Name: 골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-09T16:32:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: 배우세요 뼈에서 유래한 수지상 세포의 분리 및 배양 방법을 통해 면역 반응에서 항원 특이적 세포 상호작용을 2광자 영상으로 관찰하는 기술을 익히세요.

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건강 Kirchstein 원정대 predoctoral 교제 AI - 64128 (MPM), GM - 41514 (MDC), GM - 48071 (IP)의 국립 연구소

1) 쥐 한마리에서 모두 대퇴골의 뼈를 제거 <ol><li> 근육 버려야하고 (무릎 및 고관절) 이상과 관절 아래의 대퇴골 뼈를 노출 해부 가위를 사용합니다. 해부의 족집게로 대퇴골의 중심을 파악하고 최대한 그대로 epiphysis의를 떠나 위의와 관절 아래 컷. </li><li> 작은 해부 가위를 사용하여 가능한 한 많은 근육으로 닦아. RPMI 한 접시에 몽둥이를 전송합니다. </li><li> 모든 절차는 무균 미디어, 악기, 피펫 팁 문화 요리를 사용하여,이 시점부터 후드에서 수행되어야합니다. </li></ol> 2) 대퇴골의 뼈를 소독 : <ol><li> 후드에서 RPMI에서 얼음에 70 % 에탄올로 가득 작은 문화 요리에 유골​​을 전송할 수 있습니다. </li><li> 뼈가 얼음에 5 분 에탄올에 담그다 수 있습니다. </li></ol> 3) 무균 조건 하에서 골수를 수집합니다 <ol><li> 무균 여과 기본 DC 문화 매체를 포함하는 작은 문화 요리에 유골​​을 전송합니다. </li><li> 멸균 핀셋으로 폐기 접 관을 통해 뼈를 보유하고 멸균 가위로 (뼈의 종료) 각 epiphesis 잘라. 절단은 뼈의 중앙에 밝은 빨간색으로 골수를 노출해야합니다. </li><li> 멸균 주사기 (26-28 게이지 바늘)으로 살균 미디어 100-200에 대해 ML을 빨아. </li><li> 무균 미디어 신선한 음식을 통해 멸균 핀셋으로 뼈를 잡고 뼈의 한쪽에 바늘을 삽입합니다. 뼈 상단의 바늘의 끝 위치를 천천히 멸균 미디어 뼈를 씻으십시오. 당신이 뼈의 중심에있다면, 바늘은 쉽게 슬라이드한다. </li><li> 골수는 작은 조각 또는 한 조각으로 역시 밖으로 씻는다. 그것은 뼈 및 살균 미디어의 그릇에 밖으로 플러시해야합니다. </li><li> 완전히 뼈의 골수를 씻어 필요에 따라이 단계를 반복합니다. </li><li> 뼈를 깨끗하게되면, 그것은 흰색과 반투명 것입니다. </li><li> 다른 대퇴골 뼈이 절차를 반복합니다. 깨끗하게되면 각각의 대퇴부 뼈를 폐기하십시오. </li></ol> 4) 다시 일시 중지 및 골수 세포를 스핀 다운 : <ol><li> 멸균 팰컨 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 골수이 아직도 그대로있다면, 아주 부드럽게 단일 세포 현탁액으로 골수를 깨고, 접시에 미디어를 피펫 아래. 이것은 몇 분 정도 걸릴 수 있으며 깎아지른듯한 강제로 세포를 죽이는 않도록 천천히 이루어져야합니다. </li><li> 어떤 다른 포유 동물 세포처럼 세포 원심 분리기. </li></ol> 5) 셀 용해 : <ol><li> 회전이 완료 후 원심 분리기에서 튜브를 제거하고 후드에있는 작은 쓰레기 (50 ML 팔콘 튜브)로 미디어에서 (가만히 따르다)를 부어. </li><li> 부드럽게 튜브의 바닥을 flicking하여 Resuspend 펠릿. </li><li> 무균 여과 물 10X DPBS 또는 10X PBS를 사용하여 다음 볼륨을 사용하여 적혈구 (RBCs)를 제거하는 물 용해를 수행 : <ul><li> 900 ML 무균 여과 물 </li><li> 100 ML 10X DPBS 또는 10X PBS </li></ul></li><li> 물을 추가한 후 10X PBS 50-10초 100 ML을 추가합니다. 그것은 즉시만을 RBCs가 lysed 것을 이렇게 매우 중요합니다. 