골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

골수로부터 수지상 세포를 준비하는 것은 면역 체계의 2광자 이미징을 이용한 in vitro 또는 in vivo 실험에 사용할 수 있는 항원 제시 세포의 훌륭한 공급원을 제공합니다. 항원 제시 세포를 도입함으로써 살아있는 림프절 환경 내에서 항원 특이적 세포 간 상호작용을 연구할 수 있습니다. 본 영상에서는 골수의 무균 분리 방법과 성숙한 수지상 세포 생산을 위한 배양 기술을 설명합니다.

또한, 1일부터 11일까지 수지상 세포의 발달 과정을 추적합니다. 이러한 발달 과정은 정지 영상과 scent technologies incus site를 사용하여 제작한 인큐베이터 영상으로 묘사됩니다. 마지막으로, 골수 유래 수지상 세포가 배수 림프절에서 OT two T 세포에 cove 항원을 제시하는 모습을 보여줍니다.

안녕하세요, 저는 인근 캘리포니아 대학교의 Micah Halen 연구실에 있는 Melanie Matthew입니다. 세포가 성장하는 동안 내부에서 어떤 일이 일어나는지 궁금해하신 적이 있나요? 오늘은 그것에 대해 알아보겠습니다.

본 프로토콜의 일부로, 현장의 일부 기기 사용 방법을 설명하겠습니다. Inky 사이트를 통해 인큐베이터 내 세포 배양 성장을 추적할 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 준비하는 방법을 보여드리겠습니다.

가장 먼저 대퇴골을 제거하고 골수를 분리하는 방법을 보여드리겠습니다. 우선 동물을 고정합니다. 다음으로 동물에게 70% ethanol을 적셔 줍니다. 동물의 중앙선을 따라 첫 번째 절개를 실시합니다.

그런 다음 여기 보여드리는 것처럼 다리 안쪽을 절개하십시오. 대퇴골 위의 근육 조직을 노출시키려면, 근육을 옆으로 밀어내고 해부용 핀셋으로 커다란 대퇴골을 잡을 수 있어야 합니다. 해부용 핀셋으로 뼈를 잡은 상태에서 뼈를 따라 아래로 이동하여 관절 바로 아래 지점에서 첫 번째 절개를 수행하십시오.

그런 다음 가위를 대퇴골의 길이를 따라 위로 움직여 몸체에 최대한 가깝게 절단합니다. 특히 대퇴동맥을 절단할 경우 소량의 출혈이 발생할 수 있습니다. 대퇴골을 제거할 때 뼈가 손상되지 않고 온전하게 유지되는 것이 매우 중요합니다.

여기서 보시는 바와 같이 뼈의 끝부분이 절단되거나 손상되지 않았습니다. 대퇴골을 제거한 후, 추가 조직을 잘라내고 대퇴골을 PMI 배지가 담긴 작은 접시에 넣으십시오. 추가 조직을 제거할 때 대퇴골이 마르지 않도록 주의하십시오.

이 단계에서 대퇴골을 70% ethanol이 담긴 접시에 옮겨 얼음 위에 5~10분 동안 둡니다. 본 영상에서는 실험대 위에서 계속 진행하지만, 실제 실험의 이 단계부터는 모든 과정을 조직 배양 후드 내부에서 수행해야 합니다.

뼈를 에탄올에 담근 후, 골수를 제거하기 위해 멸균 배지가 담긴 더 큰 접시로 옮깁니다. 이제 골수를 제거하고 재현탁할 준비가 되었습니다. 인슐린 주사기에 멸균 배지를 채워 나중에 사용할 수 있도록 옆에 둡니다.

멸균 핀셋으로 뼈를 잡습니다. 폐기물을 담을 작은 플레이트 위에 뼈를 두고 양쪽의 골단 또는 뼈 끝부분을 잘라냅니다. 인슐린 주사기를 뼈의 한쪽 끝에 삽입하고 골수를 밀어내어 15 mils의 배지로 옮깁니다.

골수 성분이 모두 씻겨 나갈 때까지 뼈를 한두 번 더 세척합니다. 골수가 모두 제거되면 뼈는 거의 완전히 하얀색이 됩니다. 깨끗해진 뼈를 폐기 접시에 넣고 반대편 대퇴골에 대해서도 동일한 과정을 반복합니다.

