약물 스크리닝을 위한 3차원 뇌종양 스페로이드의 대사 프로파일링의 발전

여기에서 우리는 세포외 플럭스 분석을 통해 3차원(3D) 신경아교종 스페로이드와 이미징 기반 정규화를 통합하는 대사 프로파일링 플랫폼을 구축합니다. 이 접근법을 통해 약물 치료에 대한 종양 대사 반응을 보다 정확하게 평가할 수 있으며 잠재적인 내성 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

이 연구는 임상 관련 모델에서 세포 행동 대사 활동 및 약물 반응에 초점을 맞춰 Seahorse 기술을 사용하여 에너지 대사를 연구하기 위한 3D 세포 세포 뿌리 형성을 최적화하는 것을 목표로 합니다. 이 발견은 뇌종양을 보다 정확하게 표현하고, 치료 평가를 개선하고, 더 나은 치료 전략을 위한 대사 분석을 개선함으로써 약물 주조 모델을 향상시킬 것입니다. 이 결과는 3D 스페로이드 모델에서 에너지 대사가 어떻게 변하는지, 약물이 대사 경로에 미치는 영향, 대사 변화가 치료에 대한 종양 내성 발달에 기여하는 메커니즘을 조사할 수 있는 길을 열었습니다.

수집된 U87 세포를 DMEM에 재현탁한 후 사용하지 않은 배지를 섭씨 37도로 예열합니다. 세포 현탁액을 실온에서 30분 동안 유지합니다. 초기 세포 수를 기초하여, 10% FBS를 함유하는 DMEM으로 세포 현탁액을 최종 부피 20밀리리터로 희석하여 약 200, 000개의 세포를 확보한다.

최종 세포 현탁액을 반복적으로 반전시켜 완전히 혼합합니다. 투명한 둥근 바닥 초저부착 96웰 플레이트에 각 웰의 가장자리를 따라 200마이크로리터의 현탁액을 천천히 첨가한 다음 원심분리 중 누출을 방지하기 위해 파라필름으로 플레이트를 단단히 밀봉합니다. 밀봉된 플레이트를 원심분리기에 넣고 200G에서 2분 동안 실행하여 각 웰의 바닥에 있는 세포를 펠릿화합니다.

원심분리기에서 플레이트를 제거합니다. 파라필름을 조심스럽게 제거하고 플레이트를 5% 이산화탄소가 함유된 섭씨 37도 인큐베이터에 넣습니다. 코팅 용액을 준비하려면 5mg의 Poly-D-Lysine을 멸균수 50ml에 녹이고 완전히 녹을 때까지 용액을 완전히 혼합합니다.

대사 분석 플레이트의 각 웰에 30마이크로리터의 코팅 용액을 첨가합니다. 플레이트를 부드럽게 흔들거나 여분의 용액을 흡인하여 기포가 없는지 확인하십시오. 덮개를 씌운 상태에서 플레이트를 실온에서 20분 동안 배양한 다음 코팅 용액을 흡인하고 200마이크로리터의 멸균수로 웰을 두 번 세척합니다.

플레이트를 최소 30분 동안 자연 건조시킨 다음 이산화탄소 없이 섭씨 37도에서 30분 동안 플레이트를 가열하여 코팅을 안정화시킵니다. 그런 다음 각 웰에 175마이크로리터의 예열된 배지를 추가합니다. 세포 스페로이드 이식이 준비될 때까지 이산화탄소가 없는 인큐베이터에서 플레이트를 섭씨 37도에 보관합니다.

배양 5일 후 스페로이드 플레이트를 고함량 이미징 시스템으로 옮깁니다. 이미징 매개변수를 구성하려면 온도를 섭씨 37도로, 이산화탄소 수준을 5%로 설정합니다. 시스템 설정에서 플레이트 유형, 채널 및 초점 범위를 조정합니다. 다음으로, 10배 대물렌즈가 있는 공초점 현미경과 이미징 소프트웨어를 사용하여 스페로이드 이미지를 획득한 다음 온전한 스페로이드가 포함된 웰을 식별하고 전송할 위치를 기록합니다.

온전한 스페로이드를 페노피브레이트 치료를 위해 6개의 복제 웰이 있는 대조군과 6개의 복제 웰이 있는 치료 그룹의 두 그룹에 할당합니다. 페노피브레이트 작업 용액을 최적의 농도로 신선한 예열 배지에 준비합니다. 이미징 시스템에서 낮은 부착 플레이트가 포함된 스페로이드를 조심스럽게 제거하고 생물 안전 캐비닛 내부의 멸균 표면에 놓습니다.

전달을 위해 Poly-D-Lysine 코팅 분석 플레이트를 인접하게 배치한 다음 20마이크로리터 피펫의 끝을 다듬어 손상을 일으키지 않고 세포 스페로이드를 부드럽게 흡인할 수 있도록 합니다. 다듬어진 피펫 팁을 사용하여 웰 바닥에서 손상되지 않은 각 스페로이드를 부드럽게 흡인합니다. 각 스페로이드를 코팅된 플레이트의 해당 웰로 옮기고 20초 동안 가라앉히십시오.

3D 스페로이드 분석 플레이트를 고함량 이미징 시스템으로 옮깁니다. 형태학적 데이터를 분석하려면 텍스처 영역 모듈을 적용하여 텍스처 특징에 따라 이미지 콘텐츠를 세 개의 클러스터로 나누어 배경에서 3D 스페로이드를 대략적으로 분리합니다. 이미지 영역 찾기 모듈을 적용하여 부피 기반 크기 특성을 사용하여 사전 분리된 3D 스페로이드의 분리를 미세 조정하여 불순물을 제거하고 손상되지 않은 스페로이드를 유지합니다.

형태 특성 모듈을 사용하여 3D 스페로이드의 형태학적 매개변수를 측정합니다. 모집단 선택 모듈을 적용하여 실제 3D 세포 스페로이드만 필터링하고 유지한 다음 형태학적 데이터 결과를 내보냅니다. 스페로이드는 배양 5일째까지 눈에 띄게 형성되었으며, 관찰된 모든 샘플에서 균일한 구형 형태를 유지했습니다.

구조적 무결성이 눈에 띄게 파괴된 분해된 스페로이드도 5일째에 관찰되었습니다. 이식 후 분석에 따르면 대조군과 페노피브레이트 처리된 3D 스페로이드는 대부분의 경우 손상되지 않은 상태로 유지되었지만 일부 페노피브레이트 처리된 스페로이드는 분해되었습니다. 산소 소비율은 대조군에 비해 모든 시점에서 페노피브레이트 처리된 스페로이드에서 유의하게 감소했습니다.