뇌 오가노이드를 사용한 미토콘드리아 질환 모델링: 미토콘드리아 뇌근병증, 유산산증 및 뇌졸중 유사 에피소드에 초점

우리의 연구 범위는 미토콘드리아 질병 측정기를 이해하고 이를 치료할 약물을 찾는 것입니다. 이 기술은 오가노이드 형성을 포함하고 있음에도 불구하고 고처리량 분석을 위한 능력을 유지하는 것이 도전 과제입니다. 우선, 유도 다능성 줄기세포 배양판이 약 70%에서 80% 정도 융합했을 때 배지를 제거하세요.

세포를 PBS로 세척하세요. 세포에 효소 용액 350마이크로리터를 추가하고 배양합니다. 반응을 멈추게 하려면 스템핏 매디엄 800마이크로리터를 추가하세요.

세포 현탁액을 새 튜브로 옮긴 후, 190G에서 22도 섭씨에서 5분간 원심분리합니다. 다음으로, 1밀리리터의 분화 배지를 다시 담아 펠릿을 재현탁합니다. 세포 수를 세고 나서, U자형 96 웰 저부착판의 각 웰에 100마이크로리터 분량의 3000개 세포를 씨앗으로 심습니다.

37도에서 6일간 이산화탄소 5%를 배큐하세요. 배양 후에는 넓은 보어 피펫을 사용해 96 웰 플레이트에서 오가노이드를 10cm 접시로 옮깁니다. 새로운 96웰 플레이트의 각 웰에 보충된 DMEM/F12 매체 50마이크로리터를 피펫팅합니다.

오가노이드를 2밀리리터 튜브에 모으세요. 오가노이드를 흡인하지 않고 조심스럽게 배지를 제거하고, 보충된 DMEM/F12 배지를 1.5밀리리터 추가하세요. 마지막 세척 후 피펫팅으로 신선한 매체 500마이크로리터를 넣으세요.

그 다음 오가노이드를 10cm 접시에 옮깁니다. 각 오가노이드를 쉽게 피집하기 위해 5밀리리터의 배지를 추가하세요. 모든 오가노이드를 50마이크로리터로 설정한 마이크로피펫을 사용해 96웰 플레이트의 각 웰에 옮기고, 3일간 배큐합니다.

9일째에는 오가노이드를 2밀리리터 튜브에 모아 DMEM/F12로 세 번 세척합니다. 그 후 오가노이드를 분화 배지에 다시 현탁합니다. 웰당 약 10개의 오가노이드를 6웰 플레이트에 옮기고, 각 웰의 최종 매질 부피를 2밀리리터로 조절합니다.

플레이트를 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소로 6일간 정적으로 배양합니다. 15일째에는 오가노이드를 15밀리리터 튜브에 모으세요. 튜브가 가라앉도록 둔 후, 피펫팅 상원을 제거한 후 B27과 비타민 A를 보충한 신선한 분화 배지를 추가하세요.

웰당 약 10개의 오가노이드를 6웰 플레이트에 옮깁니다. 오가노이드를 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 15일간 정적으로 배양합니다. 배양판에 희석된 폴리-L-오르니틴 용액을 코팅합니다.

플레이트를 37도에서 하룻밤 배큐하세요. 다음 날에는 PBS로 우물을 세 번씩 각각 5분씩 세척하세요. 이제 희석된 라미닌 용액을 웰에 추가합니다.

플레이트를 37도 섭씨에서 3시간 또는 하룻밤 동안 부양하세요. 오가노이드 현탁액을 200G에서 5분간 원심분리하세요. 상원액을 제거하고 효소 용액 1밀리리터를 추가하세요.

잘 섞어 37도 섭씨에서 5분간 배화한 후 원심분리합니다. 상원액을 제거하고 분산액 1밀리리터를 추가한 후, 현탁액 아래에 격리 용액을 조심스럽게 층층이 쌓입니다. 그 다음 200G에서 5분간 원심분리합니다.

이제 1밀리리터의 뉴런 배지를 튜브에 피펫으로 넣어. 용액을 섞고 70마이크로미터 체에 서스펜션을 통과시켜 50밀리리터 튜브에 넣습니다. 세포 수를 세고 나서, 100,000 세포 밀도로 제곱센티미터당 폴리-L-오르니틴과 라미닌 코팅된 플레이트에 세포 현탁액을 시딩합니다.

60일째까지 4일에서 7일마다 미디엄을 교체하세요. 면역형광을 위해 오가노이드를 고정하기 위해 먼저 오가노이드를 마이크로튜브로 채취합니다. 오가노이드를 PBS로 세척한 후, 실온에서 4% 파라포름알데히드에 30분간 고정시킵니다.

고정 후 고정된 오가노이드를 PBS로 세 번 세척합니다. 오가노이드는 사용 전까지 섭씨 4도에 보관하세요. 2D 신경 배양 시딩을 한 후 30일 후, 배양지를 배지에서 제거합니다.

그 다음 PBS로 세포를 세척하세요. 4% 파라포름알데히드로 세포를 상온에서 15분간 고정하세요. 파라포름알데히드를 피펫으로 빼낸 후 세포를 PBS로 세 번 세척하세요.

고정된 셀은 사용 전까지 4도 섭씨에 보관하세요. RTQPCR용 오가노이드를 수집하려면 오가노이드를 마이크로 튜브로 옮깁니다. PBS를 튜브에 피펫으로 넣어 오가노이드를 세척하세요.

이제 오가노이드에 350마이크로리터의 용해 버퍼를 추가한 뒤, 액체 질소에 급동합니다. 튜브는 사용 전까지 영하 80도 환경에서 보관하세요. 건강한 대조군 IPSC 라인 414C2에서 FOXG1 양성 신경세포를 포함한 뇌 오가노이드가 30일째에 성공적으로 유도되었고, 60일째에 2D 배양 신경망이 획득되었습니다.

M.3243A에서 G 변이의 이형질 수준은 QPCR에 의해 확인되었습니다. 2번부터 8번까지는 이형질 저하, 2선부터 6선까지는 이형형성이 높았다. 저이형질 계통에서 유래한 뇌 오가노이드는 2에서 8단계까지 건강한 대조군과 유사한 크기와 형태를 보였다.

고이형질선 2에서 6에서 생성된 오르가노이드는 0.3 제곱밀리미터의 줄어든 크기와 원형 값 0.82의 불규칙한 형태를 보였다. 414C2 라인과 2선에서 8선에서 유도된 대부분의 뉴런은 30일차와 60일차에 FOXG1 양성이었다. FOXG1 양성 뉴런은 2선에서 6선에서 유래한 오가노이드나 2D 배양 뉴런에서는 거의 검출되지 않았습니다.

우리의 결과는 환자 유래 IPSC 기반 오가노이드 모델이 거울, 기전 연구, 약물 스크리닝에 유용한 플랫폼임을 시사합니다. 짧은 배양 시간과 비용 효율성을 가진 기존 방법들은 MELIS의 병태생리를 조사하는 실용적인 도구를 제공합니다. 우리는 앞으로 환자가 분만될 때 화합물을 사용하여 MELIS에 적합한 잠재적 약물을 탐색하고자 합니다.