배근 신경절 배양의 체외 모델 확립: 암-신경 누화 조사를 위한 보완적 접근 방식

우리의 연구는 3D 후근 신경절 또는 DRG 외식편과 2D 해리 배양을 사용하여 신경 유도 종양 이동을 정량화하고 상호 작용을 제한하기 위한 분자 전략을 테스트하는 암-신경 누화에 중점을 둡니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 상호보완적인 3D 및 2D DRG 배양을 확립하고 신경돌기 성장을 최적화했으며 신경돌기 확장을 따라 암세포 침범의 증가를 입증했습니다. 우리는 단일 마우스에서 보완적인 2D 및 3D DRG 배양을 생성하여 복잡한 세포 수준 상호 작용과 온전한 신경 구조를 모두 포착하는 재현 가능한 모델의 부족을 해결했습니다.

우리의 프로토콜은 단일 마우스에서 쌍을 이루는 3D 외식편과 2D 뉴런 배양을 생성하여 각진 질감을 보존하고, 고함량 이미징을 가능하게 하고, 동물 사용을 줄이고, 한 번의 실험으로 조직 수준 및 단일 세포 데이터를 얻을 수 있도록 합니다. 우리의 모델은 DRG가 생성한 요인이 침범을 유도하는 것, 뉴런 활동, 연령 및 유전자형이 이를 어떻게 형성하는지, 신경영양 인자 수용체를 표적으로 삼는 것이 신경돌기 유도 암 확산을 감소시킬 수 있는지 여부에 대한 질문을 열었습니다. 시작하려면 안락사된 쥐를 복부에 눕히십시오.

털을 면도하고 척추 위의 영역에 초점을 맞춰 등쪽 표면을 노출시킵니다. 동물의 등에 70% 에탄올을 뿌립니다. 종이 타월을 사용하여 꼬리부터 두개골까지 닦아 느슨한 털을 제거하고 해부 중 오염을 방지합니다.

멸균 된 가위로 꼬리에서 두개골까지 등쪽 정중선을 따라 직선 절개를합니다. 뭉툭한 겸자를 사용하여 절개 부위 양쪽의 피부를 집어넣어 척추를 노출시킵니다. 이제 오염을 피하기 위해 새 가위와 집게를 사용하고 척추 끝을 수평으로 절개합니다.

그런 다음 척추의 양쪽에 두 개의 평행한 세로 절개를 하여 척추를 풀어줍니다. 집게를 사용하여 척추를 부드럽게 들어 올리고 주변 결합 조직을 제거합니다. 척추를 완전히 풀려면 두개골 근처의 척추 상단을 절개합니다.

척추 기둥을 얼음 위에 보관된 페니실린 스트렙토마이신과 함께 HBSS가 들어 있는 사전 냉각된 10cm 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 스프링 가위를 사용하여 척추에서 남아 있는 결합 조직을 제거하고 척추뼈를 노출시킵니다. 트리밍된 척추를 현미경 스테이지로 옮깁니다.

스프링 가위를 사용하여 시상면을 따라 기둥을 조심스럽게 쪼개십시오. 끝이 가는 집게를 사용하여 기둥에서 척수를 제거하여 척수 신경 뿌리를 따라 후근 신경절을 드러냅니다. 스프링 가위를 사용하여 척수 신경을 자릅니다.

그런 다음 후근 신경절에서 주변 결합 조직을 제거합니다. 끝이 가는 집게를 사용하여 등근에서 후근 신경절을 부드럽게 추출합니다. 전체 마운트 배양의 경우, 얼음 위에 보관된 페니실린 스트렙토마이신과 함께 HBSS가 들어 있는 3cm 플레이트에 DRG를 넣습니다.

미리 냉각된 피펫 팁을 사용하여 얼음 위의 10cm 플레이트 내부에 놓인 8웰 유리 바닥 슬라이드의 각 웰에 2마이크로리터의 냉각된 마트리겔을 분배합니다. 조기 중합을 방지하려면 한 번에 하나의 물방울만 피펫팅하십시오. 다음으로, 끝이 가는 집게를 사용하여 하나의 후근 신경절을 마른 판에 놓습니다.

부드럽게 소용돌이치어 과도한 HBSS를 제거합니다. 그런 다음 깨끗한 등근 신경절을 Matrigel 방울로 옮깁니다. 모든 신경절을 물방울로 옮긴 후, 유리 바닥 슬라이드를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5분 동안 배양하여 마트리겔이 중합되도록 합니다.

다음으로, 200마이크로리터의 따뜻한 보충 배양 배지를 각 웰에 조심스럽게 추가합니다. 슬라이드를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 배양합니다. 명시야 현미경을 사용하여 신경 성장 및 생존 가능성을 위해 매일 후근 신경절을 모니터링합니다.

고립된 후근 신경절이 들어 있는 15밀리리터 원뿔형 튜브를 실온에서 5분 동안 200G에서 원심분리합니다. HBSS를 피펫팅한 후 미리 예열된 보충 배지로 신경절을 헹구고 부드럽게 두드립니다. 그런 다음 튜브를 200G에서 5분 동안 원심분리하여 DRG를 펠릿화합니다.

