비유전적 광학 자극을 통한 Ca²⁺ 전파를 연구하기 위한 심장 미세생리학적 시스템

이 연구는 재료 기반 광자극 방법을 통합하여 체외 심장 미세생리학적 모델을 발전시키는 것을 목표로 합니다. 수명 및 자극 침습성의 한계를 극복하고, 심장 생리학을 연구하고, 약물 스크리닝 프로세스를 개선하고, 질병 모델링의 응용 프로그램을 육성하기 위한 신뢰할 수 있는 도구를 제공하는 데 중점을 둡니다. 최근 생체 자극 레버리지의 발전은 정밀한 비침습적 세포 제어와 같습니다.

광유전학은 유전자 변형을 통해 세포 활동을 조절할 수 있게 하며, 새로운 물질 기반 광변환기는 비유전적 대안을 제공합니다. 이 혁신은 다양한 응용 분야에서 뉴런, 심근세포 및 골격근 세포를 연구하고 조절하는 데 중요한 돌파구를 제공합니다. 현재 실험적 과제에는 심부 조직으로의 일관된 광 전달, 광변환기의 생체 적합성 및 안정성 최적화, 광 기반 자극 기술의 정밀도 개선이 포함됩니다.

또한 이러한 방법을 복잡한 생물학적 시스템과 통합하면서 세포의 생존력과 기능을 유지하는 것은 여전히 중요한 장애물로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 심장 미세생리학 모델에서 비침습적 정밀 자극 기술의 필요성에 대한 연구 격차를 해결합니다. Ziapin2와 같은 재료 기반 광 변환기를 사용함으로써이 접근 방식은 기존 전기 자극 및 광 유전학의 한계를 극복하여 조직의 생존력과 기능을 보존하면서 향상된 시간 및 공간 윤곽을 제공합니다.

저의 연구 결과는 심장 조직의 세포 활동을 더 정밀하게 제어하고 제어하는 비침습적 물질 기반 광 자극 기술을 도입하여 연구를 진전시킬 것입니다. 이 접근 방식은 유전자 변형의 필요성을 제거하여 심장 기능을 모델링하고, 질병 메커니즘을 연구하고, 보다 효과적인 치료 전략을 개발하기 위한 다재다능한 도구를 제공합니다. 시작하려면 1mm 두께의 투명하고 긁힘 및 자외선에 강한 아크릴 시트에 흰색과 파란색의 두 겹의 실험실 테이프를 부착합니다.

의도한 디자인에 따라 테이프의 칩 패턴을 자른 다음 이산화탄소 레이저 조각기를 사용하여 아크릴 시트를 원으로 자릅니다. 핀셋을 사용하여 가장 안쪽 선 안쪽의 두 겹의 테이프를 제거합니다. 칩을 순수 표백제에 30분에서 1시간 동안 담가 굵은 선과 검은 반점이 절단되지 않도록 하고 날카로운 선을 남기고 하룻밤 또는 최소 3시간 동안 흐르는 탈이온수를 넣은 비커에 칩을 헹굽니다.

깨끗한 70% 에탄올에서 30분 동안 라인 홈 기능을 사용하여 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 스탬프에서 칩을 10분 동안 초음파 처리합니다. 칩과 스탬프를 후드 아래의 깨끗한 곳으로 옮기고 약 1-2시간 동안 공기 흐름에서 건조시킵니다. 다음으로, 갓 준비한 젤라틴을 15분 동안 초음파 처리한 다음 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 65도의 수조에 다시 넣습니다.

캡이 약간 느슨해진 상태에서 미생물 트랜스글루타미나제 또는 MTG 튜브를 건조기에 넣고 진공 청소기를 천천히 켜서 기포를 제거합니다. 가스를 제거한 후 MTG 튜브를 섭씨 37도의 수조로 되돌립니다. 그런 다음 깨끗한 파라필름으로 그리드 시트를 덮고 칩을 그리드에 놓습니다.

PDMS 스탬프를 사용할 수 있도록 근처에 보관하십시오. 젤라틴 용액 5ml에 MTG 5ml를 넣고 거품이 생기지 않도록 조심스럽게 피펫팅합니다. 이제 약 0.5ml의 젤라틴 혼합물을 각 칩에 빠르게 분취하여 혼합물이 칩 영역을 덮도록 합니다.

라인 패턴의 PDMS 스탬프를 맨 위에 놓고 젤라틴이 조직의 세로 축과 평행하게 패턴화되도록 200g의 무게를 적용합니다. 모든 칩이 성형되면 유리병으로 덮어 환경 방해를 피하고 밤새 가교할 수 있도록 합니다. 칩과 PDMS 스탬프를 PBS로 채워진 새 P150 접시에 옮겨 30분에서 1시간 동안 젤라틴을 수화시켜 칩에서 PDMS 스탬프를 쉽게 분리할 수 있도록 합니다.

칩 주변의 과도한 곰팡이가 없는 젤라틴을 제거한 후 깨끗한 칩을 PBS로 채워진 새 P150 접시로 옮깁니다. PDMS 스탬프를 70% 에탄올에 보관하십시오. 칩을 살균하려면 후드 아래에서 10분 동안 에탄올에 담그십시오.

칩을 PBS로 옮기고 10분 동안 담근 다음 PBS를 세 번 세척합니다. 코팅 용액의 경우, 밀리리터 피브로넥틴 당 20마이크로그램을 보충제 없이 배양 배지에서 1-100 희석된 Geltrex와 혼합합니다. 이 용액으로 칩을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터에서 2시간 동안 코팅합니다.

10 마이크로몰 Y-27632를 함유하는 RPMI 배지에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포를 해동하고 파종합니다. 24시간 후에 매체를 Y-27632가 없는 RPMI로 교체합니다. 세포 파종 3일 후 핀셋을 사용하여 칩에서 흰색 테이프를 조심스럽게 제거합니다.

고속 카메라와 200밀리와트 수은 램프를 여기 광원으로 장착한 개조된 탠덤 렌즈 현미경으로 구성된 광학 매핑 장치를 준비합니다. 지정된 칼슘 이미징 카메라 앞에 이색성 거울을 놓습니다. 광학 페이싱의 경우 LED 광원을 사용하여 조직의 한쪽 끝에 광학 점 자극을 적용하여 광변환기인 Ziapin2를 자극합니다.

조직에서 1mm 떨어진 곳에 위치한 시간적으로 조절되는 광섬유를 통해 0.5 또는 1헤르츠의 주파수로 조직의 페이스를 조절합니다. 배양 배지에 2마이크로몰 X-Rhod-1을 첨가하여 섭씨 37도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 칩을 신선한 배양 배지로 세척한 후 B-27 마이너스 인슐린 및 HEPES를 보충한 페놀 레드가 없는 RPMI 1640 배지로 옮깁니다.

생리적 온도로 설정된 온도 조절 접시에 조직 칩을 넣고 초당 2.5프레임의 프레임 속도로 녹화를 시작합니다. 칼슘파 전파는 0.5 또는 1 헤르츠 주파수에서 광자극 중 명확한 공간 및 시간 해상도로 성공적으로 시각화되었으며, 전도 속도는 생리학적 값과 일치하는 초당 약 4.5cm로 계산되었습니다. 진폭, 상승 시간, 최대 감쇠, 기울기 및 감쇠 시간을 포함한 칼슘 과도 매개변수는 광 자극과 전기 자극 간에 정량적으로 유사하여 유사한 기능적 반응을 확인했습니다.