시험관 내 조절 T 세포의 기능 분석: 증식과 분화에 초점을 맞춘다

우리 연구실은 T 세포 소집합의 분화, 대사, 상호작용을 연구했습니다. Treg는 T 세포 교차 작용을 통해 면역 항상성을 유지하므로, 자가면역 및 염증성 질환 치료에 매우 중요합니다. 전통적인 시험관 내 Treg 억제 검사는 Treg 매개 효과와 효과기 T 세포 분화를 간과했습니다.

이 수정된 프로토콜은 증식과 편극을 동시에 평가합니다. 우선, 나이브 T 세포, 조절 T 또는 Treg 풍부 세포, 항원 제시 세포 비CD4 양성 세포를 준비합니다. 순진한 CD4 양성 T 세포를 350G에서 4도 섭씨에서 7분간 원심분리하고, 상환액을 버려 세포 펠릿을 얻습니다.

세포 증식 염료 eFluor 450을 PBS에 희석하여 상온에서 20 마이크로몰 농도를 얻습니다. 튜브에 1개당 0.5밀리리터의 PBS 곱하기 10을 7개의 세포의 몫에 추가합니다. 튜브를 약 45도 기울인 상태로 유지하고, 피펫팅을 50번 위아래로 부드럽게 재현수하세요.

다음으로, 세포 부속 염료 용액을 같은 부피로 빠르게 첨가하여 최종 농도인 10마이크로몰라를 얻습니다. 튜브를 45도 각도로 잡고 피펫으로 세포를 세포 증식 염료와 완전히 섞으세요. 즉시 원심분리기 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 빛 노출을 피하세요.

세포 응집을 방지하기 위해 실온에서 20분간 배양하면서 5분마다 부드럽게 소용돌이를 돌리세요. 다음으로, 원심분리관에 10밀리리터의 미리 냉각된 세포 배양지를 넣고 세포를 부드럽게 소용돌이로 돌려 염색을 종료합니다. 그 후 세포를 원심분리하고 상청액을 버립니다.

세포를 세척할 때, 세포 펠릿에 미리 냉각된 세포 배양 배지 5밀리리터를 추가하세요. 원심분리를 반복하고 펠릿을 5밀리리터의 배양지에 다시 부유시킵니다. 세포 계수 후 세포를 원심분리하여 적절한 양의 배양 배양에 재현탁하여 세포 농도를 2 곱하기 10 곱셈 1밀리리터당 6개의 세포를 만듭니다.

튜브는 얼음 위에 보관하세요. 세포 배양에 필요한 샘플 수를 계산하세요. 적절한 양의 세포배양액을 준비하는데, 여기에는 2.5마이크로그램/밀리리터 항생 항생쥐 CD3 항체 또는 적절한 유도 사이토카인이 포함되어 있습니다.

준비된 미네이브 T 세포와 트레그 강화 세포를 가져와서 소용돌이로 돌리세요. 48웰 플레이트에 CD45.2 양성, CD4 양성 나이브 T 세포 100마이크로리터, CD45.1 양성 APC 풍부 비CD4 양성 세포 100마이크로리터를 추가합니다. CD45.1, CD4, CD25 양성 Treg 풍부 세포 100마이크로리터를 실험 웰에, 100마이크로리터의 세포 배양 배지를 대조 웰로 옮깁니다.

그 다음 각 웰에 항생쥐 CD3 항체가 포함된 배양 배지 100리터와 적절한 유도 사이토카인이 포함된 배양 배지 100마이크로리터를 피펫팅합니다. 남은 빈 우물에 PBS를 추가하여 플레이트의 습도를 유지하고 가장자리 효과를 줄이세요. 48웰 플레이트를 37도 섭씨의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 3일간 배양하세요.

배양된 세포를 부드럽게 피펫으로 재현탁시키고, 세포 현탁액을 1.5밀리리터 원심분리관으로 옮깁니다. 세포를 원심분리하고 상원액을 제거하세요. 각 튜브에 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트, 이오노마이신, 골지플러그 단백질 운반 억제제가 포함된 세포 배양 배지 500마이크로리터를 추가하세요.

