오보에 위치 환자 유래 급성 림프구성 백혈병(ALL) 세포의 이종이식 (PDX-ALL)

이 연구의 범위는 암 치료를 위한 치료 전략을 식별하는 데 중점을 둔 암 생물학입니다. 난자 내 환자 유래 이종이식 급성 림프구성 백혈병 모델은 약 10일의 상대적으로 짧은 실험 기간에 의해 제한되어 급성 림프구성 백혈병 진행 또는 이 기간 이후의 약물 반응에 대한 장기 연구가 제한됩니다. 이 프로토콜은 B 세포 및 T 세포 계통을 포함하여 환자 유래 급성 림프구성 백혈병 세포의 난자 이종이식을 위한 신속하고 비용 효율적인 방법을 확립합니다.

이 프로토콜은 백혈병 연구에서 전임상 약물 스크리닝, 기계론적 연구 및 잠재적으로 맞춤형 의학 접근법을 위한 유망한 도구를 나타냅니다. 전임상 적용을 위해 확립된 난자 이종이식 모델을 사용하는 타당성을 탐구할 것입니다. 시작하려면 조달한 계란을 습도 약 50-60%, 온도가 섭씨 39도로 설정된 가습 롤링 인큐베이터로 옮깁니다.

수정 후 10일 동안 이 인큐베이터에서 알을 부화시킵니다. 혈액 샘플을 멸균 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 두 부피의 PBS를 사용하여 각 샘플을 세 번 희석합니다. 밀도 구배 배지와 함께 샘플을 원심분리한 후, 계면에서 단핵 세포의 버피 코트 층을 수집하여 새로운 멸균 15밀리리터 튜브로 옮깁니다.

튜브에 PBS 10밀리리터를 넣고 튜브를 300G에서 5분 동안 원심분리하여 남은 혈청 성분을 제거합니다. 10% FBS가 보충된 RPMI 1640 배지에 펠릿화된 세포를 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.

FBS에서 10% DMSO로 구성된 동결 배지에 세포를 재현탁합니다. 트리판 블루 배제 분석을 사용하여 세포 생존력을 평가하고 세포를 섭씨 영하 80도에서 동결하고 액체 질소에 보관합니다. 다음으로, Lipofectamine 3000을 사용하여 150만 개의 HEK 293 T 세포를 원하는 플라스미드 벡터로 공동 형질감염시키고 형질감염된 세포를 2일 동안 배양합니다.

우물에서 렌티바이러스가 포함된 상청액을 채취하고 0.45마이크로미터 필터를 통해 여과하여 잔해물을 제거합니다. 여과된 바이러스 상청액을 원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 2시간 동안 20, 000G에서 원심분리합니다. 라벨링을 위해 B 세포 전구체 SEM 및 T 세포 MOLT3 세포주와 환자 유래 B 또는 T 급성 림프구성 백혈병 세포의 밀리리터당 100만 개의 세포를 10% FBS가 포함된 RPMI 1640이 포함된 6웰 플레이트에 플레이트합니다.

형광 현미경으로 mCherry 표지 세포를 시각화합니다. 10일째에 빛 아래에서 병아리 배아의 맥관 구조를 검사하여 배아 생존력을 평가하고 각 난자의 표면을 70% 에탄올로 부드럽게 씻습니다. 핸드 드릴을 사용하여 각 알의 공기 셀에 구멍을 뚫어 직경 약 2cm의 작은 창을 만듭니다.

생성된 창을 투명 접착 테이프로 밀봉하고 계란을 5% 이산화탄소 인큐베이터에 다시 넣습니다. 11일째에 34게이지 바늘을 사용하여 1,000만 mCherry 표지된 급성 림프구성 백혈병 세포를 발달 중인 배아의 혈관에 주입합니다. 창을 밀봉한 후 난자를 5% 이산화탄소 인큐베이터로 되돌리고 매일 배아 생존력을 모니터링합니다.

15일째에 배아에서 혈관을 해부합니다. 유리 슬라이드 위에 놓고 형광 기능이 장착된 해부 현미경을 사용하여 성공적인 이종이식편을 촬영합니다. 32게이지 바늘이 달린 멸균 주사기를 사용하여 닭 배아의 맥관 구조에서 혈액을 채취합니다.

혈액을 헤파린이 들어 있는 1.5밀리리터 멸균 튜브에 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 226G에서 원심분리합니다. B 세포 급성 림프구성 백혈병 세포를 인간 FITC CD10 및 인간 PE CD19 항체로 라벨링하고 T 세포 급성 림프구성 백혈병 세포를 섭씨 4도에서 30분 동안 암울한 곳에서 30분 동안 인간 FITC CD4 및 인간 PE CD8 항체로 표지합니다. 1%BSA를 함유한 PBS를 사용하여 표지된 세포를 2회 세척하고 유세포 분석을 사용하여 분석합니다. 주사 4일 후 SEM 및 MOLT3 세포주에 의한 혈관 집락화가 명확하게 보였으며, 이는 발달 중인 닭 배아 맥관 구조에 성공적인 생착을 확인했습니다.

환자 유래 B-all 및 T-all 세포는 주사 후 4일에 혈관에서 강한 형광 신호를 보였으며, 이는 맥관 구조에서 활발한 집락화 및 증식을 나타냅니다. 유세포 분석법은 주사 후 6시간 동안 수집된 대조군에 비해 주사 후 4일에 SEM 및 환자 유래 B-all 세포를 주입한 배아에서 CD10/CD19 양성 세포의 유의한 증가를 보여주었습니다. 유사하게, CD4/CD8 양성 세포는 주입 후 4일에 MOLT3 및 환자 유래 T-all 세포를 주입한 배아에서 유의하게 더 높았습니다.