골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

골수에서 수지상 세포를 준비하면 면역 체계의 두 가지 botton 이미징에서 시험관 내 또는 생체 내 실험에 사용할 수 있는 항원 제시 세포의 우수한 공급원을 제공합니다. 항원 제시 세포의 도입은 살아있는 림프절의 맥락에서 항원 특이적 세포 세포 상호 작용을 연구할 수 있도록 합니다. 여기에서 우리는 골수의 무균 분리와 성숙한 수지상 세포 생산을 위한 배양 기술을 보여줍니다.

또한, 우리는 1일차부터 11일차까지 수지상 세포의 발달을 추적합니다. 이 개발은 향기 기술 incus 사이트를 사용하여 만든 스틸 이미지와 인큐베이터 비디오로 묘사됩니다. 마지막으로, 미러링 림프절에 있는 두 개의 T 세포에 코브 항원을 제공하는 골수 유래 수지상 세포를 보여줍니다.

안녕하세요, 저는 근처 캘리포니아 대학의 미카 헤일런 연구실에 있는 멜라니 매튜입니다. 세포가 자라는 동안 프로버 동안 내부에서 무슨 일이 일어나고 있는지 궁금해 한 적이 있습니까? 오늘?

프로토콜의 일환으로 사이트에서 일부 악기를 S로 사용하는 방법을 보여드리겠습니다. 잉크 사이트를 통해 인큐베이터에서 세포 배양 성장을 추적할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 마우스에서 골수 유래 및 그룹 세포를 분리하고 준비하는 방법을 보여줍니다.

가장 먼저 대퇴골을 제거하고 골수를 분리하는 방법을 보여드리겠습니다. 먼저 동물을 핀으로 고정합니다. 다음으로, 70 % 에탄올로 동물을 적십니다. 동물의 정중선을 따라 첫 번째 절개를 합니다.

그런 다음 여기 보여드리는 것처럼 다리 안쪽을 자릅니다. 대퇴골 위의 근육 조직을 노출시키려면 근육을 옆으로 당겨 박리 핀셋으로 큰 대퇴골을 잡을 수 있어야 합니다. 박리 핀셋으로 뼈를 잡고 있는 동안 뼈를 아래로 이동하여 관절 바로 아래를 첫 번째 절단합니다.

그런 다음 가위를 대퇴골 길이만큼 위로 올려 가능한 한 몸에 가깝게 자르십시오. 이로 인해 약간의 피가 나올 수 있으며, 특히 대퇴 동맥을 절단한 경우 더욱 그렇습니다. 대퇴골을 제거할 때 뼈를 그대로 유지하는 것이 매우 중요합니다.

여기에서 볼 수 있듯이 뼈 끝은 절단되거나 파괴되지 않았습니다. 대퇴골을 제거한 후 추가 조직을 잘라내고 대퇴골을 PMI 배지의 작은 접시에 넣습니다. 추가 조직을 제거할 때 대퇴골이 건조해지지 않도록 합니다.

이 시점에서 대퇴골을 70% 에탄올이 함유된 접시에 옮겨 넣고 5-10분 동안 얼음 위에 올려 놓아야 합니다. 이 비디오의 목적을 위해 실험실 벤치에서 계속 진행하겠습니다. 그러나 실험의 이 단계에서는 모든 것을 조직 배양 후드로 옮겨야 합니다.

뼈를 에탄올에 담그면 골수 제거를 위해 멸균 매체가 담긴 더 큰 접시에 뼈를 옮길 수 있습니다. 이제 골수를 제거하고 다시 부유시킬 준비가 되었습니다. 인슐린 주사기에 멸균 매체를 채우고 나중에 사용할 수 있도록 옆에 놓습니다.

멸균 핀셋으로 뼈를 잡으십시오. 버려진 조각을 위해 작은 접시 위에 놓고 골단이나 뼈의 끝을 양쪽에서 잘라냅니다. 인슐린 주사기를 뼈의 한쪽에 놓고 뼈에서 골수를 15mil의 배지로 씻어냅니다.