그것은 두 pipettes 준비 채워 가지고하는 것이 좋습니다. </li><li> 무균 DC 기본 미디어 10 ML - 5 ML을 추가합니다. </li></ol> 6) 셀 카운트 : <ol><li> 후드에서 부드럽게 약간 역전, 45도 기울기 (미디어 튜브의 상단을 접촉하지 않도록)와 튜브를 소용돌이 치는하여 골수 세포의 6-11 ML를 섞어 </li><li> 계산을위한 멸균 튜브에 미디어 10 ML를 제거합니다. </li><li> 다시 모자 세포 원심 다시. </li></ol> 7) 도금 돌기 세포 : <ol><li> 전지는 1 X 106/mL의 밀도에 도금해야합니다. </li><li> 도금에 대한 기본 DC 미디어의 해당 금액의 원심 분리기에서 세포, 가만히 따르다 미디어와 다시 중단 세포를 제거합니다. </li><li> 조직 문화의 인큐베이터에 놓습니다. </li></ol> 8) 문화 케어 및 성숙 : 항상 더 많은 미디어를 추가하거나 실험에 사용하기 전에 문화를 확인하십시오. 세포의 일반적인 건강을 확인하고 잠재적인 오염을 찾습니다. DAY 0 : 돌기 세포 도금. DAY 3 : 미디어 비 adherant 세포의 75 %를 제거하고 다시 기본 DC 미디어를 추가합니다. DAY 6 : 초기 셀 도금 후 다음 절차를 사용하여 다시 판 전지 : <ol><li> (당신은 자기편 세포가 건조하고 싶지 않아요) 매우 약간 서부 유럽 표준시 번호판을 떠나, 살균 50 ML 팔콘 튜브의 일부가 아닌 adherant이 시점에서 DC가, 장소를 포함한다 미디어를 제거 </li><li> 각 플레이트에 PBS 3 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하고 5 분 앉아 수 있습니다. </li><li> 45도 각도에서 접시를 잡고 부드럽게 부드럽게 비 adherant 세포를 이동시키다하는 접시의 바닥에 대한 미디어를 피펫 아래. </li><li> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) / PBS는 두껍게 나타내는 세포의 바닥에서 수집되는 되야지판. </li><li> 이 몇 분 후에 세포 혼합물은 50 ML 팔콘 튜브로 전송하실 수 있습니다. </li><li> 각 플레이트에 대해이 절차를 수행한 후 모든 셀을 스핀. </li><li> 1 밀도에 카운트 및 플레이트 세포 X 10 ^ 새로운 살균 10cm 문화 요리 보조 DC 미디어 6 회 판. 조직 문화의 인큐베이터로 세포를 반환합니다. </li></ol> DAY 10-11 자극 / 항원 로딩 준비 성숙 DC가. 9) 돌기 세포 자극 : <ol><li> 활성화 및 펩티드 로딩을​​ 위해 원하는 펩타이드와 함께 LPS를 (lipopolyscaccharide)를 사용합니다. LPS의 소스에 따라 서로 다른 자극 조건은 더 나은 결과를 제공할 수 있습니다. 또한, DC 프레 젠 테이션을 위해 펩타이드의 원하는 금액을 최적화해야합니다. 이 프로토콜의 자극 조건은 10​​0 NG / ML LPS 100 UG / ML OVA (ovalbumin)되었습니다. </li><li> 로드 항원 / 사전 수확 18-24시간에 대한 LPS와 치료 / 사용합니다. </li></ol> 돌기 세포 미디어 : 모든 후 무균 필터가 추가되었습니다 다른 돌기 세포 배양 조건을 검토하고 그 결과 돌기 세포 표현형에 대한 토론 섹션을 참조하십시오. 이러한 문화 조건이 성숙 돌기 세포를 생산하도록 설계되는 급속 18~24시간 피하 주사하고 효율적으로 현재의 항원 후 배수 림프절에 집. 기본 DC 미디어 : 모든 후 무균 필터가 추가되었습니다 <ul><li> 500 ML IMDM (500mL 최종 볼륨 55-60 ML 제거) </li><li> 50 ML 열 inactivated FBS </li><li> 200 MM L - Gln, 2 mm의 최종 농도 5 ML </li><li> 100 IU / ML 페니실린과 100 MG / ML 스트렙토 마이신 (10,000 IU / ML 펜 및 만 MG / ML Strep 주식 5 ML) </li><li> 50 음 B - 나 (14.3 M B - 내 물건은 화학 후드에 1:100을 희석, 50 micromolar 집중력 100 ML 미디어 당 35 UL 사용) </li><li> 20-30 NG / ML GM - CSF </li><li> 100-400 IU / ML IL - 4 약 10-40 NG / ML </li></ul> 성숙의 *에 대한 SecondaryDC 미디어 100 NG / ML TNF - 알파 (기본 DC 미디어에 추가) * 참고 : GM - CSF + IL - 4는 어려서 돌기 세포를 생산한다. GM - CSF를 사용하여 + IL4 (400 IU / UL) + TNF - 알파 (100 UG / ML)은 성숙 단핵구 파생 돌기 세포 유사 세포를 생성합니다. 중년 여인 돌기 세포는 미숙 돌기 세포와 문화가 내생 TNF - stromal 세포에서 출시 4 수 있습니다 한한 효율적으로 항원을 차지하지 알려져 있습니다.