이 과정이 완료되면, 세척 과정에서 분리되지 않은 골수 조각들을 조심스럽게 파쇄하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 이 피펫팅 작업에는 5~10분이 소요됩니다. 단일 세포 현탁액을 50 mL 코니컬 튜브에 넣고, 10 mL의 배지로 플레이트를 최소 3회 세척합니다.

매회 세포를 원심 분리하여 가라앉힌 후, 배지를 제거하고 튜브 바닥을 손가락으로 강하고 빠르게 문질러 세포를 다시 현탁합니다. 적혈구(RBC)를 제거하기 위해 수성 용해(water lysis)를 수행합니다. 적혈구를 제거하는 또 다른 방법으로는 염화암모늄 용해(ammonium chloride lysis)가 있습니다.

두 방법 모두 이전 JoVE 비디오 논문에서 설명되었습니다. Miltenyi Biotec 정제법을 이용한 생쥐 림프절에서의 CD4 양성 T-세포 분리(JoVE 제9호) 및 쥐 사이토카인으로부터의 T-세포 성장 인자 준비(JoVE 제10호)가 그것입니다.

적혈구를 제거한 후, 이제 세포 배양을 시작할 준비가 되었습니다. 따라서 수지상 세포 배양 과정을 안내하기 전에, 인큐베이터 내부의 모습을 보여드리겠습니다. 인큐베이터 내부에서는 수지상 세포의 배양 성장을 관찰할 수 있어, 세포가 어떻게 반응하거나 변화하는지 확인할 수 있습니다.

배양이 설정되면, 이를 적절한 크기의 트레이에 넣고 인큐사이트(IncuCyte) 사이트를 닫습니다. 그다음 컴퓨터에서 시간 간격을 설정하고 이미지를 획득할 웰을 선택하면, 인큐사이트가 자동으로 데이터를 수집합니다. 본 프로토콜의 영상에서는 인비트로(in vitro) 환경에서의 수지상 세포 형태 변화를 보여줍니다.

이 영상들은 Incus 사이트 프로그램에서 직접 내보낸 것입니다. 수지상 세포가 1일 차부터 11일 차까지 분화됨에 따라, 세포가 커지고 수지상 세포의 표현형을 갖추면서 나타나는 실제적인 형태 변화를 확인할 수 있습니다. 적혈구를 용해하여 제거한 후, 세포를 일차 수지상 세포 배지로 세척하고 밀리리터당 5 million 개씩 도말합니다.

이 세포들은 처음에 일차 수지상 세포 배양 배지에서 배양해야 하며, 이후에는 40 ng/mL의 IL-4와 100 ng/mL의 TNF-α가 첨가된 이차 DC 배지에서 배양합니다. 이러한 사이토카인들은 단핵구 유래 수지상 세포와 유사한 성숙한 수지상 세포의 발달을 돕습니다. 이제 배양 세포가 발달함에 따라 어떤 모습인지와 시간이 지남에 따라 어떻게 유지하는지 보여드리겠습니다.

세포를 플레이팅한 후, 첫 번째 배지 교체 전까지 수지상 세포를 72시간 동안 배양할 수 있습니다. 다음은 1일 차에 세포를 플레이팅한 직후의 전형적인 배양 모습입니다. 그리고 여기 세포의 모습이 있습니다.

3일 차에는 세포가 플레이트에 부착되기 시작했으나, 전형적인 수지상 세포 표현형은 아직 나타나지 않은 것을 확인할 수 있습니다. 4일 차에 배지를 제거하고 10 mL의 신선한 primary DC 배지를 첨가하여 배지를 흡입합니다. 4일 차에 림프구 및 기타 비부착 세포들을 제거하겠습니다.

이제 세포를 다시 인큐베이터에 넣고, 초기 플레이팅 후 7일째 되는 날까지 3일 더 배양합니다. 일반적인 배양 상태는 다음과 같습니다. 이 상태가 되면 세포를 분할하여 계대 배양할 시점임을 알 수 있습니다.