골수가 모두 씻겨 나올 때까지 뼈를 한두 번 더 씻어냅니다. 골수가 뼈에서 씻겨 나오면 거의 완전히 하얗게 됩니다. 깨끗한 뼈를 버리는 접시에 넣고 다른 대퇴골의 과정을 반복합니다.

이 작업이 완료되면 세척 과정에서 분해되지 않은 골수 조각을 부드럽게 파괴하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 피펫팅은 5분에서 10분 정도 소요됩니다. 단일 세포 현탁액을 50mil 원뿔형 튜브에 놓고 10mil의 매체로 플레이트를 최소 3회 세척합니다.

매번 세포를 회전시키고 배지를 제거한 다음 손가락으로 튜브 바닥을 단단하고 활기차게 문질러 세포를 다시 현탁시킵니다. 적혈구 또는 적혈구를 제거하기 위해 물 용해를 수행합니다. 적혈구를 제거하는 또 다른 방법은 염화암모늄 용해입니다.

두 방법 모두 이전 JoVE 비디오 기사에서 설명했습니다. Milan max purification JoVE issue nine을 사용하여 마우스 림프절에서 CD 4개의 양성 T 세포 분리 및 쥐 세포 JoVE에서 T 세포 성장 인자 준비. 문제 10.

적혈구를 제거한 후에는 이제 배양할 준비가 된 것입니다. 덴드리 세포 배양에 대해 설명하기 전에 incus 사이트를 소개하고자 합니다. 인쿠스 사이트를 사용하면 인큐베이터 내에서 세포 배양 성장을 빼고 예측할 수 있으므로 그들이 어떻게 행동하거나 잘못 행동하는지 직접 관찰할 수 있습니다.

배양이 설정되면 적절한 크기의 트레이에 넣고 인커스 사이트를 밀어 닫습니다. 그런 다음 컴퓨터에서 시간 간격을 설정 한 다음 이미지를 원하는 우물을 선택하고 잉크 사이트가 데이터를 수집하도록합니다. 동영상은 이 프로토콜에서 보여주고 체외에서 수지상 세포 형태 변화를 보여줍니다.

이 비디오는 Incus 사이트 프로그램에서 직접 내보냈습니다. 수지상 세포가 1일차부터 11일차까지 발달함에 따라 수지상 세포가 커지고 수지상 세포 표현형을 취함에 따라 진정한 형태 변화를 볼 수 있습니다. 적혈구를 용해시키고 제거한 후, 세포를 1차 수지상 세포 배지에서 세척하고 밀당 500만 개로 도금합니다.

이러한 세포는 처음에는 1차 수지상 세포 배양 배지에서 배양해야 하며, 나중에는 mil IL 4당 40나노그램 및 mil TNF 알파당 100나노그램이 보충된 2차 DC 배지에서 배양해야 합니다. 이러한 사이토카인은 단핵구 유래 수지상 세포와 유사한 성숙한 수지상 세포의 발달을 돕습니다. 이제 문화가 발전함에 따라 어떤 모습인지, 그리고 시간이 지남에 따라 어떻게 유지하는지 보여드리겠습니다.

세포를 도금한 후에는 첫 번째 배지가 변경되기 전에 72시간 동안 수지상 세포를 배양할 수 있습니다. 다음은 첫날에 세포를 플레이트팅한 직후의 일반적인 배양이 어떻게 보이는지입니다. 여기 세포를 살펴 보겠습니다.

3일차에는 세포가 플레이트에 부착되기 시작했지만 고전적인 수지상 세포 표현형을 취하지 않은 것을 볼 수 있습니다. 4일차에는 미디어를 제거하고 미디어의 새로운 기본 DC 미디어 흡인 10mil을 추가합니다. 4일차에는 다른 비부착 세포에서 림프구를 제거합니다.

이제 초기 도금 후 7일, 3일 동안 인큐베이터에 다시 넣을 수 있습니다. 여러분의 일반적인 문화는 다음과 같습니다. 셀을 분할하고 다시 만들 때임을 알 수 있습니다.