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</ol>

돌기 세포는 적응 면역 반응과 날짜에 특징이 가장 효율적인 항원 제시 세포의 핵심 중재자입니다. 문학 인간 및 마우스의 돌기 세포 배양을위한 방법은 다른 돌기 세포 유형의 발전에 영향을 미치는 데 사용 크린 시토킨의 종류에 차이가 있습니다. 특히, GM - CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF - 알파와 IFN - 감마는 성숙 미숙, 염증 및 정상 상태 체외 3-7에서 돌기 세포를 파생 murine 골수와 같은 생산하는 다른 조합에 사용됩니다. 여기, 우리는 능력이 성숙 murine 돌기 세포의 생산을위한 간단한 방법을 제시 유도, 피하 주사 후 림프절을 고갈 T 세포를하신 나 항원 및 활성화를 제시합니다. 그 결과 돌기 세포 인구는 일반적으로 LPS 활성화시 CD80/86의 inducible 표현과 함께&gt; 85 % CD11chigh입니다. 일 7 문화 TNF - 의 추가는 선택 사항이며보다 성숙한 phenotype8을 생산하고 있습니다. 체외 Langerhans 돌기 세포 배양에의 유지 보수,...

골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 murine 돌기 세포를 유래

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

murine 돌기 세포의 준비를 위해 여러 가지 방법이 문헌에서 찾을 수 있습니다. 여기, 우리는 문화에 이상 85% CD11c 높은 돌기 세포를 생산하는 방법을 제시 것을 피하 주입 및 항원 구체적인 T 세포 (동영상 참조) 현재 항원 후 배수 림프절의 고향. 또한, 우리는 일 10시 교양 세포의 형태가 성숙 돌기 세포와 세포의 &lt;85% CD11chigh 아르의 전형이며, 돌기 세포 성숙을 추적하기 위해 에센 악기에게 Incucyte을 사용합니다. 2 - 광자 이미징에 의해 주변 림프절에 항원 프레 젠 테이션의 연구는 돌기 세포와 T 세포 상호 작용 1, 2의 세 개의 서로 다른 단계가있다는 것을 밝혔다. 페이즈 I는 매우 운동성이있는 특정 항원 T 세포와 돌기 세포 1, 2를 들고 항원 사이의 간단한 시리얼 연락처로 구성되어 있습니다. 차 두 항원에 특정한 T 세포와 돌기 세포 1, 2 베어링 항원 사이에 장시간 접촉에 의해 표시됩니다. 마지막으로, 단계 III는 운동성을 회복하고 1, 2,을 분할하기 시작, 돌기 세포에서 분리 T 세포에 의해 특징입니다. 이것은 항원 -로드 셀 추적 염료 분류 돌기 세포의 2 광자 영상으로 분석할 수 항원 특정 상호 작용의 유형의 한 예입니다.

