내재 대비를 이용한 DNA 분광학적 초해상도 영상

우리 연구는 DNA 분자의 내재 형광 스펙트럼을 측정하는 최초의 프로토콜을 제시하여, DNA 분자의 고유한 광학적 특성과 서열 확인 관련 특성을 조사할 수 있게 합니다. 이 프로토콜은 DNA 분광 영상을 위해 내인성 형광을 활용하여 기존 방법에서 표지로 인한 교란, 연결 오류, 불일치한 표지 밀도를 피합니다. 우선, DNA 샘플을 뉴클레아제가 없는 탈이온수에 최종 농도인 100밀리몰로 용해합니다.

반복되는 냉동-해동 사이클을 최소화하기 위해 DNA 스톡 용액 5마이크로리터 알리쿼트를 준비하세요. 여분의 튜브는 스톡 용액이 담긴 온도를 4도 섭씨에 보관하세요. 실험실용 물티슈를 사용해 유리 슬라이드를 부드럽게 닦아주세요.

100밀리몰라 DNA 용액 5마이크로리터를 피펫으로 세척한 유리 슬라이드에 채우고, 1시간에서 3시간 건조시켜 DNA 겔을 만듭니다. 휨 후드에서는 DNA 분자의 확률적 광 전환을 지원하기 위해 베타-머캅토에탄올 버퍼 또는 DABCO 영상 버퍼를 준비합니다. 영상 버퍼 5마이크로리터를 DNA 젤에 피펫팅하고 샘플 위에 커버 슬립을 올려놓습니다.

덮개가 있는 샘플 안에 기포가 있으면 핀셋으로 제거하세요. 직경 100나노미터 구멍을 포함하는 인공 나노홀 배열을 얻고, 4마이크로미터 간격으로 배치되어 8행과 5열로 배열됩니다. sSMLM 시스템을 켜고 카메라 앞에 좁은 대역폭 필터를 삽입하세요.

보정 샘플을 현미경 아래에 놓고 현미경 램프를 켜서 샘플을 밝히세요. 모든 필터의 노출 시간을 200밀리초로 설정하고, 750나노미터 필터는 2,000밀리초로 변경하세요. 획득 후 빠른 타임랩스로 가서 각 필터의 프레임 수를 10으로 조정하세요.

교정 후에는 DNA 겔 샘플을 현미경 스테이지에 올려놓고, 커버 슬립 면이 대물렌즈를 향하게 한 뒤 카메라 소프트웨어를 열어 데이터 수집을 시작합니다. 자동 초점 추적 시스템을 사용해 적절한 Z 위치를 파악하고, 확률적 깜빡임이 명확하게 보일 때까지 초점을 조정하세요. 대물렌즈가 커버 슬립 엣지에 닿지 않도록 하여 버퍼가 침수 오일로 누출되거나 트래킹에 방해가 되는 것을 방지하세요.

원하는 조명 파워와 30밀리초 노출 시간으로 약 10,000에서 30,000 프레임을 획득하세요. 데이터 수집 후에는 소프트웨어가 기본적으로 데이터를 nd2 형식으로 저장할 수 있도록 허용하세요. 유리 슬라이드는 깨진 유리나 날카로운 물건을 위한 승인된 쓰레기통에 버려야 합니다.

남은 모든 완충제는 기관 안전 지침에 따라 지정된 화학 액체 폐기물 용기에 버려야 합니다. 피지를 열고 바이오 포맷 플러그인을 사용해 DNA 샘플의 원본 이미지 스택을 불러오세요. 이미지를 선택한 후 스택, Z 프로젝트, 그리고 최소 강도를 투영 유형으로 선택하여 원본 이미지 스택의 최소 투영을 생성합니다.

이미지 계산기를 선택하고 원본 이미지 스택에서 최소 투영을 빼세요. 배경에서 뺄 데이터셋을 TIF 파일로 저장해 스펙트럼 분석을 수행하세요. 다음으로, ThunderSTORM 플러그인 버전 1.3을 사용하여 0차 원본 이미지 스택에서 로컬라이제이션 식별을 수행합니다.

