CD63-GFP 리포터 마우스 모델을 이용한 지방세포 유래 세포외 소포 분비물의 특성 규격 연구(in vivo 및 in vitro)

우리는 지방세포 유래 세포외 소포(EV)를 연구하여 지방 조직에서 이들이 수행하는 역할을 정의하고, 특히 성숙한 지방세포와 그 전구세포 간의 교차 반응을 어떻게 조절하는지를 연구합니다. 현재 지방세포 EV 분비를 연구할 수 있는 체내 시스템은 없으며, 기존 정제 프로토콜도 완전히 최적화되지 않았습니다. 우선, 멸균 기술을 사용해 안락사 시행된 쥐의 서혜부 지방 조직을 제거하세요.

조직 1g을 0.5밀리리터의 소화 완충제가 들어 있는 2밀리리터 튜브에 넣습니다. 멸균 가위를 사용해 조직을 1밀리미터 이하의 조각으로 잘게 냅니다. 다진 조직을 0.5밀리리터당 리베라제와 50단위/밀리리터 DNase I가 포함된 소화 완충제 10밀리리터에 현탁합니다. 샘플을 궤도 셰이커 위에서 섭씨 37도에서 배양합니다.

부화 중에는 튜브를 부드럽게 여러 번 뒤집어 넣으세요. 용액이 흐려지고 조직 조각이 보이지 않으면 소화가 완료된 것입니다. 기질 혈관 분획(SVF)을 분리하기 위해 소화된 현탁액을 두 부피의 소화 완충제로 희석합니다.

튜브를 부드럽게 세 번에서 네 번 뒤집어 잘 섞으세요. 현탁액을 멸균된 100마이크로미터 필터를 통과시켜 소화되지 않은 조직을 제거한 후, 300g 여과액을 4도에서 5분간 원심분리합니다. 펠릿을 SVF라고 라벨링하세요.

기질 혈관 분획을 신선하게 준비한 적혈구 용해 완충제에 5분간 얼음 위에 배양하고, 빛을 차단합니다. 세척 버퍼 2부량을 넣고 400g 원심분리기를 4도 섭씨에서 5분간 가열합니다. 기질 혈관 분획을 조직당 80마이크로리터의 완충제에 재현탁한 후 내용물을 새로운 튜브로 옮깁니다.

조직 1그램당 20마이크로리터의 비지방세포 전구세포 고갈 칵테일을 추가하세요. 샘플을 어둠 속에서 2도에서 8도에서 15분간 배양합니다. 샘플을 LS 컬럼을 통과시키고, 계통 음성 세포 분획을 포함한 흐름을 수집합니다.

300g 압력에서 4도 섭씨에서 5분간 원심분리하여 지방세포 전구세포를 얻습니다. 콜라겐 코팅된 8웰 챔버 슬라이드에 250마이크로리터의 분리된 마우스 지방세포 전구세포 마우스를 6시간 동안 인큐베이팅합니다. 세포 및 세포 외 소포 구조를 보존하기 위해 세포를 4% 파라포름알데히드로 10분간 고정하여 영상 촬영을 위해 사용하세요.

다음으로 슬라이드를 PBS로 세 번 세척한 후 안티페이드 매체를 장착하세요. 다음으로 지방세포 전구세포를 세고 이를 현탁시키고 생존성 염료를 희석합니다. 빛을 차단한 상태로 얼음 위에서 20분간 부양하세요.

세척 버퍼와 원심분리기로 셀을 한 번 세척하세요. 세포를 밝은 염색 버퍼에 매달아 최종 농도가 100마이크로리터당 100만 개의 세포가 되도록 합니다. 1:100 비율로 Fc 수용체 차단 시약을 첨가하여 비특이적 결합을 차단하고 배양합니다.

SCA-1 항체를 6000g에서 4도에서 10분간 프리스핀합니다. SCA-1 항체를 APC 튜브에 1에서 100 희석으로 첨가한 후, 튜브를 얼음 위에 올려 빛으로부터 보호합니다. 세포를 1밀리리터 세척 버퍼로 두 번 세척한 후, 300g에서 4도 섭씨에서 5분간 원심분리합니다.

세포를 세척 버퍼에 현탁하여 유세포분석(flow cytometry) 분류를 수행한 후, 보라색과 파란색 레이저가 장착된 스펙트럼 유세포계에서 SCA-1 양성 및 GFP 양성 세포 데이터를 획득합니다. 구분을 시작하기 위해 0.2% 젤라틴을 상온에서 30분간 코팅하세요. 신선하게 분리된 APC를 보조된 DMEM/F12 배지에 씨앗을 종조하여 수류할 때까지 배양합니다.

