Name: Immunoperoxidase 분석을 사용하여 인간 Coronaviruses의 적정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-28T22:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 학습하세요 인간 코로나바이러스의 면역퍼옥시다제 분석법을 이용한 정량화 방법을. 세포 배양 준비와 직렬 희석을 통한 바이러스 적정 측정 기술을 익혀 정확한 바이러스 감염력 분석 능력을 향상시키세요.

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이 실험 방법에 대한 전체 텍스트 프로토콜에서 사용할 수 있습니다 <a href="http://www.springerprotocols.com/">스프링거 프로토콜</a> .

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.
Revised Abstract:
Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.
Original Abstract:
Calculation of infectious viral titers represents a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). An alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) is herein described for the detection and titration of these viruses. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of samples in a 96-well plate. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as "Tissue Culture Infectious Dose" (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain replicating virus. This technique is a reliable method for the titration of HCoV in biological samples (cells, tissues or fluids).

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

immunoperoxidase 분석을 사용하여 인간 coronaviruses의 적정

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

전염성 바이러스 titers의 계산 virologists위한 기본적인 필수 실험 방법을 나타냅니다. 고전 플라크의 assays는 종자 229E 인간 coronavirus (HCoV)의 OC43의 경우는 상당한 cytopathic 효과를 발생하지 사용할 수있는 최신 바이러스 예방 프로그램으로 사용할 수 없습니다. 다른 간접 immunoperoxidase 분석 (IPA)는 본 이들 바이러스의 감지 및 적정에 대해 설명되어 있습니다. 민감한 세포는 96 - 웰 플레이트에 샘플 시리얼 로그 dilutions와 주사를하고 있습니다. 바이러스성 성장 후, I​​PA의 바이러스 검출은 &quot;조직 문화 전염성 선량&quot;(TCID50)로 표현 전염성 바이러스 titer를 산출. 이것은 실험실 우물 일련의 절반이 복제 바이러스를 포함하는에서 바이러스가 포함된 시료의 희석을 나타냅니다. 이 기술은 생물 학적 샘플에서 HCoV의 적정 (세포, 조직 또는 체액)에 대한 안정적인 방법입니다.

이 비디오에서 우리는 immunoperoxidase 분석으로 알려진 효소 항원 검출 기법을 사용하여 바이러스 감지 및 titering위한 대체 방법을 보여줍니다. 여기, 우리는 여러분의 바이러스 샘플을 수집하는 방법을 보여 테스트 세포를 준비하고, 바이러스 titer를 결정하는 일련 dilutions를 사용하여 최종 immunoperoxidase 분석됩니다.

Immunoperoxidase 분석을 사용하여 인간 Coronaviruses의 적정

감염성 바이러스 역가의 결정은 바이러스학자들에게 기본적이면서도 필수적인 실험적 접근 방식입니다. 전통적인 플라크 분석법(plaque assay)은 ...에 사용할 수 없습니다.

