Name: 인간 두뇌 조직에 대한 염색질 어세이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-21T19:19:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 배우세요 사후 인간 뇌 조직에서 염색질 면역침전(ChIP) 기법을 활용한 히스톤 메틸화 및 후성유전학적 조절자 분석 방법. 이 기술은 정상 및 질병 뇌에서 유전자 발현 메커니즘을 이해하는 데 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 정신 건강의 국립 연구소 (5R01MH071476)에서 부여에 의해 지원되었다.

절차 : 1 일 데이 1. 버퍼 Douncing와 냉동 사후 회색 물질 조직 50-500 MG를 균질. ! 주의 - 인간의 조직은 엄격한 안전 조건 하에서 유의해서 다루어 져야한다. 이것은 BSL - 2 이상의 안전 기준에서 처리되어야합니다. <ol><li> -80에서 이전 해부, 사후 뇌를 꺼내 ° C는 Douncing 버퍼의 배 뇌 용적에서 그들을 다운스, 및 2.0 ML의 microcentrifuge 관에서 개최. 샘플과 일치하고 제어 쌍을 동시에 처리됩니다. </li></ol> 2. Micrococcal Nuclease (MN) 소화 <ol><li> 샘플로 Micrococcal nuclease의 5U/mL를 추가하고 얼음에 넣어 전에 위아래로 pipetting하여 솔루션 내에서 섞는다. * 임계 단계 - MN도 4 행동할 수있는 능력을 가지고 이후 신속하게이 단계를 할 중요 ° C. </li><li> 37 7 분 샘플을 품어 ° C. </li><li> 7 분 부화 후, MNase 활동을 중지 10mM의 농도 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가합니다. </li></ol> 3. Hypotonisation <ol><li> 플레이스 샘플 15 매 ML 튜브로. 0.2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 / 0.2M benzamidine과 0.1M의 phenylmethanesulphonylfluoride 1 / 1000 샘플 볼륨 (PMSF) 2000 샘플 볼륨의 10X 샘플 볼륨을 추가합니다. 후자의 두 화합물은 프로 테아제 억제제로 사용됩니다. * 임계 단계 -이 단계 동안 얼음에 샘플을 유지하는 것이 중요합니다. </li><li> 그것을 10 분마다 vortexing하면서 1 시간 동안 샘플을 품어. </li><li> 시간 긴 인큐베이션의 끝에, 2천분의 1 3M DTT의 샘플 볼륨, 또 다른 프로 테아제 억제제를 추가합니다. </li><li> 와동 샘플은 한 번 더 4 ° C. 10 분 3175 RCF에서 원심 분리기 * 선택 단계 - 단백질 G 아가로 오스와 Precleansing. <ol><li> 뜨는 가지고 새로운 15 ML 팔콘 튜브에 넣어. </li><li> 단백질 G 아가로 오스 500 μL를 추가합니다. </li><li> 30 분 상온에서 회전. </li><li> 4 10 분 4,000 rpm으로 원심 분리기 ° C. </li></ol></li><li> 500 μL를 입력 제어 (단 게놈 DNA를 포함)로 사용되도록 뜨는 배포하고, 나머지는 각각의 샘플 1,600 μL 담긴 두개의 튜브로 나뉩니다 - 염색질 immunoprecipitation (칩) 샘플입니다. </li><li> 입력 제어는 -80에서 배치됩니다 ° CO / N 더욱 사용까지. </li><li> 칩 샘플을 위해 - 그 항체의 10XFSB 및 4μg의 1시 10분 볼륨, 소용돌이 샘플을 추가 4 ° C 야간에 그들을 돌린다. ! 주의 - 항체의 금액 및 희석 최적화가 필요할 수 있습니다. </li></ol> 2 차 주 ! 주의! - nucleosomal DNA를 분리하는 데 사용됩니다 단백질 G 아가로 오스를 세척하여 2 차 일 시작합니다. 아가로 오스 비즈 매우 민감한 때문에, 그것은 아가로 오스 비즈가 포함된 솔루션을 pipetting 때마다 팁을의 머리를 잘라하는 것이 필요합니다. 1. DNA에 단백질 G 아가로 오스 비즈를 프로빙 <ol><li> 2 ML의 microcentrifuge 관에 245 μL 단백질 G - 아가로 오스 (충분한 사 튜브에 대한) (루프)로 1.6 ML 1XFSB를 추가합니다. </li><li> 이 두 ML 튜브 및 리필 1X FSB 각 최대 1.6 ML로 들어가서 해결책을 분리. </li><li> 30 초에 대한 RT에서 회전 및 30 초에 대한 0.1 RCF에서 원심 분리기. </li><li> 진공을 사용하여 표면에 뜨는를 제거합니다. </li><li> 다시 한번 1.6 ML 1X FSB를 추가합니다. 