7일째에, 배지를 흡입하여 제거한 후 300 millimolar 멸균 EDTA를 첨가하고 5분 동안 배양하여 플레이트에서 수지상 세포를 분리합니다. 그런 다음 플레이트를 45도 각도로 기울인 상태에서 플레이트 뒷면에 EDTA 용액을 피펫팅하여 반복적으로 헹굽니다. 모든 부착 수지상 세포가 제거되도록 이 과정을 수분 동안 수행합니다.

세포를 50 mL 원추형 튜브에 수집하고 secondary DC 배지로 2회 세척합니다. 그 후 세포를 재부유하여 플레이트당 5백만 개의 세포가 되도록 분주합니다. 새로 분주한 7일 차 수지상 세포는 빠르게 플레이트 바닥에 가라앉아 부착되며 퍼지기 시작합니다.

Zichy 사이트의 비디오에서 볼 수 있듯이, 이 비디오는 7일 차에 수행한 초기 재배양부터 9일 차 초반까지의 수지상 세포 발달 과정을 보여주기 위해 인큐베이터 내에서 이틀 동안 촬영되었습니다. 수지상 세포의 형태는 항원 펄스를 통해 활성화될 수 있으며, 여기서는 2 µg/mL의 LPS와 함께 OT-2 마우스(ova 특이적 CD4 양성 T 세포를 보유함)에서 정제한 T 세포와 사용하기 위해 100 µg/mL의 ova를 추가합니다. 다른 항원을 사용하는 경우, DC를 펄스하기 위해 최적의 항원 농도를 사용하는 것이 중요합니다. 여기서 OVA와 LPS는 최종 LPS 농도가 20 mL에서 2 µg/mL가 되고, OVA 농도가 20 mL에서 100 µg/mL가 되도록 기본 배지에 추가합니다.

배양 10일째의 전형적인 수지상 세포 모습이 담긴 사진입니다. 이 사진을 통해 형태학적으로 항원 제시 세포의 전형적인 특징을 가지고 있음을 확인할 수 있습니다. 항상 FACS를 통해 CD 11 C 양성 수지상 세포의 비율을 확인해야 합니다.

이는 실험에 사용할 수 있는 상대적으로 순수한 수지상 세포 배양물을 확보하기 위한 것입니다. 여기서는 SEN instruments의 inky site를 사용하여 10일 차에 LPS 처리 및 항원 펄싱을 거친 수지상 세포의 활성화를 모니터링합니다. 이 영상은 LPS와 밸 및 펩타이드 첨가 직후부터 24시간 동안의 기간을 다루며, 이 과정에서 수지상 세포가 더욱 활성화되고 뚜렷한 형태학적 변화가 나타납니다.

항원 펄스(antigen pulse)를 통해 수지상 세포가 활성화되면, 300 millimolar EDTA와 함께 배양하고 플레이트를 세척하여 세포를 다시 수집할 수 있습니다. 이제 세포를 원심 분리한 다음, RPMI 배지 50 µL로 두 번 세척하여 잔류 항원을 제거하고 적절한 세포 추적 염료(cell tracker dye)로 표지하십시오. 본 실험에서는 서혜 림프절(inguinal lymph node) 내의 세포를 이미징하겠습니다.

여기에 표시된 마우스의 옆구리 부위 진피에 200만에서 500만 개의 수지상 세포를 주입해야 합니다. 그 후 수지상 세포가 훈련 림프절로 이동할 수 있도록 24시간 동안 기다립니다. 본 영상에서 수지상 세포는 청색 세포 추적 염료인 CMF two hc로 라벨링되었습니다.

volin에 대해 항원 특이적인 표지된 T 세포와 상호작용하는 수지상 세포를 관찰할 수 있습니다. 이 T 세포들은 ccf SE로 표지되었습니다. 분자 프로브로는 C-M-T-M-R 또는 다른 세포 추적 염료를 사용할 수도 있습니다. 이는 수지상 세포와 상호작용하는 T 세포의 초기 활성화 단계입니다.

항원 특이적이기 때문에, T-세포가 청색으로 라벨링된 수지상세포(dcs)의 돌기에 부착되어 있는 것을 확인할 수 있습니다. 이것으로 이광자 이미징 실험에서 마우스 유래 골수 수지상세포의 준비 및 사용법을 보여주는 프로토콜을 마치겠습니다. 시청해주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.