2025년 10월 28일
IBEX(Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity)는 헤파린 차단을 추가하여 비특이적 결합을 최소화하고 스펙트럼 검출과 전산 혼합 해제를 활용하여 자가형광을 억제함으로써 기본 IBEX 기술을 기반으로 합니다. 이 접근 방식은 배경 소스를 줄이면서 이미지 획득을 가속화하여 강력한 다라운드, 고파라미터 공간 단백질체 분석을 가능하게 합니다.
호산구가 풍부한 인간 조직에서 헤파린 차단과 스펙트럼 검출을 결합한 IBEX 워크플로우를 최적화하여 배경 억제를 수행합니다. 자가형광과 호산구 과립 결합은 진짜 신호를 가립니다. 우리는 두 가지 모두 깨끗한 고해상도 플렉스 맵을 가능하게 하기 위해 목표로 하고 있습니다.
먼저, 자궁경부펜으로 유리 슬라이드에 부착된 조직 주위에 원을 그려 소수성 장벽을 만듭니다. 각 조직에 약 100마이크로리터의 PBS를 추가하여 재수화시키고, 슬라이드를 실온에서 약 2분간 배양하여 최적의 절단 온도 화합물을 씻어냅니다. 흡착 유리 파스퇴르 피펫을 사용해 조직 주변에서 PBS를 흡인하세요.
그 다음 각 조직에 블로킹 버퍼 100마이크로리터를 추가하고, 실온의 습도 챔버에서 1시간 동안 배양합니다. 이제 피펫을 사용해 차단 버퍼를 흡입하세요. 각 조직에 100마이크로리터의 염색제를 섞고, 냉장고 안의 덮개가 있는 습도 챔버에서 4도 섭씨 온도에서 하룻밤 동안 배양합니다.
마찬가지로, 하나의 형광체만 염색하고 염색 없는 음성 대조군으로 형광체 스펙트럼과 조직 자가형광을 정의하는 절편을 준비합니다. 스테인 혼합물을 흡입한 후에는 PBS로 조직을 세 번 세척하고, 각 세척 후 액체를 흡입하세요. 샘플을 현미경에 장착해 영상 촬영을 하세요.
밝은 필드 또는 차등 간섭 대비 모드를 사용하여 시료에 초점을 맞추세요. 그 후 형광 모드로 전환하고 실험 요구사항에 따라 스펙트럼 획득 매개변수를 설정합니다. 실험에 사용된 형광체에 맞는 레이저를 할당하세요.
선택한 레이저 라인에 맞는 빔 스플리터를 선택하세요. 모든 검출기가 전체 방출 스펙트럼을 포착할 수 있도록 하고, 이미지 획득 해상도를 미리 정의된 해상도 중 하나로 조정합니다. 또는 최대 해상도를 선택하세요.
최적의 광학 단면화를 위해 핀홀 크기를 1면적 단위로 조정하세요. 획득 전에 레이저 설정을 최적화하세요. 모든 마커로 염색한 단면을 사용하고, 낮은 레이저 출력에서 연속 스캐닝 모드를 시작하세요.
각 검출기의 마스터 이득과 레이저 세기를 조절하여 모든 마커가 신호 대 배경 비율로 식별될 수 있도록 합니다. 레이저 세기를 미세 조정하고 단일 염색과 다중 염색 구간을 반복적으로 교차하여 모든 형광체 신호가 과포화 없이 보이도록 합니다. 획득 소프트웨어에서 타일 기능을 활성화하고, 조직 주변의 타일 획득 영역을 정의하여 완전한 이미지 커버리지를 보장합니다.
조직 중앙의 타일 획득 영역에 초점을 최적화하세요. 식별 가능한 배열의 독특한 구조적 특징을 식별하여 이후 영상 검사에서 정렬 기준으로 삼으세요. 이제 Z-스택 기능을 활성화하고 Z-스택 탭으로 이동하세요.
중앙 탭 아래에서 슬라이스 수를 최소 6개로 설정하고, 슬라이스 간격은 최소 1마이크로미터로 설정하세요. 중앙 버튼을 클릭해 이전 단계에서 결정한 현재 초점 지점을 스택의 중간 단면으로 설정하세요. 실험 시작 버튼을 클릭하여 이미지 획득을 시작하세요.
획득이 완료되면 이미지 썸네일을 우클릭하고 '다른 이름으로 저장'을 선택하세요. 파일 위치를 선택하고 이미지 이름을 지정하세요. 이미지 데이터를 안전한 저장소로 백업하세요. 타일 영역 획득 시 적용한 최적화된 설정으로 이미지를 언믹스합니다.
각 단일 염색 대조군에서 스냅을 캡처하여 진짜 신호 스펙트럼을, 비염색 대조군에서 배경 또는 자가형광을 포착합니다. 이 이미지들은 오직 스펙트럼 언믹싱에만 사용하세요. 염색되지 않은 대조군의 강도와 형태가 없거나 배경 수준과 동등한지, 그리고 마커의 위치가 막, 핵, 세포질, 분비 분포 등 예상 세포 패턴과 일치하는지 확인하여 선택된 영역이 진정한 신호임을 확인합니다.