30 초에 대한 0.1 RCF에서 원심 분리기 다음 30 초에 대한 샘플을 회전합니다. </li><li> 다시 뜨는을 제거하고, 1.5 ML 1XFSB로 모두 튜브를 결합. </li><li> 15 μL sonicated 연어 정자 DNA (10mg/mL)을 추가합니다. ! 주의 -이 단계는, 원칙적으로 구슬로 immunoprecipitate가 아닌 특정 바인딩을 줄일 수 있습니다. 그러나, 이것은 또한 (인간)의 DNA 시퀀스의 일부에 대한 잘못된 반응을 초래할 수 있습니다. </li><li> 30 분 RT에서 회전 후, 30 초에 대한 0.1 RCF에서 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 제거합니다. 1XFSB 200 μL를 추가합니다. </li><li> 각각의 칩 샘플로 아가로 오스 비즈 90 μL를 추가합니다. 1 시간 4 ° C에서 회전합니다. </li><li> 대조군 역할을하고 4 회전 ° C를 1 시간을 위해 남아있는 아가로 오스 비즈로 1XFSB의 1mL를 추가합니다. </li><li> 시간 동안 배양 후, 30 초에 대한 0.1 RCF에서 샘플과 부정 컨트롤을 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오. </li></ol> 2. 비즈 워싱 ! 주의! - 워싱 버퍼는 ° C를 사용하기 전까지, 그리고 오래된 한 달 미만의 경우에만 사용됩니다 4 보관해야합니다. <ol><li> 비즈 각 세척 용액 1 ML을 추가하고 RT 3 분 돌린다. </li><li> 30 초에 대한 0.1 RCF에서 원심 분리기. </li><li> 뜨는 사용하여 진공을 폐기하십시오. </li></ol> * 각 세척 용액 - 낮은 소금 세척 버퍼 - 하이 소금 세척 버퍼 </p&gt; - 염화 리튬 솔루션 - 단 1 분 RT에서 회전! - TE 버퍼 (10 MM 트리스, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 = 8) 3. 용리 * 임계 단계 - 그것이 사용할 수있는 날짜에 모든 실험에 대한 신선한 용출 버퍼를 확인합니다. <ol><li> 각 샘플에 신선한 용출 버퍼 250 μL를 추가합니다. </li><li> RT 15 분 회전, 다음 1 분 0.4 RCF에서 원심 분리기. </li><li> 2.0 ML의 microcentrifuge 관 (루프)의 표면에 뜨는를 저장합니다. </li><li> 몇 초 동안 손으로 각각의 샘플 및 와동에 용출 버퍼 250 μL를 추가합니다. 그런 다음, mulitvortexer에서 15 분 동안 와동 샘플. </li><li> 사분 16 RCF rpm으로 원심 분리기와 같은 2.0 ML 튜브 (루프)에 뜨는 저장합니다. </li></ol> 4. 다이제스트 단백질 <ol><li> 각각의 칩 샘플 10 μl 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 25 μl 0.8M 트리스 - HCL, pH를 6.5, 10 MG / ML Proteinase K (2백분의 1 샘플)를 추가합니다. </li><li> 각각의 입력 제어, proteinase K의 소화 (샘플 버퍼의 1 / 10) 및 10mg/ml Proteinase K (샘플 버퍼의 1 / 200)에 대한 용해 버퍼를 추가합니다. </li><li> 적어도 3 시간 52 ° C에서 입력 및 칩 샘플을 품어. </li></ol> 5. 클로로포름 / 페놀 추출 ! 주의 - 실험 클로로포름 / 페놀 필요는 후드 아래에 수행되어야한다. 클로로포름 / 페놀 다룰 때 nitrile 장갑을 사용하십시오. <ol><li> 3 시간 부화 후, 각 시료에 500 μl 페놀 - 클로로포름을 추가합니다. </li><li> 몇 초 동안 소용돌이 모든 샘플은 다음 5 분 13 RCF의 rpm으로 원심 분리기. </li><li> 이 시점에서, 두 단계가 존재하고 우리는 최고 단계의 내용에 관심이 있습니다. 상단 위상을 가지고 2 ML의 microcentrifuge 관에 넣어. </li><li> 100 % 에탄올의 1.375 ML과 함께 각각의 샘플에 3M의 아세트산 나트륨의 글리코겐과 50μL의 2μL의 혼합물을 추가합니다. </li><li> 적극적으로 와동 모든 샘플. -80 ° C 하룻밤에 놓으십시오. </li></ol> 제 3 주 <ol><li> 제거 샘플 양식 -80 ° C와 그들이 해동 위해 얼음에 그들을 놓으십시오. </li><li> 4 10 분 15 RCF에서 원심 분리기 ° C. </li><li> 조심스럽게 튜브 하단의 펠렛을 방해하지 않고 뜨는 제거합니다. </li><li> 각 샘플에 감기의 75 % 에탄올 1 ML 추가 후, 그들에게 4-6 번 반전. </li><li> 4 5 분 18 RCF에서 원심 분리기 ° C. </li><li> 한 번 더 뜨는 제거하고 알약 건조 공기 수 있습니다. </li><li> -80 50 4mm짜리 트리스 - HCL, pH8의 μL 및 저장소에 말린 알약을 디졸브 ° C 이상 사용까지. </li></ol>