돌기 세포에 의해 이차 림프​​ 장기의 항원 프레 젠 테이션은 T 세포 적응 면역 반응을 중재의 개시를 위해 중요합니다. 여기서 우리는 골수의 문화 파생 murine 돌기 세포, 활성화 및 2 광자 이미징에 대한 라벨을 보여줍니다.

골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

마우스 수지상 세포를 준비하기 위한 여러 가지 방법이 문헌에 보고되어 있습니다. 본 논문에서는 85% 이상의 ...를 생성하는 방법을 제시하고자 합니다.

골수로부터 수지상 세포를 준비하는 것은 면역 체계의 2광자 이미징을 이용한 in vitro 또는 in vivo 실험에 사용할 수 있는 항원 제시 세포의 훌륭한 공급원을 제공합니다. 항원 제시 세포를 도입함으로써 살아있는 림프절 환경 내에서 항원 특이적 세포 간 상호작용을 연구할 수 있습니다. 본 영상에서는 골수의 무균 분리 방법과 성숙한 수지상 세포 생산을 위한 배양 기술을 설명합니다.또한, 1일부터 11일까지 수지상 세포의 발달 과정을 추적합니다. 이러한 발달 과정은 정지 영상과 scent technologies incus site를 사용하여 제작한 인큐베이터 영상으로 묘사됩니다. 마지막으로, 골수 유래 수지상 세포가 배수 림프절에서 OT two T 세포에 cove 항원을 제시하는 모습을 보여줍니다.안녕하세요, 저는 인근 캘리포니아 대학교의 Micah Halen 연구실에 있는 Melanie Matthew입니다. 세포가 성장하는 동안 내부에서 어떤 일이 일어나는지 궁금해하신 적이 있나요? 오늘은 그것에 대해 알아보겠습니다.본 프로토콜의 일부로, 현장의 일부 기기 사용 방법을 설명하겠습니다. Inky 사이트를 통해 인큐베이터 내 세포 배양 성장을 추적할 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 준비하는 방법을 보여드리겠습니다.가장 먼저 대퇴골을 제거하고 골수를 분리하는 방법을 보여드리겠습니다. 우선 동물을 고정합니다. 다음으로 동물에게 70% ethanol을 적셔 줍니다. 동물의 중앙선을 따라 첫 번째 절개를 실시합니다.그런 다음 여기 보여드리는 것처럼 다리 안쪽을 절개하십시오. 대퇴골 위의 근육 조직을 노출시키려면, 근육을 옆으로 밀어내고 해부용 핀셋으로 커다란 대퇴골을 잡을 수 있어야 합니다. 해부용 핀셋으로 뼈를 잡은 상태에서 뼈를 따라 아래로 이동하여 관절 바로 아래 지점에서 첫 번째 절개를 수행하십시오.그런 다음 가위를 대퇴골의 길이를 따라 위로 움직여 몸체에 최대한 가깝게 절단합니다. 특히 대퇴동맥을 절단할 경우 소량의 출혈이 발생할 수 있습니다. 대퇴골을 제거할 때 뼈가 손상되지 않고 온전하게 유지되는 것이 매우 중요합니다.여기서 보시는 바와 같이 뼈의 끝부분이 절단되거나 손상되지 않았습니다. 대퇴골을 제거한 후, 추가 조직을 잘라내고 대퇴골을 PMI 배지가 담긴 작은 접시에 넣으십시오. 추가 조직을 제거할 때 대퇴골이 마르지 않도록 주의하십시오.이 단계에서 대퇴골을 70% ethanol이 담긴 접시에 옮겨 얼음 위에 5~10분 동안 둡니다. 본 영상에서는 실험대 위에서 계속 진행하지만, 실제 실험의 이 단계부터는 모든 과정을 조직 배양 후드 내부에서 수행해야 합니다.뼈를 에탄올에 담근 후, 골수를 제거하기 위해 멸균 배지가 담긴 더 큰 접시로 옮깁니다. 이제 골수를 제거하고 재현탁할 준비가 되었습니다. 인슐린 주사기에 멸균 배지를 채워 나중에 사용할 수 있도록 옆에 둡니다.멸균 핀셋으로 뼈를 잡습니다. 폐기물을 담을 작은 플레이트 위에 뼈를 두고 양쪽의 골단 또는 뼈 끝부분을 잘라냅니다. 인슐린 주사기를 뼈의 한쪽 끝에 삽입하고 골수를 밀어내어 15 mils의 배지로 옮깁니다.