임계값을 표준 편차 파동의 1.2배로 설정하세요. F1, 반경을 3, 시그마를 1.5로 맞추어 0차 이미지를 재구성하고 방출 사건 좌표를 추출합니다. 자른 0차 원본 이미지 스택의 경우, 플러그인을 선택하고 ThunderSTORM을 선택한 후 분석을 실행하세요.

Fiji와 2020b 이후 최신 버전의 MATLAB 오픈 소스 소프트웨어 RainbowSTORM을 사용하여 보정 데이터를 처리하고 수평 및 수직 이동 및 파장 간의 관계를 얻으세요. ThunderSTORM 플러그인을 사용하여 다섯 파장의 보정 이미지에 대해 위치 식별을 수행합니다. 임계값을 표준편차의 5배로 설정하세요, 파동.

F1, 반경을 3, 시그마를 1.5로 맞추어 0차 나노홀 국소화와 1차 스펙트럼 국소화를 재구성합니다. 각 보정 데이터의 평균 이미지를 얻고, 표준편차 파동의 5배에서 10배 범위 내에서 임계값을 조정합니다. 각 보정 이미지에 대해 F1부터 80까지의 위치 정보를 얻습니다.

RainbowSTORM을 실행하고 스펙트럼 보정 항목에서 탐색을 클릭해 각 보정 파장별 CSV 파일을 불러오세요. 그 다음 보정 파일을 저장하려면 '보정 파일 저장'을 클릭하세요. 맞춤형 Python 스크립트 버전 3.11.7을 사용해 전체 스펙트럼 데이터를 추출하세요.

그 다음 이전 백그라운드 뺄셈 단계에서 TIF 형식으로 백그라운드 뺄셈 이미지 스택에 대해 파이썬 스크립트에서 올바른 파일 경로를 설정하세요. 로컬라이제이션 분석 단계에서 생성된 로컬라이제이션 CSV 파일과 캘리브레이션 단계에서 생성된 MAT 형식의 보정 파일의 경로를 설정하세요. 그 다음 532나노미터 데이터를 3D DWP로 획득한 525에서 984 픽셀로 수평 이동을 설정하며, 525에서 750 나노미터 스펙트럼 창에 해당하여 590에서 650 나노미터 필터 범위를 넘어 커버리지를 확보합니다.

RainbowSTORM을 사용해 얻은 스펙트럼 보정 곡선을 기반으로 3D DWP로 획득한 488나노미터와 532나노미터 데이터의 수직 이동을 23픽셀로 조정하세요. 마지막으로, 3차 다항식 적합을 사용하여 비선형 스펙트럼을 선형화하여 후속 비교 및 분류 분석을 수행합니다. 스펙트럼 보정이 수행되어 0차 이미지와 1차 이미지 간의 수평 및 수직 픽셀 이동을 측정할 수 있게 되었습니다.

이를 통해 픽셀 위치와 파장 사이에 보정 곡선을 매핑할 수 있었습니다. 532나노미터 여기 하에서 비선형 및 변환된 선형 방출 스펙트럼은 이중 가닥 DNA 분자의 일종인 GC alter에 대해 얻어졌습니다. 초록색 곡선은 평균 스펙트럼을 나타냅니다.

단일 가닥 DNA 분자인 A10C10의 비선형 및 변환 선형 방출 스펙트럼은 488나노미터 여기 하에서 얻어졌으며, 파란색 곡선은 평균 스펙트럼을 나타냅니다. 이 프로토콜은 연구자들이 분광 초해상도 영상을 통해 합성된 단일 및 이중 가닥 DNA 분자의 내재 형광 스펙트럼을 측정할 수 있게 합니다. DNA 겔 샘플은 구조 정보가 부족해 확률적 깜빡임을 관찰하기 위해 세심한 초점이 필요하기 때문에 올바른 Z 위치를 정확히 찾는 것이 매우 중요합니다.

향후 연구는 RNA와 단백질의 내재 형광 측정, 서열 예측 및 표지 자유 염색질 이미징을 위한 계산 모델 통합으로 확장될 수 있습니다.