<ol><li>Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akbarian+S.+Chromatin+immunoprecipitation+in+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain.</a> J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dysfunction+in+schizophrenia+involves+mixed-lineage+leukemia+1-regulated+histone+methylation+at+GABAergic+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters.</a> J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+native+chromatin%3A+NChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31, 76-82 Forthcoming.</li>
<li>Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+transcriptional+targets+of+FOXP2%2C+a+gene+linked+to+speech+and+language%2C+in+developing+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain.</a> Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. uang, Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAD1+mRNA+expression+and+DNA+methylation+in+prefrontal+cortex+of+subjects+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia.</a> PLoS ONE. 2, Forthcoming.</li>
<li>Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+at+gene+promoters+is+associated+with+developmental+regulation+and+region-specific+expression+of+ionotropic+and+metabotropic+glutamate+receptors+in+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain.</a> J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.</li>
</ol>

프로토콜이 염색질 표시가 (히스톤) 아세틸화 및 인산화 하나를 포함하여 수정의 다른 유형에 비해 사후 유물이 적은 경향이있을 수 있기 때문에, 인간 두뇌의 히스톤 및 / 또는 DNA methylation 서명에 관심이 조사에 특히 유용합니다 여기에 설명된 2. 사후 두뇌는 모노 nucleosomal 준비 연구 의무이며 DNA가 최소한의 범위에서 일반적으로 대표 autolysis 간격 (죽음과 냉동 / 조직의 저장 사이의 시간)과 표본에서 크게 핵심 histones에 연결된 상태 몇 시간은 최대 1.5 일 1. 그러나, 모노 nucleosomal 준비, 특히 유전자 3 전사 시작 사이트를 둘러싼 시퀀스 주위 nucleosomal 위치와 밀도의 변화에 민감 수 있습니다. 따라서, 수정 독립적인 안티 히스톤 항체와 제어 실험이 포함되어야합니다. 또는 그것은 (ultracentrifugation 포함) 추가 정화 단계와 함께 micrococcal nuclease 다이제스트에...