골수 성분이 모두 씻겨 나갈 때까지 뼈를 한두 번 더 세척합니다. 골수가 모두 제거되면 뼈는 거의 완전히 하얀색이 됩니다. 깨끗해진 뼈를 폐기 접시에 넣고 반대편 대퇴골에 대해서도 동일한 과정을 반복합니다.이 과정이 완료되면, 세척 과정에서 분리되지 않은 골수 조각들을 조심스럽게 파쇄하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 이 피펫팅 작업에는 5~10분이 소요됩니다. 단일 세포 현탁액을 50 mL 코니컬 튜브에 넣고, 10 mL의 배지로 플레이트를 최소 3회 세척합니다.매회 세포를 원심 분리하여 가라앉힌 후, 배지를 제거하고 튜브 바닥을 손가락으로 강하고 빠르게 문질러 세포를 다시 현탁합니다. 적혈구(RBC)를 제거하기 위해 수성 용해(water lysis)를 수행합니다. 적혈구를 제거하는 또 다른 방법으로는 염화암모늄 용해(ammonium chloride lysis)가 있습니다.두 방법 모두 이전 JoVE 비디오 논문에서 설명되었습니다. Miltenyi Biotec 정제법을 이용한 생쥐 림프절에서의 CD4 양성 T-세포 분리(JoVE 제9호) 및 쥐 사이토카인으로부터의 T-세포 성장 인자 준비(JoVE 제10호)가 그것입니다.적혈구를 제거한 후, 이제 세포 배양을 시작할 준비가 되었습니다. 따라서 수지상 세포 배양 과정을 안내하기 전에, 인큐베이터 내부의 모습을 보여드리겠습니다. 인큐베이터 내부에서는 수지상 세포의 배양 성장을 관찰할 수 있어, 세포가 어떻게 반응하거나 변화하는지 확인할 수 있습니다.배양이 설정되면, 이를 적절한 크기의 트레이에 넣고 인큐사이트(IncuCyte) 사이트를 닫습니다. 그다음 컴퓨터에서 시간 간격을 설정하고 이미지를 획득할 웰을 선택하면, 인큐사이트가 자동으로 데이터를 수집합니다. 본 프로토콜의 영상에서는 인비트로(in vitro) 환경에서의 수지상 세포 형태 변화를 보여줍니다.이 영상들은 Incus 사이트 프로그램에서 직접 내보낸 것입니다. 수지상 세포가 1일 차부터 11일 차까지 분화됨에 따라, 세포가 커지고 수지상 세포의 표현형을 갖추면서 나타나는 실제적인 형태 변화를 확인할 수 있습니다. 적혈구를 용해하여 제거한 후, 세포를 일차 수지상 세포 배지로 세척하고 밀리리터당 5 million 개씩 도말합니다.이 세포들은 처음에 일차 수지상 세포 배양 배지에서 배양해야 하며, 이후에는 40 ng/mL의 IL-4와 100 ng/mL의 TNF-α가 첨가된 이차 DC 배지에서 배양합니다. 이러한 사이토카인들은 단핵구 유래 수지상 세포와 유사한 성숙한 수지상 세포의 발달을 돕습니다. 이제 배양 세포가 발달함에 따라 어떤 모습인지와 시간이 지남에 따라 어떻게 유지하는지 보여드리겠습니다.세포를 플레이팅한 후, 첫 번째 배지 교체 전까지 수지상 세포를 72시간 동안 배양할 수 있습니다. 다음은 1일 차에 세포를 플레이팅한 직후의 전형적인 배양 모습입니다. 그리고 여기 세포의 모습이 있습니다.3일 차에는 세포가 플레이트에 부착되기 시작했으나, 전형적인 수지상 세포 표현형은 아직 나타나지 않은 것을 확인할 수 있습니다. 4일 차에 배지를 제거하고 10 mL의 신선한 primary DC 배지를 첨가하여 배지를 흡입합니다. 4일 차에 림프구 및 기타 비부착 세포들을 제거하겠습니다.이제 세포를 다시 인큐베이터에 넣고, 초기 플레이팅 후 7일째 되는 날까지 3일 더 배양합니다. 일반적인 배양 상태는 다음과 같습니다. 이 상태가 되면 세포를 분할하여 계대 배양할 시점임을 알 수 있습니다.7일째에, 배지를 흡입하여 제거한 후 300 millimolar 멸균 EDTA를 첨가하고 5분 동안 배양하여 플레이트에서 수지상 세포를 분리합니다. 