다. 잘 섞고 5분 동안 배양합니다.

하루 전에 앉아있는 세포에 혼합물을 첨가하고 교반하여 즉시 DNA 지질 복합체를 혼합합니다. 세포가 80-90% 합류하는지 확인합니다. 세포를 섭씨 37도에서 가습된 5%CO2 반구에서 40-4시간 동안 배양한 후 면역세포화학을 진행합니다.

우리는 시중에서 이용 가능한 요소를 사용합니다. 자세한 내용은 재료 표에서 확인할 수 있습니다. 이들의 형질감염 효능은 50%입니다 형질감염의 성공 및 표적 단백질의 발현은 세포에 프라스미드를 발현하는 냉동 단백질을 형질감염시키고 서양 혈액을 전도하여 표적 단백질의 발현을 시각화함으로써 결정할 수 있습니다. 배양 후 PBS로 세포를 두 번 세척하여 남아 있는 배지를 제거합니다.

세척은 플레이트 또는 오비탈 셰이커를 흔들어 수행할 수 있습니다. PBS에 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정하십시오. 파라포름알데히드는 독성이 있습니다.

적절한 취급 지침을 사용하십시오. 세포를 실온에서 15분 동안 그대로 둡니다. 다음으로 고정 시약을 폐기합니다.

PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. Triton 시약을 도포한 다음 세포를 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다. 0.3% 농도의 PBS에서 Triton X 400을 사용했습니다. 10분 후 Triton 시약을 폐기합니다.

PBS를 첨가하여 세포를 한 번 세척합니다. 다음 단계에서는 PBS에 10% 소 태아 혈청을 사용하여 차단을 수행하고 세포를 실온에서 한 시간 동안 방치하고 차단 시약을 제거합니다. 그런 다음 PBS를 첨가하여 세포를 한 번 세척합니다.

희석된 환자 혈장을 세포에 첨가합니다. 사용하기 전에 PBS에서 1 대 5, 000 희석의 비율로 환자 혈장을 희석하십시오. 희석을 조정하여 신호를 향상시키거나 필요에 따라 배경을 줄여 편견 없는 결과를 보장합니다.

직원은 테스트를 수행했지만 어떤 샘플이 환자의 것이고 어떤 샘플이 건강한 개인의 것인지 전혀 알지 못했습니다. 샘플을 섭씨 4도에서 12-16시간 동안 배양합니다. 잠복기 후, 환자의 샘플을 제거하고 PBS로 세포를 세 번 세척합니다.

희석된 양 고추냉이 과산화효소 접합 염소, 항인간 IgG로 PBS에서 1 대 250 희석의 비율로 세포를 처리합니다. 세포를 실온에서 한 시간 동안 그대로 두십시오. 한 시간 후 2차 항체를 폐기합니다.

PBS로 세 번 헹굽니다. 세포를 세척한 후 웰당 300마이크로리터 DAB 작업 용액으로 세포를 염색합니다. DAB 작업 용액은 제조업체의 지침에 따라 DAB 프로모션 농축액 및 DAB 희석제가 누락되어 준비됩니다.

세포를 5분 동안 염색한 후 염료를 제거합니다. 염료를 제거한 후 이온화된 증류수로 헹구고 5분간 흔듭니다. 희석된 헤마톡신으로 세포핵을 대조염색합니다.

우리는 10 희석 배에 hemotoxin을 사용합니다. 염색 과정을 위해 5분 동안 기다리십시오. 5분 후 헤모톡신을 폐기한 다음 분석된 증류수로 각각 5분씩 2회 세척합니다.

마지막 단계, 광학 현미경으로 염색 결과를 관찰합니다. 항-MDA5 자가항체에 대한 면역세포화학 분석 결과를 해석해 보겠습니다. 긍정적인 결과.

진양성은 MDA5를 발현하는 HeLa 내부에 강한 갈색 염색을 나타냅니다. 이것은 환자 샘플에서 항-MDA5 자가항체를 확인합니다. 부정적인 결과.

음성 결과는 갈색 염색이 없는 HeLa 세포를 나타내며, 이는 항-MDA5 자가항체가 없음을 나타냅니다. 위양성 결과입니다. 결정적으로, 위양성은 MDA5 발현에 관계없이 모든 세포에서 광범위한 갈색 염색을 나타냅니다.

오진을 피하기 위해 자가면역 질환에서 나타나는 이러한 비특이적 염색은 진양성과 구별되어야 합니다. 우리의 방법은 항-MDA5 장기 항체를 검출하는 더 빠르고 안전하며 비용 효율적인 방법을 제공합니다. 이는 간질성 폐질환 관리에서 환자 결과에 상당한 영향을 미칠 가능성이 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 면역세포화학 절차를 수행하는 방법과 테스트 결과와 관련된 임상을 식별하는 방법을 배웠을 것입니다.