솔루션 : <ul><li> nChIP Douncing 버퍼 : 10 MM 트리스, 4 MM MgCl 2, 1 MM CaCl 2 7.5 산도를 조절 </li><li> 10X FSB : 50 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 200 MM 트리스, 500 MM NaCl은 7.5 산도를 조절 </li><li> 낮은 소금 세척 버퍼 : 0.1 % SDS, 1 % 트리톤 X - 100, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 20 MM 트리스 (산도 8), 150 MM NaCl </li><li> 고 염분 세척 버퍼 : 0.1 % SDS, 1 % 트리톤 X - 100, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 20 MM 트리스 (수소 이온 농도 8), 500 MM NaCl </li><li> 염화 리튬 버퍼 : 1 % IGEPAL - CA 630, 1 % Deoxycholic 산, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8), 10 MM 트리스 (산도 8), 0.25 M LiCl </li><li> TE 버퍼 : 10 MM 트리스 (산도 8), 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </li><li> 용출 버퍼 : 0.1M NaHCO 3, 1 % SDS </li><li> Proteinase K의 소화 버퍼 (10X) : 1M 트리스, 50 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2% SDS, 2M NaCl은 8.0 산도를 조절 </li><li> 3 M의 아세트산 나트륨 : autoclaved 증류수 100 ML에서 24.61 g 무수 아세트산 나트륨 (MW가 = 82.03). 집중 아세트산을 사용하여 5.2 산도를 조정합니다. </li></ul>

인간 두뇌 조직에 대한 염색질 어세이

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

이러한 정신 분열증, 양극성 질환과 자폐증과 같은 만성 질병 neuropsychiatric은 유전자 발현과 다른 분자 병리의 epigenetic 변경의 결과 수도 유전과 환경 요인의 조합에서 결과로 생각되고 있습니다. 전통적으로 그러나, 사후 두뇌의 표현 연구 mRNA 또는 단백질의 부량에 국한되어 있었다. 이러한 autolysis 시간과 조직 integrities에 variabilities으로 사후 뇌 연구에있어서 제한은 또한 높은 주문 염색질 구조의 연구에 영향을 가능성이 있습니다. 그러나, DNA를 포함한 게놈 DNA의 nucleosomal 조직 : 바인딩 핵심 히스톤은 - 대부분 다양한 뇌 은행에서 제공하는 대표적인 표본의 보존에 나타납니다. 따라서, 그것은 methylation 패턴과 사후 두뇌에 정의된 게놈 loci에서 핵심 histones의 다른 공유 결합 수정을 공부하는 것이 가능합니다. 여기, 우리는 냉동 (- 고정하지 않음) 인간의 두뇌 표본에 대한 간단한 기본 염색질 immunoprecipitation (NChIP) 프로토콜을 제시한다. 두뇌 homogenates의 micrococcal nuclease의 소화를 시작으로, NChIP는 qPCR 다음은 3 일 이내에 완료할 수 있습니다. 여기에 제시 방법은 정상과 병적인 인간의 두뇌에서 유전자 발현의 epigenetic 메커니즘을 명료하게하다하는 데 유용합니다.

최근까지, 인간의 두뇌에 대한 표현 연구 RNA 또는 단백질의 양을 정함으로 제한했다. 이 문서에 설명되어있는 염색질 immunoprecipitation 기술과 함께, 그것은 사후 두뇌에서 유전자 발현의 히스톤 methylation 및 기타 epigenetic 규제를지도로 가능합니다.

조현병, 조울증 및 자폐증과 같은 만성 신경정신질환은 유전적 요인과 환경적 요인의 결합으로 인해 발생하는 것으로 생각됩니다...