그런 다음 플레이트를 45도 각도로 기울인 상태에서 플레이트 뒷면에 EDTA 용액을 피펫팅하여 반복적으로 헹굽니다. 모든 부착 수지상 세포가 제거되도록 이 과정을 수분 동안 수행합니다.세포를 50 mL 원추형 튜브에 수집하고 secondary DC 배지로 2회 세척합니다. 그 후 세포를 재부유하여 플레이트당 5백만 개의 세포가 되도록 분주합니다. 새로 분주한 7일 차 수지상 세포는 빠르게 플레이트 바닥에 가라앉아 부착되며 퍼지기 시작합니다.Zichy 사이트의 비디오에서 볼 수 있듯이, 이 비디오는 7일 차에 수행한 초기 재배양부터 9일 차 초반까지의 수지상 세포 발달 과정을 보여주기 위해 인큐베이터 내에서 이틀 동안 촬영되었습니다. 수지상 세포의 형태는 항원 펄스를 통해 활성화될 수 있으며, 여기서는 2 µg/mL의 LPS와 함께 OT-2 마우스(ova 특이적 CD4 양성 T 세포를 보유함)에서 정제한 T 세포와 사용하기 위해 100 µg/mL의 ova를 추가합니다. 다른 항원을 사용하는 경우, DC를 펄스하기 위해 최적의 항원 농도를 사용하는 것이 중요합니다. 여기서 OVA와 LPS는 최종 LPS 농도가 20 mL에서 2 µg/mL가 되고, OVA 농도가 20 mL에서 100 µg/mL가 되도록 기본 배지에 추가합니다.배양 10일째의 전형적인 수지상 세포 모습이 담긴 사진입니다. 이 사진을 통해 형태학적으로 항원 제시 세포의 전형적인 특징을 가지고 있음을 확인할 수 있습니다. 항상 FACS를 통해 CD 11 C 양성 수지상 세포의 비율을 확인해야 합니다.이는 실험에 사용할 수 있는 상대적으로 순수한 수지상 세포 배양물을 확보하기 위한 것입니다. 여기서는 SEN instruments의 inky site를 사용하여 10일 차에 LPS 처리 및 항원 펄싱을 거친 수지상 세포의 활성화를 모니터링합니다. 이 영상은 LPS와 밸 및 펩타이드 첨가 직후부터 24시간 동안의 기간을 다루며, 이 과정에서 수지상 세포가 더욱 활성화되고 뚜렷한 형태학적 변화가 나타납니다.항원 펄스(antigen pulse)를 통해 수지상 세포가 활성화되면, 300 millimolar EDTA와 함께 배양하고 플레이트를 세척하여 세포를 다시 수집할 수 있습니다. 이제 세포를 원심 분리한 다음, RPMI 배지 50 µL로 두 번 세척하여 잔류 항원을 제거하고 적절한 세포 추적 염료(cell tracker dye)로 표지하십시오. 본 실험에서는 서혜 림프절(inguinal lymph node) 내의 세포를 이미징하겠습니다.여기에 표시된 마우스의 옆구리 부위 진피에 200만에서 500만 개의 수지상 세포를 주입해야 합니다. 그 후 수지상 세포가 훈련 림프절로 이동할 수 있도록 24시간 동안 기다립니다. 본 영상에서 수지상 세포는 청색 세포 추적 염료인 CMF two hc로 라벨링되었습니다.volin에 대해 항원 특이적인 표지된 T 세포와 상호작용하는 수지상 세포를 관찰할 수 있습니다. 이 T 세포들은 ccf SE로 표지되었습니다. 분자 프로브로는 C-M-T-M-R 또는 다른 세포 추적 염료를 사용할 수도 있습니다. 이는 수지상 세포와 상호작용하는 T 세포의 초기 활성화 단계입니다.항원 특이적이기 때문에, T-세포가 청색으로 라벨링된 수지상세포(dcs)의 돌기에 부착되어 있는 것을 확인할 수 있습니다. 이것으로 이광자 이미징 실험에서 마우스 유래 골수 수지상세포의 준비 및 사용법을 보여주는 프로토콜을 마치겠습니다. 시청해주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 신생아 chimeras의 생성뿐만 아니라 2 광자 현미경으로 해부하고 예 생체내 이미징에 대한 thymus의 준비를위한 단계별 지침을 제시한다.