첫날부터 8일째까지는 매개체를 MesenCult 지방생성 분화 배지로 교체하세요. 9일째에는 지방세포를 PBS로 두 번 세척한 후, DMEM 1%BSA와 0.2%프리모신이 포함된 성숙 지방세포 배양 배양액으로 배양지를 교체합니다. 지방세포가 분비하는 세포외 소포를 분리하기 위해, 먼저 15밀리리터의 배양지를 40마이크로미터 필터를 통과시키고, 이어서 30마이크로미터 필터를 통과시킵니다.

여과액을 500g에서 5분간 원심분리한 후, 2000g에서 상청액을 10분간 원심분리하여 잔류 세포와 이물질을 제거합니다. 생성된 상청액을 0.8마이크로미터 필터를 통과시키고 15밀리리터 초여과 장치에 옮긴 후, 4000g에서 원심분리하여 15분간 농축합니다. 농축된 샘플을 자동 분획 수집기에 연결된 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 적재하여 F1부터 F8.To 까지의 분획을 수집하여 Western 블롯 분석을 수행하고, 각 분획을 400마이크로리터에서 25마이크로리터까지 농축합니다.

피펫에 50마이크로리터의 방사성 면역침전 분석액을 프로테아제 및 인산효소 억제제를 첨가하여 농축액에 넣습니다. 2X SDS 로딩 버퍼 2개를 75마이크로리터 첨가하여 시료를 변성시키고 4%에서 12%의 트리스-글리신 젤에 단백질을 분해합니다. 나노입자 추적 분석의 경우, 0.1마이크로미터 여과된 멸균 PBS로 세포외 소포 샘플을 희석한 후 부드럽게 혼합합니다.

희석된 샘플을 고감도 과학적 상보 금속 산화물 반도체 카메라와 532나노미터 녹색 레이저가 장착된 NTA 기기에 적재합니다. 10나노미터에서 1,000나노미터 사이의 입자를 검출하고, 농도는 10의 6제곱에서 10에서 10의 9제곱 입자/밀리리터 내에 설정됩니다. 스톱-플루크-플루크/CD63GFP 마우스의 지방 전구세포는 공초점 현미경 검사에서 검출 가능한 녹색 형광 단백질 지점이 없었습니다.

AdipCD63 마우스 세포는 세포질 전역에 걸쳐 다수의 뚜렷한 녹색 형광 단백질 점점(puncta)을 나타냈습니다. 유세포분석 결과, 보고자 마우스에서 두개골 1 양성 세포의 1.2%가 녹색 형광 단백질을 발현한 반면, AdipCD63-GFP 마우스는 12.6%였습니다. 크기 배제 크로마토그래피 분획의 서양 블롯 분석 결과, 세포외 소포 표지 CD63과 HSP70이 F1과 F2 분획에 풍부함을 보였습니다. 소포체와 미토콘드리아의 마커는 없어 방광 순도를 확인시켜 주었다.

나노입자 추적 분석 결과, 지방세포에서 유래한 세포외 소포의 크기는 50나노미터에서 500나노미터 사이이며, 투과 전자현미경 검사에서도 소포가 온전한 이중 막 구조를 보임이 확인되었습니다. 웨스턴 블롯이 지방세포에서 STX4의 결석을 확인했습니다. 공초점 현미경 검사 결과, 야생형 지방세포에서는 CD63-GFP 양성 소포가 세포질 전체에 분산되어 있었으나, STX4 녹아웃 지방세포에서는 형질막 근처에 축적되었다.

STX4 녹아웃 지방세포에서 분비된 지방세포 유래 소포의 농도는 야생형에 비해 유의하게 감소하였습니다. 동일한 양의 세포내 소포를 단백질로 한 서양 블롯 검사 결과, STX4 녹아웃 지방세포에서 야생형에 비해 CD63과 CD81의 발현이 감소하였습니다. 이 프로토콜은 체외 및 시험관 내에서 지방세포 EV 분비를 연구할 수 있는 견고하고 재현 가능한 시스템과 최적화된 지방세포 EV 정제 방법을 제공합니다.

이 프로토콜은 처음으로 연속 저속 원심분리와 크기 배제 크로마토그래피를 결합하여 성숙한 지방세포에서 유래한 EV를 정제하는 방법을 설명하고 검증했습니다. 우리의 발견은 지방세포가 생리적·병리학적 조건 하에서 세포외 소포를 이용해 다른 세포 유형과 어떻게 소통하는지에 대한 새로운 질문을 던질 수 있게 합니다.