배지를 1밀리리터의 파파인 용액으로 교체합니다. 부드럽게 혼합하고 조직 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 20분 동안 배양하고 5분마다 부드럽게 교반합니다. 그런 다음 파파인을 중화시키기 위해 보충된 배지 10밀리리터를 첨가하고 부드럽게 섞습니다.

400G에서 5분 동안 원심분리하여 후근 신경절을 펠릿화합니다. 상청액을 피펫팅한 후, Dispase II 용액에 콜라게나제 IV형 1밀리리터를 첨가하고 다시 배양합니다. 효소 용액을 중화시키기 위해 보충된 배지 4.5밀리리터를 첨가하고 부드럽게 혼합한 다음 원심분리합니다.

상청액을 피펫팅한 후 보충된 배지 5밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 Dnase I을 첨가하여 밀리리터당 0.2mg의 최종 농도에 도달합니다. 이제 후근 신경절이 느슨한 덩어리로 나타나야 하며 이는 완전한 소화를 나타냅니다.

기계적 해리를 위해, 1, 000 마이크로리터 필터 피펫 팁을 사용하여 위아래로 4-5 번 피펫팅하여 신경절 용액을 분쇄하십시오. 200마이크로리터 피펫 팁으로 전환하고 4-5회 피펫팅하여 분쇄를 반복합니다. 생성된 탁한 현탁액을 70마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 50밀리리터 원추형 튜브로 걸러냅니다.

그런 다음 세포가 완전히 전달되도록 10밀리리터의 배지로 스트레이너를 점차적으로 헹굽니다. 여과된 세포 현탁액을 1, 000G에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 펠릿에서 배지를 제거하고 세포 펠릿을 500마이크로리터의 보충된 배지에 재현탁합니다.

8웰 유리 바닥 슬라이드의 웰에서 잔류 PBS를 제거합니다. 해리된 후근 신경절 현탁액을 콜라겐 코팅 우물에 분배하고 배양합니다. 명시야 현미경을 사용하여 매일 후근 신경절 유래 세포를 모니터링하고 세포 생존력 및 신경 성장을 평가합니다. 전체 마우스 신경절을 암세포와 공동 배양하기 위해 먼저 8웰 유리 바닥 슬라이드의 전체 마운트 DRG 배양에서 배지를 흡인합니다.

피펫을 사용하여 200마이크로리터의 암세포 현탁액을 Matrigel 방울과 후근 신경절이 들어 있는 웰에 부드럽게 추가합니다. 공동 배양 슬라이드를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5% 이산화탄소와 함께 배양합니다. 200마이크로리터의 따뜻한 보충 배지로 한 번 세척하고 300마이크로리터의 신선한 배지를 추가하여 매일 배지를 새로 고칩니다.

해리된 신경절과 암세포의 공동 배양을 위해, 8웰 유리 바닥 슬라이드에서 해리된 DRG 배양물에서 배지를 흡인합니다. 그런 다음 배양하기 전에 200마이크로리터의 암세포 현탁액을 각 웰에 부드럽게 분배합니다. DRG의 확립은 보충제가 없을 때 덜 효율적이었고 신경돌기 확장이 현저히 감소했습니다.

노령 동물의 전체 마운트 DRG는 신경돌기 확장이 적고 구별이 더 잘되고 신경교세포가 최소화되어 신경암 세포 상호 작용의 시각화를 용이하게 했습니다. 두 가지 효소 단계를 사용하여 DRG 뉴런을 해리하면 뉴런 회복률이 높아졌습니다. 배양 후 24시간 이내에 슈완 세포, 대식세포, 섬유아세포 등 비신경세포가 뚜렷해졌고, DRG 유래 세포에서 신경돌기가 발아하는 것이 관찰되어 72시간 후에 더욱 증가하였다.

Matrigel 코팅 트랜스웰 삽입물에 파종된 암세포는 배양 24시간 후 HEC293 세포를 향해 침범했지만 DRG 뉴런을 향해서는 침범하지 않았습니다. Matrigel 액적에 담근 전체 마운트 DRG 배양은 신경돌기가 매트릭스를 통해 주변을 향해 바깥쪽으로 확장되도록 허용했습니다. DRG를 물방울 중앙에 신중하게 배치하여 경계를 과도하게 늘리지 않고 최대 신경돌기 확장을 제공합니다.

암세포는 DRG를 포함하는 Matrigel 물방울의 경계 주위에 12시간 동안 공동 배양한 후 정착했습니다. 72시간의 공동 배양 후, 암세포는 마트리겔을 침범하여 신경절 쪽으로 이동했으며, 후근 신경절 세포 확장과 암세포 사이의 직접적인 상호 작용이 관찰되었습니다. 해리된 DRG 유래 세포와 암세포의 공동 배양을 통해 개별 세포 상호 작용을 자세히 시각화할 수 있었습니다.