인간 두뇌 조직에 대한 염색질 어세이

안녕하세요, 저는 UMass Medical School 정신건강의학과 Dr.Sha Mc Barian 연구실의 Amish Matan입니다. 오늘은 사후 인체 뇌 조직에서 크로마틴 면역침강법을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다. 다음에 설명할 절차는 그리 복잡하지 않습니다.

가장 고무적인 점은 최근까지 인간 뇌의 발현 연구가 mRNA와 단백질의 단순 정량 분석에 국한되었다는 것입니다. 이 특정한 기술은 정상 및 질환 상태의 인간 뇌에서 유전자 발현의 기전적 기초를 더 잘 이해할 수 있게 해줄 것입니다. 이제 크로마틴 면역침전법을 시작해 보겠습니다.

우리는 이전에 동결된 사후 인간 뇌 조직에서 분리한 샘플로 시작했습니다. 안전 고글을 착용하고 인간 조직 취급을 위해 지정된 구역에서 작업하는 것이 중요합니다. 이 샘플들을 처리할 때, 뇌 조직은 뇌 부피의 5배에 해당하는 down sink buffer로 희석합니다.

용액 내의 모든 조직이 균질해진 것으로 보이면, 조직 균질화 후 2mL 튜브로 옮깁니다. 시료에 1mL당 5 unit의 micrococcal nuclease를 첨가하고 피펫팅하여 용액을 혼합합니다. 그 후 얼음 위에 둡니다.

이 단계는 빠르게 수행하는 것이 중요합니다. Micrococcal nuclease는 4 °C에서도 활성을 나타낼 수 있기 때문입니다. 모든 샘플을 micrococcal nuclease로 처리한 후, 즉시 37 °C 항온수조로 옮겨 7분 동안 배양합니다.

7분간의 배양 후, 마이크로코컬 뉴클레아제(micrococcal nuclease) 활성을 중단시키기 위해 0.5 molar EDTA를 최종 농도 10 millimoles가 되도록 첨가합니다. 이제 정제 단계로 넘어갈 준비가 되었습니다. 마이크로코컬 뉴클레아제로 처리하여 뉴클레오솜 DNA가 포함된 샘플의 정제를 시작합니다.

Nava는 15 mL Falcon 튜브를 준비하고, 여기에 0.2 mM EDTA 4.5 mL, 0.2 M benzonase 2.5 µL, 그리고 0.1 M PMSF 4.5 µL를 첨가할 것입니다. 여기에 샘플을 옮깁니다. 그런 다음 10분마다 볼텍싱하며 얼음 위에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다.

1시간의 배양 후, 3 M DTT 2.5 µL를 첨가합니다. 샘플을 다시 한번 볼텍싱한 다음, 4 °C에서 3,175 RCF로 10분 동안 스윙 버킷 로터를 사용하여 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 분배하여, 게놈 DNA만 포함된 입력 대조군(input control)으로 500 µL를 사용하고, 나머지는 각각 1,600 µL의 샘플을 담은 두 개의 튜브로 나누어 크로마틴 면역침전(chromatin immunoprecipitation) 샘플로 사용합니다.

입력 대조군은 추후 사용 시까지 -80 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 다음으로, 시료 부피의 1/10에 해당하는 160 µL의 10X FSB를 첨가합니다. 이와 함께 4 µg의 항체를 첨가합니다.

이제 샘플을 볼텍싱한 다음, 4 °C에서 하룻밤 동안 회전시키십시오. 하룻밤 배양 후, 뉴클레오솜 DNA를 분리하는 데 사용할 단백질 기로스(protein giros)를 세척합니다. 이러한 아그로 비드(agro beads)는 매우 민감하므로, 이를 다룰 때는 피펫 팁의 끝부분을 잘라내야 합니다.

이는 피펫팅 시 비드에 더 충분한 공간을 확보하기 위함입니다. 이제 2 ml 마이크로 원심분리 튜브에 1X FS 비드 1.6 µL와 단백질 jaguars 245 µL를 추가합니다. 이 양은 샘플 튜브 4개 분량으로 충분합니다.

다음으로, 비드 용액을 두 개의 2 mL 튜브에 나누어 담고, 각 튜브에 1X FSB를 넣어 1.6 mL까지 채웁니다. 상온에서 로테이터를 이용해 튜브를 30초 동안 회전시킨 후, 0.1 RCF에서 30초 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 진공 장치를 사용하여 ATE를 제거합니다.

1X FSB 1.6 mL를 추가합니다. 다시 한번 로테이터에서 샘플을 30초 동안 회전시킨 후, 0.1 RCF FS에서 30초 동안 다시 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 다시 제거하고, 두 튜브를 1X FSB 1.5 mL로 함께 희석합니다.

여기에 정자 DNA 15 µL를 추가합니다. 이제 실온에서 30분 동안 회전시킨 후, 0.1 RCF에서 30초 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거하고 1X FSB 200 µL를 추가합니다.