감염성 바이러스 역가를 계산하는 것은 기본적인 실험적 접근 방식입니다. 하지만, 인간 코로나바이러스와 같이 세포병변효과(cytopathic effects)가 나타나지 않는 바이러스의 경우, 플라크 분석법(plaque assays)을 사용하는 전통적인 방법은 가장 신뢰할 만한 방법이 아닙니다. 본 영상에서는 면역과산화효소 분석법(immunoperoxidase assay)으로 알려진 효소 항원 검출 기술을 사용하여 바이러스를 검출하고 역가를 측정하는 대안적인 방법을 시연합니다.본 영상에서는 바이러스 샘플을 수집하고, 테스트를 위한 세포를 준비하며, 최종적으로 연속 희석을 이용한 면역 퍼옥시다아제 분석법으로 바이러스 역가를 측정하는 방법을 보여드리겠습니다. 안녕하세요, 저는 캐나다 퀘벡주 라발에 위치한 AM RIP 연구소의 신경면역학 실험실 소장인 Pierre Albo 박사입니다. 오늘은 배양 시 플라크를 형성하지 않는 프로토타입 균주인 인간 코로나바이러스 OT 43 및 29E 균주를 정량화하는 방법을 시연하겠습니다.따라서 우리는 이 문제를 해결하기 위한 분석법을 개발했습니다. 이것을 면역과산화효소 분석법(Immunoperoxidase assay)이라고 합니다. 이 프로토콜을 시연하기 위해, 제 학생인 Gabrielle Marol, 기술자인 Francis Nader, 그리고 연구원으로 참여한 Ellan Jacob을 소개하겠습니다.이제 시작하겠습니다. 먼저 조직 샘플을 준비하겠습니다. 각 장기를 수집하는 데 사용할 멸균 튜브의 무게를 미리 측정하는 것부터 시작합니다.각 빈 튜브의 무게를 측정한 후, 멸균 상태에서 빠르게 관심 장기를 적출하여 얼음 위에 보관합니다. 각 적출 단계 사이에 도구를 70% ethanol로 헹구는 것이 중요합니다. 장기 수집이 완료되면, 각 생물학적 시료의 무게를 측정합니다.다음으로, 층류 후드 내에서 polytron 균질기를 사용하여 조직 샘플을 10% 멸균 PBS와 함께 균질화합니다. 균질기를 켠 다음, 튜브를 위아래로 움직여 조직을 분쇄합니다. 각 샘플의 균질화가 끝나면 다음 조직 샘플을 처리하기 전, 장치를 멸균수로 한 번, 70% ethanol로 한 번, 마지막으로 PBS로 세척합니다.시료를 균질화한 후, 4°C에서 20분 동안 튜브를 원심분리합니다. 1000 Gs에서 상층액을 수집하여 새로운 멸균 튜브에 옮깁니다. 이 단계에서 바이러스 시료를 면역과산화효소 검출을 위해 처리할 수 있습니다.그렇지 않을 경우, 즉시 -80°C에서 급속 냉동하여 분석 준비가 될 때까지 보관할 수 있습니다. 다음으로, 세포 샘플을 준비하겠습니다. 부착성 세포와 비부착성 세포를 준비하는 방법은 서로 다르지만, 두 방법 모두 세포 내 및 세포 외 바이러스 역가를 수집하는 과정을 포함합니다.부착 세포의 세포 외 바이러스 생성을 결정하기 위해, 감염 후 적절한 시점에 감염된 세포로부터 상층액과 멸균 튜브를 수집합니다. 세포 내 바이러스 역가를 추정하기 위해서는, 먼저 배지를 제거하고 따뜻하고 멸균된 PBS로 세포를 세척한 다음, 동일한 부피 또는既知의 부피의 배지를 첨가하고 영하 80 °C에서 세 차례의 동결-해동 주기를 수행합니다. 이 과정을 통해 세포가 용해되어 바이러스 입자가 배지로 방출됩니다.비부착 세포의 경우, 먼저 세포를 1,000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포를 펠렛화한 후, 상층액을 멸균 튜브에 수집합니다. 이것이 감염성 바이러스의 세포 외 부분을 나타냅니다.다음으로, 세포 펠렛을 수집한 상층액과 동일한 부피 또는 알려진 부피의 배양 배지에 현탁합니다. 이제 -80 °C에서 세 차례의 동결-해동 사이클을 수행하여 세포를 용해하고 배지 내로 바이러스 입자를 방출시킵니다. 이는 감염성 바이러스의 세포 내 분획에 해당합니다.부착성 또는 비부착성 세포를 용해한 후, 1,000 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 이제 상층액을 새로운 멸균 튜브에 수집하여 면역 과산화효소 분석법(immunoperoxidase assay)으로 역가를 분석할 수 있습니다. 또는 샘플을 즉시 -80 °C에서 급속 냉동하여 분석 시까지 보관할 수도 있습니다.생물학적 시료 내 인간 코로나바이러스 감염의 생산성을 테스트하기 위해, 코로나바이러스 감수성 세포를 대상으로 면역 과산화효소 분석법을 사용하고자 합니다. 먼저, 합류 단일층(confluent monolayer)으로부터 감수성 세포 현탁액을 만들기 위해 트리psin화 및 처리 과정을 거칩니다. 인간 코로나바이러스 작업 시, 2 29 EL 1 32 세포를 감수성 세포로 사용하며, 인간 코로나바이러스 OC 43의 경우 감수성 세포 현탁액을 생성한 후 HRT 18 세포주를 사용합니다. 이후 이 세포들을 조직 배양용 96-웰 플레이트에 분주합니다.