안녕하세요, 저는 UMass Medical School 정신건강의학과 Dr.Sha Mc Barian 연구실의 Amish Matan입니다. 오늘은 사후 인체 뇌 조직에서 크로마틴 면역침강법을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다. 다음에 설명할 절차는 그리 복잡하지 않습니다.가장 고무적인 점은 최근까지 인간 뇌의 발현 연구가 mRNA와 단백질의 단순 정량 분석에 국한되었다는 것입니다. 이 특정한 기술은 정상 및 질환 상태의 인간 뇌에서 유전자 발현의 기전적 기초를 더 잘 이해할 수 있게 해줄 것입니다. 이제 크로마틴 면역침전법을 시작해 보겠습니다.우리는 이전에 동결된 사후 인간 뇌 조직에서 분리한 샘플로 시작했습니다. 안전 고글을 착용하고 인간 조직 취급을 위해 지정된 구역에서 작업하는 것이 중요합니다. 이 샘플들을 처리할 때, 뇌 조직은 뇌 부피의 5배에 해당하는 down sink buffer로 희석합니다.용액 내의 모든 조직이 균질해진 것으로 보이면, 조직 균질화 후 2mL 튜브로 옮깁니다. 시료에 1mL당 5 unit의 micrococcal nuclease를 첨가하고 피펫팅하여 용액을 혼합합니다. 그 후 얼음 위에 둡니다.이 단계는 빠르게 수행하는 것이 중요합니다. Micrococcal nuclease는 4 °C에서도 활성을 나타낼 수 있기 때문입니다. 모든 샘플을 micrococcal nuclease로 처리한 후, 즉시 37 °C 항온수조로 옮겨 7분 동안 배양합니다.7분간의 배양 후, 마이크로코컬 뉴클레아제(micrococcal nuclease) 활성을 중단시키기 위해 0.5 molar EDTA를 최종 농도 10 millimoles가 되도록 첨가합니다. 이제 정제 단계로 넘어갈 준비가 되었습니다. 마이크로코컬 뉴클레아제로 처리하여 뉴클레오솜 DNA가 포함된 샘플의 정제를 시작합니다.Nava는 15 mL Falcon 튜브를 준비하고, 여기에 0.2 mM EDTA 4.5 mL, 0.2 M benzonase 2.5 µL, 그리고 0.1 M PMSF 4.5 µL를 첨가할 것입니다. 여기에 샘플을 옮깁니다. 그런 다음 10분마다 볼텍싱하며 얼음 위에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다.1시간의 배양 후, 3 M DTT 2.5 µL를 첨가합니다. 샘플을 다시 한번 볼텍싱한 다음, 4 °C에서 3,175 RCF로 10분 동안 스윙 버킷 로터를 사용하여 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 분배하여, 게놈 DNA만 포함된 입력 대조군(input control)으로 500 µL를 사용하고, 나머지는 각각 1,600 µL의 샘플을 담은 두 개의 튜브로 나누어 크로마틴 면역침전(chromatin immunoprecipitation) 샘플로 사용합니다.입력 대조군은 추후 사용 시까지 -80 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 다음으로, 시료 부피의 1/10에 해당하는 160 µL의 10X FSB를 첨가합니다. 이와 함께 4 µg의 항체를 첨가합니다.이제 샘플을 볼텍싱한 다음, 4 °C에서 하룻밤 동안 회전시키십시오. 하룻밤 배양 후, 뉴클레오솜 DNA를 분리하는 데 사용할 단백질 기로스(protein giros)를 세척합니다. 이러한 아그로 비드(agro beads)는 매우 민감하므로, 이를 다룰 때는 피펫 팁의 끝부분을 잘라내야 합니다.이는 피펫팅 시 비드에 더 충분한 공간을 확보하기 위함입니다. 이제 2 ml 마이크로 원심분리 튜브에 1X FS 비드 1.6 µL와 단백질 jaguars 245 µL를 추가합니다. 이 양은 샘플 튜브 4개 분량으로 충분합니다.다음으로, 비드 용액을 두 개의 2 mL 튜브에 나누어 담고, 각 튜브에 1X FSB를 넣어 1.6 mL까지 채웁니다. 상온에서 로테이터를 이용해 튜브를 30초 동안 회전시킨 후, 0.1 RCF에서 30초 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 진공 장치를 사용하여 ATE를 제거합니다.1X FSB 1.6 mL를 추가합니다. 다시 한번 로테이터에서 샘플을 30초 동안 회전시킨 후, 0.1 RCF FS에서 30초 동안 다시 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 다시 제거하고, 두 튜브를 1X FSB 1.5 mL로 함께 희석합니다.여기에 정자 DNA 15 µL를 추가합니다. 