이제 각 크로마틴 침전 시료에 90 µL의 agro speeds를 추가하고, 4°C에서 1시간 동안 회전 혼합합니다. 음성 대조군으로는 나머지 agro speeds에 1 mL의 1X FSB를 추가하고, 크로마틴 면역침전 시료와 함께 4°C에서 1시간 동안 회전 혼합합니다. 1시간의 배양 시간 동안 신선한 해리 버퍼(resolution buffer)를 준비할 수 있습니다.

이것은 1시간의 배양 후에 실험 후반부에서 사용됩니다. 샘플과 음성 대조군을 0.1 CFS에서 30초 동안 원심 분리한 후 상층액을 제거합니다. 다음으로, 저염 세척 완충액, 고염 세척 완충액, 염화리튬 용액, 그리고 마지막으로 pH 8의 TE 완충액이라는 네 가지 서로 다른 종류의 세척 용액으로 비드를 세척합니다.

염화리튬 용액을 제외한 각 완충액의 경우, 상온에서 샘플을 3분 동안 회전시킨 후 0.1 R Cs에서 30초 동안 원심분리합니다. 염화리튬 세척 단계에서는 상온에서 샘플을 1분 동안만 회전시킵니다. 각 세척 후에는 진공 장치를 사용하여 상층액을 제거합니다.

이제 샘플을 용출할 준비가 되었습니다. 용출 단계를 시작하려면, 각 샘플에 새로 조제한 용출 버퍼 250 µL를 첨가합니다. 실온에서 15분 동안 샘플을 회전시킨 후, 0.4 RCF에서 1분간 원심 분리합니다.

이제 상층액을 2 mL 오렌지 튜브에 저장합니다. 그런 다음 각 샘플에 250 µL의 용출 완충액을 첨가합니다. 다시 한번 모든 샘플을 손으로 몇 초간 볼텍싱합니다.

그 후 샘플을 15분 동안 볼텍싱하고, 15분간의 볼텍싱 후 튜브를 원심분리기에서 회전시킵니다. 16 RCF로 4분 동안 원심분리하고 상층액을 동일한 2 mL 마이크로 튜브에 보관하십시오. 샘플 내의 단백질을 소화시키기 위해, 각 크로마틴 면역침강 샘플에 0.5 M DTT 10 µL, pH 6.5의 0.8 M Tris-HCl 25 µL, 그리고 10 mg/mL Proteinase K 2.5 µL를 추가합니다.

각 입력 대조군에 용해 버퍼 15 µL와 10 mg/mL Proteinase K 2.5 µL를 추가합니다. 입력 시료와 염색질 면역침강 시료 모두를 52 °C에서 최소 3시간 동안 배양합니다. 3시간의 배양이 완료되면, 페놀-클로로포름 추출을 시작할 수 있습니다.

3시간 동안 배양한 후, 각 시료에 500 µL의 phenyl chloroform을 첨가합니다. phenyl chloroform은 피부 접촉 시 유해하고 흡입 시에도 위험한 유기 화학 물질이므로, 이 과정은 후드 내에서 수행합니다. 그다음, 모든 시료를 수 초 동안 볼텍싱(vortex)하고 13 RCF에서 5분 동안 원심분리합니다.

튜브 내에 두 개의 층이 형성되어야 합니다. 상층액의 성분을 분석하고자 하므로, 상층액을 취해 2 mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 다음으로, 각 샘플에 2 µL의 글리코겐과 50 µL의 3 M 아세트산나트륨 혼합물과 함께 1.375 mL의 100% 에탄올을 첨가합니다.

모든 샘플을 강하게 볼텍싱한 후 -80°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 하룻밤 배양 후, 샘플을 얼음 위에 놓아 해동합니다. 그 다음 4°C에서 15 RCF로 10분 동안 밀도 원심분리를 수행합니다.

원심분리 후, 튜브 바닥의 펠릿이 섞이지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 각 시료에 차가운 75% ethanol 1 mL를 첨가하고 4~6회 반전 혼합합니다. 그 후 튜브를 4°C에서 18 RCF로 5분 동안 다시 원심분리합니다.

상층액을 다시 제거하고 펠렛을 공기 중에서 건조시킵니다. 펠렛이 건조되면, pH 8의 4 mM trace HCl 50 µL에 용해하여 -80 °C에서 보관합니다. 추가 분석 전까지 보관하십시오. 지금까지 냉동된 인간 사후 뇌 조직을 이용한 크로마틴 면역침강법 수행 방법을 살펴보았습니다.

그리고 이 절차를 수행할 때, 인간 뇌 조직을 다룰 때 필요한 모든 주의 사항을 지키는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 크로마틴 면역침강 분석법은 정상 및 질환 상태의 인간 뇌 내 유전자 발현에 대한 이해도를 높이는 데 추가적으로 활용될 수 있습니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.