Name: MEFs에서 Matrigel 3 : Matrigel에 Matrigel에서 Passaging hESCs (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-10T15:33:00.000+00:00
Duration: 3 min 50 s
Description: 배우세요 Matrigel에서 배양한 인간 배아줄기세포(hESCs)의 무사육 세포 조건 유지 및 전달 방법을. 면역형광 현미경으로 다능성을 확인하는 이 기술은 줄기세포 연구에 필수적입니다.

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Teitell 연구실에서 인간 배아 줄기 세포 연구는 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM) 씨앗 부여 RS1 - 00313에 의해 지원됩니다. 우리는 UCLA, 특히 박사 Amander 클라크 박사 제롬 잭, 우리의 연구들의 지원 UCLA 브로드 연구소 줄기 세포 핵심 시설의 멤버에 재생 의료 및 줄기 세포 연구의 브로드 센터의 회원을 감사드립니다.

Matrigel에서 Matrigel을 분리 hESCs 보통 Matrigel에 hESCs의 합류 6 잘 판은 우물이 4-5일 분리 후 다시 합류되기와 다른 Matrigel 판에 1시 5분에서 1시 3분까지 분할 수 있습니다. <ol><li> 분할하기 전에 위에서 설명한 CM과 Matrigel 플레이트는 준비가되어 있습니다. </li><li> 분할 당일, × 1 분리를위한 PBS, pH7.4를 각각 잘 씻어 각각 잘하는 1mg/ml Dispase (DMEM/F12 매체와 희석 5mg/ml 재고 솔루션)의 1ml을 추가하고, 37 품어 ° C 3 분. </li><li> 1 각 잘 세 번 씻어 × PBS, pH7.4은, bFGF없이 ES 미디어 1ml를 추가 우물의 바닥에서 식민지를 긁어 세포 스크레이퍼를 사용하여 50ml 팔콘 튜브의 정지 hESCs를 수집하고, 원심 분리에 의해 펠릿 200g에 상온에서 5 분. </li><li> 다시 타석으로 Matrigel 플레이트에 hESCs 먼저 DMEM/F12과 Matrigel 접시를 씻어 잘 당 10ng/ml bFGF와 보충 CM의 2.5ml를 추가합니다. 10ng/ml bFGF, 피펫 세포 현탁액 위, 아래로 세 번 함께 보충 CM의 적절한 볼륨에 hESC 펠렛을 Resuspend. (참고 : 분리를위한 hESCs가 Matrigel 접시에서 온 때, 대단히 짧은 휴식을 매우 쉽게 않으므로 pipetting 3 번을 충분하고 더 식민지를 오버 방해와 단일 세포를 만들 수 있습니다 pipetting.) 나누어지는은 당 hESC의 대단히 짧은 시간 서스펜션 0.5 ML 잘 6 잘 Matrigel 판의 최종 볼륨으로 당 3ml 잘 달성하기 위해. 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다. </li></ol> immunofluorescence 현미경에 의해 pluripotency 마커 감지 Immunofluorescence 현미경은 culturing 동안 hESC pluripotency 마커 월 4 SSEA - 4의 표현을 확인하는 데 사용됩니다. <ol><li> 잘 하나에서 미디어를 기음과 1 × PBS 세척, 산도 7.4. 10 분에 대한 수정을 잘하기 위해 3.7 %의 포름 알데히드 2ml를 추가합니다. </li><li> 두 분 -20에서 잘과 장소 ° C에 2ml 메탄올을 추가 1xPBS, pH를 7.4로 씻어. </li><li> 5 분 알부민 0.2 % 소 serume (BSA)의 1ml와 1xPBS, 산도 7.4, 그리고 블록 린스. </li><li> 월 4 anti-h/mSSEA-4 항체 (0.2 % BSA에 1:200 희석)의 1ml을 추가하고, 1 시간 또는 4 ° C에서 하룻밤 실온에서 알을 품다. (참고 : SSEA - 4 염색법을위한 6 단계로 바로 진행합니다) </li><li> , 1xPBS, pH를 7.4로 세 번 씻어 FITC - 복합 토끼 IgG (0.2 % BSA에 1:500 희석), 그리고 1 시간에 대한 실온에서 부화를 추가합니다. </li><li> 1xPBS, 산도 7.4 3 번 씻어하고 잘의 중심에 (핵 시각화가 원하는 경우 DAPI를 포함할 수 있습니다) 장착 솔루션의 한 방울을 넣어. 매니큐어와 인감, 세포의 상단에 coverslip을 넣어, 그리고 immunofluorescence 현미경에 의해 평가합니다. </li></ol> 인간 배아 줄기 세포 영수증 ES 미디어 (배아의 줄기 세포 미디어) : DMEM/F12 - 400ml 마네 세럼 Replacer - 100ml 비 - 필수 아미노산 - 5ml 200mM GlutaMax / BME 솔루션 - 5ml 페니실린 / 스트렙토 마이신 - 5ml 4 잘 섞어 500ml 병의 최종 hESC 문화 미디어를 저장 ° C. 2 주간 최대 좋아. MEF 문화 미디어 : DMEM - 1000ml FBS - 100ml 비 - 필수 아미노산 - 10ml 글루타민 - 10ml Penicllin / 스트렙토 마이신 - 10ml 잘 믹스 4에서 최종 MEF 문화 미디어를 저장 ° C. 200mM Glutamax / BME 솔루션 : Glutamax - 100ml β - 메르 캅 토 에탄올 (14.3M에 증권 솔루션) - 140 μ1 이 잘 그리고 솔루션 나누어지는의 10ml의 일부를 섞는다. -20 ° C.에 aliquots 유지 bFGF 솔루션 (재고의 최종 농도 : 10 마이크로 그램 / ML) : bFGF (FGF2) - 50 μg 1xPBS에 0.​​1 % BSA, 산도 7.4 - 5ml 10 μg / ML 주식을하기 위해 5ml 0.1 % BSA에 bFGF 50 마이크로 그램을 디졸브. 500 μl 부분으로 나누어지는. -80에서 보관 ° C. Collagenase IV 솔루션 (1mg/ml) : Collagenase IV - 50mg DMEM/F12 미디어 - 50ml 50ml 팰컨 튜브에 collagenase IV 가루를 추가합니다. 후드에서 무균 DMEM/F12 미디어 50ml에 섞는다. &lt;1 분 소용돌이 솔루션입니다. 가루가 해산되어 있는지 확인합니다. 후드에서 새 살균 50ml 팔콘 튜브에 필터 0.22 μm의 통과. 이 솔루션은 4 저장된 이주의 최대 ° C.에 좋습니다 Dispase 솔루션 (1mg/ml) : Dispase 5mg/ml - 2ml DMEM/F12 미디어 - 8ml -20 ° C.에서 나누어지는 상업 5mg/ml의 Dispase 솔루션과 저장 DMEM/F12를 사용 1mg/ml로 dispase을 희석. 이 솔루션은 4에서 1 주일 동안 보관 가능 ° C.