이제 실온에서 30분 동안 회전시킨 후, 0.1 RCF에서 30초 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거하고 1X FSB 200 µL를 추가합니다.이제 각 크로마틴 침전 시료에 90 µL의 agro speeds를 추가하고, 4°C에서 1시간 동안 회전 혼합합니다. 음성 대조군으로는 나머지 agro speeds에 1 mL의 1X FSB를 추가하고, 크로마틴 면역침전 시료와 함께 4°C에서 1시간 동안 회전 혼합합니다. 1시간의 배양 시간 동안 신선한 해리 버퍼(resolution buffer)를 준비할 수 있습니다.이것은 1시간의 배양 후에 실험 후반부에서 사용됩니다. 샘플과 음성 대조군을 0.1 CFS에서 30초 동안 원심 분리한 후 상층액을 제거합니다. 다음으로, 저염 세척 완충액, 고염 세척 완충액, 염화리튬 용액, 그리고 마지막으로 pH 8의 TE 완충액이라는 네 가지 서로 다른 종류의 세척 용액으로 비드를 세척합니다.염화리튬 용액을 제외한 각 완충액의 경우, 상온에서 샘플을 3분 동안 회전시킨 후 0.1 R Cs에서 30초 동안 원심분리합니다. 염화리튬 세척 단계에서는 상온에서 샘플을 1분 동안만 회전시킵니다. 각 세척 후에는 진공 장치를 사용하여 상층액을 제거합니다.이제 샘플을 용출할 준비가 되었습니다. 용출 단계를 시작하려면, 각 샘플에 새로 조제한 용출 버퍼 250 µL를 첨가합니다. 실온에서 15분 동안 샘플을 회전시킨 후, 0.4 RCF에서 1분간 원심 분리합니다.이제 상층액을 2 mL 오렌지 튜브에 저장합니다. 그런 다음 각 샘플에 250 µL의 용출 완충액을 첨가합니다. 다시 한번 모든 샘플을 손으로 몇 초간 볼텍싱합니다.그 후 샘플을 15분 동안 볼텍싱하고, 15분간의 볼텍싱 후 튜브를 원심분리기에서 회전시킵니다. 16 RCF로 4분 동안 원심분리하고 상층액을 동일한 2 mL 마이크로 튜브에 보관하십시오. 샘플 내의 단백질을 소화시키기 위해, 각 크로마틴 면역침강 샘플에 0.5 M DTT 10 µL, pH 6.5의 0.8 M Tris-HCl 25 µL, 그리고 10 mg/mL Proteinase K 2.5 µL를 추가합니다.각 입력 대조군에 용해 버퍼 15 µL와 10 mg/mL Proteinase K 2.5 µL를 추가합니다. 입력 시료와 염색질 면역침강 시료 모두를 52 °C에서 최소 3시간 동안 배양합니다. 3시간의 배양이 완료되면, 페놀-클로로포름 추출을 시작할 수 있습니다.3시간 동안 배양한 후, 각 시료에 500 µL의 phenyl chloroform을 첨가합니다. phenyl chloroform은 피부 접촉 시 유해하고 흡입 시에도 위험한 유기 화학 물질이므로, 이 과정은 후드 내에서 수행합니다. 그다음, 모든 시료를 수 초 동안 볼텍싱(vortex)하고 13 RCF에서 5분 동안 원심분리합니다.튜브 내에 두 개의 층이 형성되어야 합니다. 상층액의 성분을 분석하고자 하므로, 상층액을 취해 2 mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 다음으로, 각 샘플에 2 µL의 글리코겐과 50 µL의 3 M 아세트산나트륨 혼합물과 함께 1.375 mL의 100% 에탄올을 첨가합니다.모든 샘플을 강하게 볼텍싱한 후 -80°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 하룻밤 배양 후, 샘플을 얼음 위에 놓아 해동합니다. 그 다음 4°C에서 15 RCF로 10분 동안 밀도 원심분리를 수행합니다.원심분리 후, 튜브 바닥의 펠릿이 섞이지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 각 시료에 차가운 75% ethanol 1 mL를 첨가하고 4~6회 반전 혼합합니다. 그 후 튜브를 4°C에서 18 RCF로 5분 동안 다시 원심분리합니다.상층액을 다시 제거하고 펠렛을 공기 중에서 건조시킵니다. 펠렛이 건조되면, pH 8의 4 mM trace HCl 50 µL에 용해하여 -80 °C에서 보관합니다. 추가 분석 전까지 보관하십시오. 지금까지 냉동된 인간 사후 뇌 조직을 이용한 크로마틴 면역침강법 수행 방법을 살펴보았습니다.그리고 이 절차를 수행할 때, 인간 뇌 조직을 다룰 때 필요한 모든 주의 사항을 지키는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 크로마틴 면역침강 분석법은 정상 및 질환 상태의 인간 뇌 내 유전자 발현에 대한 이해도를 높이는 데 추가적으로 활용될 수 있습니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