멀티채널 파이펫을 사용하는 경우, 적절한 세포 농도의 세포 현탁액 100 µL를 웰당 분주합니다. 웰당 민감 세포 수는 사용된 세포의 종류와 세포 접종 시점에 따라 달라집니다. 플레이팅 후의 자세한 내용은 Springer 프로토콜을 참조하십시오.면역 과산화효소 분석(immuno peroxidase assay)을 시작하기 전, 미리 준비한 시료를 감수성 세포에 감염시켜야 합니다. 감수성 세포의 합류도(confluency)가 70~80%에 도달하면, 96-웰 플레이트를 멸균 티슈 페이퍼로 감싼 뒤 다른 멸균 종이 위에 엎어놓고 가볍게 쳐서 각 웰의 배지를 제거합니다. 다음으로, 각 웰에 1% FBS가 첨가된 $\alpha$-MEM 100 $\mu$L를 넣습니다.각 시료는 인접한 4개의 컬럼에서 테스트해야 합니다. 동일한 플레이트의 첫 번째 행에 테스트할 분주액을 웰당 100 µL씩 넣습니다. 일반적으로 감염된 시료를 연속 대수 희석하여 감수성 세포에 접종합니다.이를 위해, 네 개의 웰에 동일한 샘플을 웰당 11 µL씩 다시 추가합니다. 이제 96웰 플레이트의 두 번째 행에서 멀티채널 파이펫을 이용해 세 번 위아래로 파이펫팅하여 혼합한 후, 각 웰에서 11 µL를 세 번째 행으로 옮기고 플레이트의 마지막 행까지 이 과정을 반복합니다. 세포 접종이 완료되면, 인간 코로나바이러스의 경우 5% CO2가 포함된 33 °C의 가습 챔버에서 플레이트를 배양합니다.2290 감염 세포는 5일 동안 배양하고, 인간 코로나바이러스 OC 43 감염 세포는 4일 동안 배양합니다. 그 후 바이러스 검출 단계로 진행할 수 있습니다.배양 후, 바이러스를 검출할 준비가 되었습니다. 먼저 배지를 완전히 제거하는 것부터 시작합니다. 층류 후드(laminar flow hood) 내에서 플레이트를 비멸균 종이 타월 위로 튕겨 배지를 제거합니다.그 다음, 멀티 채널 피펫을 사용하여 웰에 PBS를 조심스럽게 채워 세포를 부드럽게 헹굽니다. 웰에서 PBS를 털어내어 제거하고, 각 플레이트를 종이 티슈로 감싸 남아 있는 PBS를 모두 제거합니다.세포를 세척한 후, 0.3% 과산화수소가 포함된 100% 메탄올로 세포를 고정합니다. 세포에 메탄올 혼합물을 첨가하고 실온에서 15~30분 동안 방치합니다. 30분간의 배양 후, 플레이트를 싱크대 위에서 털어 고정액을 제거합니다. 잔류 고정액은 벤치top에 깔아둔 여러 장의 페이퍼 타월 위에 플레이트를 엎어 털어냄으로써 제거합니다.그다음 세포가 건조되는 동안 약 15분에서 30분 동안 면이 위를 향하게 하여 완전히 자연 건조하십시오. PBS에서 적절한 희석 배율로 해당 바이러스에 특이적인 항체 용액을 준비할 수 있습니다. 다음으로, 각 웰에 특이적 바이러스 항체 100 µL를 첨가하고 37 °C의 배양 플레이트에서 2시간 동안 배양하십시오.배양 후, 플레이트를 싱크대에 대고 가볍게 쳐서 배지를 완전히 제거합니다. 웰에 PBS를 채워 플레이트를 헹굽니다. 그런 다음 플레이트를 싱크대에 대고 가볍게 쳐서 PBS로 헹궈냅니다.이 과정을 두 번 더 반복합니다. 웰을 아래로 향하게 하여 벤치탑에 깔아둔 비멸균 종이 타월에 톡톡 쳐서 잔류 PBS를 모두 제거합니다. 다음으로, 1:1000으로 희석한 2차 항체 100 µL를 각 웰에 첨가합니다.PBS로 희석한 후, CO2 없이 37°C에서 2시간 동안 플레이트를 배양하며, 배양 종료 30분 전에 준비합니다. DAB와 PBS, 0.01% hydrogen peroxide의 혼합물인 검출 시약을 준비합니다. 이전과 동일하게 PBS로 플레이트를 세 번 헹굽니다.플레이트를 세척한 후, 각 웰에 발색 시약을 100 µL씩 첨가합니다. 실온에서 10~20분 동안 또는 양성 대조군이 염색될 때까지 배양합니다. 반응을 중단시키기 위해, 이전에 PBS를 사용했던 것과 동일한 방식으로 플레이트를 물로 한 번 세척하고 각 웰을 100 µL의 탈이온수로 채웁니다.마지막으로 광학 현미경으로 플레이트를 관찰하여 염색된 세포가 나타나는 모든 웰의 수를 정량화합니다. 이제 마침내 바이러스의 역가를 결정할 수 있습니다. 이는 car 방법을 사용하여 계산할 수 있으며, 해당 식은 이 비디오와 함께 제공되는 Springer 프로토콜에서 확인하실 수 있습니다.지금까지 이 절차를 수행할 때 인간 코로나바이러스를 적정하는 방법을 보여드렸습니다. 바이러스가 포함된 샘플을 다루고 있으며, 반드시 멸균 상태에서 작업해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 방법은 높은 감도에 감염된 생쥐들의 bronchioalveolar 세척 (BAL) 유체에서 H1N1의 탐지를위한 적외선 염료 기반 이미징 시스템의 사용을 설명합니다. 이 방법론은 96에서 수행할 수 있습니다 - 또는 판 384 자, 시험 물질 &lt;10 μl 볼륨이 필요하고 여러 병원체의 동시 상영을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