소프트웨어에서 스냅 이미지를 열어보세요. 언믹싱 탭을 클릭하고 unmixed 도구 탭 내 지역 선택 도구 중 하나를 선택한 후, 긍정적인 신호 주위에 관심 영역이나 ROI를 그려 해당 영역의 스펙트럼을 생성합니다. 생성된 각 스펙트럼을 해당 형광포자의 이론적 방출 스펙트럼과 비교하세요.
해당 지역이 실제 신호를 정확히 반영하는지 확인하세요. 각 스펙트럼을 형광체 동일성에 따라 명명하고, 이를 스펙트럼 데이터베이스에 저장하세요. 다음으로 타일 이미지를 불러오고 혼합 제거 도구를 엽니다.
플러스 버튼을 사용해 각 형광체의 기준 스펙트럼을 혼합 목록에 추가하세요. 선형 언믹싱 버튼을 클릭하여 스펙트럼 신호를 분리하고 혼합되지 않은 이미지를 저장하세요. 표백 용액을 연기통에 준비하세요.
마이크로 주걱을 사용해 10밀리그램의 붕소 리튬을 건조 비커에 직접 무게를 젬다. 초순수 10밀리리터를 조심스럽게 비커에 넣고 화합물이 완전히 녹을 때까지 섞으세요. 각 조직 부위에 약 100마이크로리터의 신선 표백 용액을 유리 파스퇴르 피펫으로 첨가하고, 슬라이드를 실온에서 15분간 훈기 후드 안에서 배양합니다.
만약 밝은 보라색이 표백되면 슬라이드를 조심스럽게 에피형광 현미경으로 옮기고 다피 필터를 선택하세요. 샘플을 집중시키고 최대 출력으로 조명하세요. 이제 5배 대물렌즈를 사용해 더 넓은 조명 시야를 얻고, 슬라이드와 대물렌즈 또는 하우징 사이의 접촉을 완전히 차단하기 위해 스테이지를 완전히 낮추세요.
마지막으로, 유리 파스퇴르 피펫을 사용해 각 웰에서 붕소화리튬 용액을 디캔트한 뒤, 원래 표백 용액 비커로 다시 가져갑니다. 슬라이드를 희석 완충제로 세 번 세척하고, 각 세척 동안 약 3분간 배양하세요. 항체 혼합물을 넣고 앞서 보인 대로 샘플을 염색하세요.
치료받지 않은 비강 용종 조직에서 CD3, CD4, CD20 염색은 호산구 풍부한 부위에서 강한 비특이적 과립형 형광을 보였습니다. 반면, 진정한 막 국소화 신호는 낮은 강도에서 존재했습니다. 5% 탈지분유 전처리는 비특이적 형광을 완전히 차단하지 못했고, AF 532와 같은 형광체의 신호 강도도 감소시켰습니다.
댑 전처리 시술은 CD20, CD3, CD4의 비특이적 형광을 감소시켰으나, DAPI와 AF 532를 포함한 여러 채널에서 진정한 신호 강도를 감소시켰습니다. 헤파린 전처리는 CD3, CD4, CD20, DAPI에 대해 높은 신호 강도를 유지하면서 비특이적 결합을 효과적으로 차단했습니다. 헤파린은 농도에 따라 비특이적 신호를 차단하여 10단위에서 완전한 억제를 달성했고, 높은 농도에서는 부정적인 영향이 관찰되지 않았습니다.
3트랙 영상 장치는 획득 시간을 단축시켰지만, AF 594가 PE 채널로 침출되는 등 교차 현상을 유발하고, 다중 레이저 여기로 인한 조직 자가형광 증진을 포함했습니다. 스펙트럼 이미징은 거의 모든 배경 및 크로스토킹을 제거하면서 획득 시간을 단축하고 신호 대 배경 비율을 개선했습니다. 인간 비강 용종의 스펙트럼 IBEX 영상 검사에서 EpCAM으로 표시된 상피 구조가 확인되었습니다.
CD3 양성 및 CD20 양성 림프구와 같은 면역 세포, CD31 및 CD34를 발현하는 혈관이 포함됩니다. 헤파린 처리는 신호를 감소시키지 않고 과립 결합을 제거하여 IBEX 주기 전반에 걸쳐 강한 배경 억제를 유지했습니다. 스펙트럼 언믹싱은 블리드 스루를 최소화하고, 자가형광은 배경 신호를 증가시키며, 다중 트랙 공초점 촬영에 비해 다중 패널 획득 속도를 크게 높입니다.
이를 통해 견고한 공간 단백질체학과 도전적인 조직이 가능하여 정확한 세포 상태 지도 작성과 이웃 수준 분석을 지원합니다.
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본 연구는 헤파린 차단 및 스펙트럼 검출을 통합하여 호산구가 풍부한 인간 조직에서 신호의 명확성을 향상시킴으로써 IBEX 워크플로우를 최적화합니다. 이 접근법은 자가형광 및 비특이적 결합을 억제하여 고파라미터 공간 단백질체학 분석을 용이하게 하는 것을 목표로 합니다.
High-plex spectral confocal imaging with IBEX enables robust spatial proteomics in tissue environments where autofluorescence and non-specific staining have previously limited data quality. By integrating heparin blocking and spectral unmixing, this workflow delivers high-dimensional, single-cell resolution maps critical for target validation and mechanistic de-risking in complex human tissues. The approach accelerates early discovery and supports confident advancement decisions in translational and preclinical research pipelines.
This optimized spectral IBEX workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by enabling high-content, spatially resolved analysis in complex tissue systems.