뇌 조직의 세포 이질은 대부분의 assays 단일 셀 해상도 부족하기 때문에 염색질의 epigenetic 자국의 연구에 대한 중요한 제한 포즈. 뉴런은 일반적으로 glia 및 기타 비의 연결을 세포와 혼합된 있습니다. 우리는 인간의 두뇌에서 핵의 연결을 추출하고 수집하는 프로토콜을 제공합니다.

인간의 사후 뇌 조직에서 핵의 연결을 격리

이 프로토콜은 염색질 immunoprecipitation (칩)가 신호 전달 경로에 의해 유도 전사 조절 염색질 템플릿 동적 변경을 연구하는 데 사용됩니다 방법을 설명합니다.

인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)

EpiMark 5 HMC 5 - MC 분석 키트는 분석하고 spe cific 로커스 이내 5 methylcytosine 5 - hydroxymethylcytosine을 quantitate하는 데 사용할 수 있습니다. 키트는 β - glucosyltransferase (T4 - BGT)를 이용한 효소 반응을 통해 5 - HMC의 수산기 그룹에 포도당의 추가에 의해 5 - HMC에서 5 - MC를 구별. 5 HMC는 CCGG의 맥락에서 발생하면,이 수정은 아닌 cleavable 사이트에 cleavable MspI 사이트를 변환합니다.

Balb / C 뇌 조직에 높은 민감도는 5 hydroxymethylcytosine 감지

출처: Mendez, F. M. et al., 쥐 뇌 종양 신경구를 사용한 네이티브 염색질 면역침전.J. vis. 특급 (2018). 이 비디오는 천연 염색질 면역침전을 사용하여 마우스 뇌종양에서 유래한 신경구 세포에서 단백질-DNA 복합체를 분리하는 방법을 보여줍니다. 염색질 준비, 면역침전, 세척 및 단백질 분해를 위한 단계를 자세히 설명하여 다운스트림 분석을 위해 DNA를 방출합니다.

신경구 세포의 네이티브 염색질 면역침전(Native Chromatin Immunoprecipitation of Neurosphere Cells)

RNA in situ hybridization (ISH)는 세포와 조직에서 RNA를 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 RNAscope ISH와 면역조직화학 또는 조직학적 염료의 조합을 사용하여 마우스와 인간 뇌 섹션에서 축삭돌기에 국한된 mRNA를 검출하는 방법을 보여줍니다.

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

여기에서는 과산화효소 접합 2차 항체 및 티라미드 신호 증폭의 사용을 기반으로 5mC 산화 유도체의 공간 분포를 매핑하기 위한 민감한 면역화학적 방법을 설명합니다.

민감한 면역를 사용하여 시토신의 수정 된 형태의 검출

우리 신경 조상 세포의 히스톤 3 리 79 dimethylation (H3K79me2)-내에 있는 히스톤 마크 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 미 발달 및 출생 후 뇌 조직에서 문화를 격리 하는 효과적이 고 재현 가능한 방법을 제시는 히스톤 3의 구형 도메인입니다.

절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배

후 성적인 기계 장치는 자주 glioma에서 변경 됩니다. Chromatin immunoprecipitation 히스톤 수정 chromatin 구조와 유전자 전사 조절에 따른 결과 glioma의 유전 변경의 결과 연구에 사용 될 수 있습니다. 이 프로토콜 murine 뇌 종양 neurospheres에 네이티브 chromatin immunoprecipitation을 설명합니다.

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Murine 뇌 종양 Neurospheres를 사용 하 여

탠덤 chromatin 위한 단계별 프로토콜 설명 immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 셀 형식 관련 게놈 넓은 히스톤 수정의 분석을 가능 하 게.

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

여기에서, 우리는 면역 형광 염색 및 DNA 점 얼룩 방법을 활용하여 세포와 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸시토신을 검출하는 프로토콜을 제시한다.

신경 줄기 세포와 쥐의 뇌에서 5-하이드록시메틸시토신의 검출

이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

배우세요 사후 인간 뇌 조직에서 염색질 면역침전(ChIP) 기법을 활용한 히스톤 메틸화 및 후성유전학적 조절자 분석 방법. 이 기술은 정상 및 질병 뇌에서 유전자 발현 메커니즘을 이해하는 데 필수적인 도구입니다.

인간 두뇌 조직에 대한 염색질 어세이

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