2 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 현장 영상에서

이 동영상은 마우스 골수에서 골수양 돌기 세포를 차별에 대한 절차를 설명합니다. 마우스 경골과 대퇴골, 그리고 골수 처리의 분리가 증명하고 있습니다. 세포 표현형 및 CPG를 사용하여 IL - 12 생산 다음과 성숙을 묘사한 분화 전후의 세포 형태를 보여주는 사진, 그림이 표시됩니다.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

돌기 세포의 이해의 항원과 T 세포 항원 처리를 제시 면역 기관으로 마이 그 레이션. Qdot nanocrystal 라벨은 오랫동안 안정 형광 신호를 제공합니다. 이것은 형광 현미경에 의해 다른 기관에 돌기 세포 추적하실 수 있습니다.

추적 연구 Qdot Nanocrystals와 Murine 골수 파생 돌기 세포의 생성 및 라벨링

이 비디오는 성체 쥐의 골수에서 수지상 세포(T 세포를 활성화하는 핵심 항원 제시 세포)를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

골수 유래 수지상 세포 생성: 마우스 골수에서 수지상 세포를 생성하는 방법

이 동영상은 일반적인 림프구 전구 세포(CLP)에서 형질세포(plasmacytoid dendritic cell, pDC)를 생성하는 체외 분석을 보여줍니다. Fms-like tyrosine kinase-3 ligand(FL)가 있는 상태에서 γ조사된 공급 세포와 함께 정제된 CLP를 공동 배양하면 CLP는 비부착성 pDC로 분화되며, 유세포 분석을 사용하여 그 존재를 확인합니다.

In vitro Generation of Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors(일반 림프구 전구 세포에서 Plasmacytoid 수지상 세포의 체외 생성)

MRI를 사용하여 세포 추적 지난 몇 년 동안 괄목할만한 주목을 받고있다. 이 프로토콜은 불소와 수지상 세포의 라벨 설명...

사용 모니터링 수지상 세포 이동<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H 자기 공명 영상

이 연구에서는 Flt3 리간드가 있는 상태에서 AC-6 공급세포와 공통 림프구 전구세포를 공동 배양하여 pDC를 효율적으로 생성할 수 있는 체외 배양 시스템을 제시합니다.

AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 체외 세대

여기 우리는 식별 하 고 격리 GM-CSF 골수성 세포 고속 셀 정렬 사용 하 여 구동의 다 수에 대 한 메서드를 제공 합니다. Ly6C 및 CD115 식에 따라 5 가지 인구 (일반적인 골수성 창시자, granulocyte/macrophage 창시자, monocytes, monocyte 파생 된 대 식 세포 및 monocyte 파생 된 DCs)를 확인할 수 있습니다.

골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성

여기, 선물이 개발 및 특성 tolerogenic 수지상 세포 (TolDCs) 하 고 그들의 immunotherapeutic 유틸리티를 평가 하는 프로토콜.

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

이 문서에서는, 우리는 murine 골에 형광 성 융해 단백질의 표정에 대 한 자세한 프로토콜 파생 수지상 세포와 대 식 세포 제공 합니다. 메서드를 기반으로 골 수의 변환에 창시자 retroviral 구문 뒤에 대 식 세포로 분화 및 수지상 세포 생체 외에서.

Murine 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포에 형광 성 융해 단백질의 표정

여기에서는 10 ng / mL GM-CSF / IL-4로 7 일 배양 한 후 마우스에서 고순도 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하는 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

배우세요 뼈에서 유래한 수지상 세포의 분리 및 배양 방법을 통해 면역 반응에서 항원 특이적 세포 상호작용을 2광자 영상으로 관찰하는 기술을 익히세요.

골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

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