부드럽게 소용돌이를 통해 세포를 다시 현탁시키고, 37도 섭씨의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 3시간 동안 배양합니다. 원심분리 후에는 좀비 옐로우 염료 1회와 희석된 1:100 희석된 항생쥐 CD16 또는 32개의 항체를 포함한 PBS 50마이크로리터를 펠릿에 첨가합니다. 샘플을 보텍스화하여 실온에서 어두운 환경에서 15분간 배양하여 죽은 세포를 표지하고 FC 수용체를 차단합니다.

세포를 원심분리한 후 상원액을 버리세요. 표면 항체 칵테일 50마이크로리터를 샘플에 첨가하고, 소용돌이를 만들어 4도 온도에서 어둠 속에서 20분간 배양합니다. 그 다음 각 원심분리관에 형광 활성화 세포 분류 또는 FACS 버퍼 1밀리리터를 첨가합니다.

원심분리 및 상원액 제거 후, 각 원심분리관에 300마이크로리터의 고정 및 투과액을 첨가하고 샘플을 소용돌이로 만듭니다. 샘플을 어둠 속에서 섭씨 4도에서 20분간 배양하세요. 각 원심분리관에 밀리리터 양의 투과와 세척 버퍼를 전달한 후 원심분리 및 상원액 제거를 진행합니다.

세척을 반복한 후 각 샘플에 50마이크로리터의 사이토카인 항체 혼합물을 추가하고 샘플을 소용돌이로 만듭니다. 샘플을 어둠 속에서 섭씨 4도 온도에서 40분간 배양하세요. 각 샘플을 1밀리리터의 투과성 물질과 세척 완충제로 세척하세요.

세포를 원심분리하고 상원액을 제거하세요. 세포 펠릿을 300마이크로리터의 FACS 완충액에 재현탁합니다. 유세포분석을 통해 반응자 T 세포의 증식과 분화를 측정합니다.

전체 세포 내에서 림프구 집단을 게이트하여 세포 잔해와 불순물을 배제합니다. 산란 신호를 기준으로 림프구 중 단일 세포 집단을 선택합니다. 그 다음 단일 세포 내에서 생세포 집단을 식별하고, 이어서 살아있는 세포 내에서 CD4 양성 T 세포 집단을 확인합니다.

다음으로, CD45.1 양성 조절 T 세포 농축 집단과 CD45.2 양성 효과자 T 세포 집단을 CD4 양성 T 세포 사이에 게이트로 배치합니다. 그 다음 CD45.2 양성 CD4 양성 인터페론 감마 양성 T 헬퍼 1 세포, CD45.2 양성 CD4 인터루킨-17A 양성 T 보조 17 세포, 그리고 비증식된 CD45.2 양성 CD4 양성 T 세포를 선택한다. 모든 샘플에 대해 유세포검사 데이터 수집을 수행합니다.

마지막으로, 플로우 사이토메트리 데이터 수집과 동일한 게이팅 전략을 사용하여 FlowJo 소프트웨어로 유세포분석 데이터를 분석합니다. 조절 T 세포 풍부 세포와 공동 배양한 후 T 헬퍼 1과 T 헬퍼 17 유도 조건에서 비증식된 반응자 T 세포의 빈도가 유의하게 증가하였다. 조절 T 세포 풍부 세포와 공동 배양 후 CD4 양성, CD4 양성 인터페론 감마, 양성 T 헬퍼 1 세포의 분화가 유의하게 억제되었습니다.

반응자 T 세포가 조절 T 세포와 함께 배양했을 때, CD45.2 양성, CD4 양성 인터루킨-17A 양성 T 헬퍼 17 세포의 빈도가 증가하였습니다. 시험관 내 Treg 세포의 기능 분석을 통해 Treg와 이펙터 T 세포 간의 생체 방향성 증식 및 분극 효과를 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜을 수행하는 과정에서 가장 큰 도전은 Treg 세포와 나이브 T 세포의 순도를 보장하면서 세포의 생존력을 어떻게 유지할 것인가입니다.

이 과정을 거쳐 ELISA 및 기타 생의학적 분석법은 사이토카인 및 대사 효과기 생성을 평가하며, FACS 선별 세포는 하류 RNA-seq 및 단백질체학 분석을 가능하게 합니다.