7일째에 배지를 흡인한 다음 300밀리몰의 멸균 EDTA를 첨가하고 이를 5분 동안 배양하여 플레이트에서 수지상 세포를 제거합니다. 그런 다음 플레이트를 45도 각도로 유지하고 EDTA 용액을 플레이트 뒷면에 피펫팅하여 반복적으로 헹굽니다. 이 작업은 부착 수지상 세포를 모두 제거하기 위해 몇 분 동안 수행됩니다.

세포는 50 밀리 원뿔형 튜브에 모이고 2차 DC 배지로 두 번 세척합니다. 그런 다음 세포를 재현탁시키고 플레이트당 500만 개의 세포로 도금합니다. 갓 다시 도금한 7일차 수지상 세포는 접시 바닥에 빠르게 정착하고 부착되어 퍼지기 시작합니다.

여기 Zichy 사이트 비디오에서 볼 수 있듯이, 이 비디오는 7일째에 수행된 초기 도금부터 9일째 되는 날까지 수지상 세포 발달을 보여주기 위해 이틀에 걸쳐 인큐베이터에서 촬영되었습니다. 형태학: 수지상 세포는 난자 특이적 CD 4개의 양성 T 세포를 가진 OT 2마리의 마우스에서 정제된 T 세포와 함께 사용하기 위해 LLPS당 200마이크로그램의 난자를 여기에 첨가하여 항원 펄스에서 활성화할 수 있습니다. 다른 항원을 사용하는 경우 여기에서 dc를 펄스하기 위해 최적의 항원 농도를 사용하는 것이 중요하며, OV 및 LPS는 LPS의 최종 농도가 20mils에서 mil당 2마이크로그램이 되고 OVA는 20mils에서 mil당 100마이크로그램이 됩니다.

다음은 수지상 세포의 일반적인 day 10 배양이 어떻게 생겼는지에 대한 사진입니다. 이 사진에서 볼 수 있듯이 형태는 항원 제시 세포의 매우 전형적인 형태입니다. 항상 팩스로 CD 11 C 양성 수지상 세포의 백분율을 확인해야 합니다.

이는 실험에 사용하기 위해 비교적 순수한 수지상 세포 배양을 보장하기 위한 것입니다. 여기서 우리는 SEN 기기의 잉크 부위를 사용하여 10일째에 펄스된 항원에서 LPS 처리된 수지상 세포의 활성화를 모니터링합니다. 이 비디오는 LPS와 val 및 펩타이드가 첨가된 직후 24시간 동안 진행되며, 그 안에서 수지상 세포가 더 활성화되고 몇 가지 명백한 형태학적 변화가 있습니다.

수지상 세포가 항원 펄스에서 활성화되면 300 밀리몰 EDTA로 배양하고 플레이트를 세척하여 다시 수집할 수 있습니다. 이제 세포를 스핀다운하고 50mil의 RPMI 배지로 두 번 세척하여 추가 항원을 제거한 다음 적절한 세포 추적기 염료로 라벨을 부착합니다. 이 실험에서는 서혜부 림프절의 세포를 이미징할 것입니다.

2-500만 개의 수지상 세포를 피부에 주입하여 여기에 표시된 마우스의 옆구리 부위에 주입해야 합니다. 그런 다음 수지상 세포가 훈련 림프절로 돌아갈 때까지 24시간을 허용합니다. 이 비디오에서 수지상 세포는 파란색 세포 추적기 염료인 CMF two hc로 표지되어 있습니다.

수지상 세포가 볼린에 특이적인 항원인 표지된 T 세포와 상호 작용하는 것을 볼 수 있습니다. 이러한 T 세포는 ccf SE로 표지됩니다. 분자 프로브에 C-M-T-M-R 또는 다른 세포 추적 염료 중 하나를 사용할 수도 있습니다. 이것은 dcs와 상호 작용하는 T 세포의 초기 활성화 단계입니다.

항원 특이적이기 때문에 T 세포가 파란색으로 표시된 dcs의 덩굴손에만 달라붙는 것을 볼 수 있습니다. 이것으로 Two Botton 이미징 실험에서 마우스 유래 골수 수지상 세포의 준비 및 사용을 입증하는 프로토콜을 마칩니다. 시청해 주셔서 감사드리며 자신의 실험에 행운을 빕니다.