이 비디오는 인간 혈청에서 α2,6 연결된 시알산을 과발현하는 Madin-Darby Canine Kidney cell을 사용하여 중화 항체를 측정하는 Microneutralization 분석을 보여줍니다. 이 분석법은 종종 인플루엔자 인간 혈청학에...

인간 혈청에서 중화 항체 역가를 측정하기 위한 미세중화 분석

이 동영상은 혈청 샘플에서 인플루엔자 뉴라미니다아제(NA) 억제 항체 역가를 측정하는 분석을 보여줍니다. NA에 대한 항체를 포함하는 혈청 샘플을 페투인(fetuin)으로 코팅된 마이크로웰 플레이트에 첨가합니다. 바이러스를 추가하면 항체가 바이러스 NA가 fetuin을 쪼개고 갈락토오스 부분을 노출시키는 것을 방지합니다. 그런 다음 과산화효소(peroxidase-conjugated lectin)가 첨가되어 노출된 갈락토스에 결합합니다. NA 억제 항체 역가는 비색 테스트를 사용하여 측정되며, 여기서 과산화효소 기질은 고정된 렉틴 접합 과산화효소에 의해 절단되어 색상을 생성합니다.

인플루엔자 뉴라미니다아제 억제 항체 역가를 측정하기 위한 분석

이 비디오는 SARS-CoV-2 바이러스를 중화하는 혈청 효능을 측정하는 중화 분석을 보여줍니다. 여기에는 pseudotyped 바이러스, 혈청 희석 및 발광 기반 정량화가 포함되어 중화 역가를 밝힙니다.

기능성 SARS-CoV-2 중화항체 평가

혈청에서 인플루엔자 뉴라미니다아제(NA) 억제 항체 역가를 측정하기 위한 효소 결합 렉틴 분석법(ELLA)을 설명합니다. 이 분석은 땅콩 응집소를 사용하여 NA가 fetuin으로 코팅된 96웰 플레이트에서 시알산을 제거할 때 접근할 수 있는 갈락토오스 잔류물을 정량화합니다.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

이 연구는 설명   영상 기반의 마이크로 중화 분석은 바이러스의 항원 성 관계를 분석합니다. 이 프로토콜은 평판 스캐너를 사용하고 적정, 적정 정량, 중화, 중화 정량 등 4 단계가있다. 분석은 현재 순환 인플루엔자 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 바이러스와 함께 잘 작동합니다.

정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

인플루엔자 중화 항 체는 인플루엔자 감염의 보호와 연관. Microneutralization 분석 실험 인간 혈 청의 중화 항 체를 측정 하 고 자주 독감 인간의 혈 청 학에 대 한 사용 됩니다. 인플루엔자 예방 접종 또는 감염 다음 현대 3C.2a 및 3C.3a A(H3N2) 바이러스 중화 항 체 titers 측정 MDCK-SIAT1 세포를 사용 하 여 microneutralization 분석 결과 설명 합니다.

사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 분석 실험 측정 인플루엔자 항 체 응답 Microneutralization에 의해 인간의 세라에 A(H3N2) 바이러스를 중화

여기서 설명된 프로토콜은 스파이크 당단백질로 의사형인 향상된 녹색 형광 단백질 표지 된 정맥낭염 바이러스에 의해 감염을 억제하는 병류 혈청 샘플의 능력을 평가함으로써 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 중화 항체를 측정하는 빠르고 효과적인 방법을 설명합니다.

의사 바이러스 감염의 높은 처리량 형광 화상 진찰을 사용하여 SARS-CoV-2 중화 항체의 검출

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TCID50 에세이를 사용하여 바이러스 성 적정에 대한 시각적 세포 병증 효과 기반 읽기를 개선하기 위해 크리스탈 바이올렛의 사용

유사형 바이러스(PV)는 실제 바이러스를 취급하는 것보다 더 안전한 조건에서 숙주-바이러스 상호 작용을 연구하는 데 사용되는 복제 결함 바이러스입니다. 여기에 제시된 자세한 프로토콜은 SARS-CoV-2 PV를 사용하여 COVID-19 백신 접종 후 환자 혈청의 중화 능력을 테스트하는 방법을 보여줍니다.

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Immunoperoxidase 분석을 사용하여 인간 Coronaviruses의 적정

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