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts+%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+Nature+Biotechnology+19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)"> Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

3 동영상이 시리즈는 (MEF) 피더 세포 (비디오 1) 어떻게 통로를 피더 셀 - 무료 접시 (비디오 2) Matrigel을하고, 방법을 유지하기 위해 마우스 배아 fibroblast에서 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다 Matrigel 피더 셀 무료 조건 (동영상 3) passaging하여 hESCs. 많은 이전의 연구는 실용적, undifferentiated hESCs의 유지 보수가 inactivated MEF 피더 세포에 대한 문화를 필요로했다. 그러나 대부분의 실험, 피더 세포 오염의 무료 hESCs의 순수한 인구가 필요합니다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 우리는 어떻게 통과 hESCs에 MEF 피더 플레이트에서 피더 셀 - 무료 Matrigel 플레이트 및 유지하고 피더에서 연속 통과 hESC 식민지 세포가없는 조건을 증명하고있다. 이 프로토콜에 따라, MEF 피더 셀 오염의 작은 금액은 아직 Matrigel의 접시에 통로 하나가 존재할 수 있지만,이 오염 물질은 일반적으로 시각화하기 쉽습니다. 이상 Matrigel 통로...

<table><tbody><tr><td>Knockout Serum Replacer (KSR)</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산(Non-essential Amino Acids)</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>시약</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>시약</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>시약</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>시약</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>시약</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 항체</td><td>시약</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>anti-h/mSSEA-4 Phyc&amp;#8211;rythrin 접합 Mouse IgG3</td><td>시약</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>FITCI-접합 항토끼 IgG</td><td>시약</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

mefs에서 matrigel 3 : matrigel에 matrigel에서 passaging hescs

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

이 동영상은 피더 세포가없는 조건에서 어떻게 피더에서 연속 통과 hESCs 세포가없는 조건에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 성장을 유지하는 방법을 보여줍니다. hESC의 확인은 pluripotency immunofluorescence 현미경으로 피더 셀없는 조건을 재배도 증명됩니다.

이 동영상은 피더 세포가없는 조건에서 어떻게 피더에서 연속 통과 hESCs 세포가없는 조건에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 성장을 유지하는 방법을 보여줍니다. hESC의 확인은 pluripotency immunofluorescence 현미경으로 피더 셀없는 조건을 재배도 증명됩니다. 3 부 3.

MEFs에서 Matrigel 3 : Matrigel에 Matrigel에서 Passaging hESCs

본 영상에서는 피더 세포가 없는 조건에서 인간 배아줄기세포(hESCs)의 성장을 유지하는 방법과 지속적으로 계대 배양하는 방법을 시연합니다...

Matrigel 위에서 배양된 인간 배아줄기세포를 두 개의 Matrigel 플레이트로 분할하는 방법입니다. Matrigel 상에서 세포가 꽉 찬(confluent) 6-well 플레이트의 배아줄기세포로 시작하며, 이를 다른 Matrigel 플레이트로 1:3 또는 1:5 비율로 분할하여 접종할 수 있습니다. 이렇게 하면 분할 접종 후 4~5일이 지나면 웰의 세포가 다시 꽉 차게 됩니다.분할할 각 웰을 1×PBS pH 7.4로 세척합니다. 그 다음, 각 웰에 1 mg/mL 농도의 digested paste 1 mL를 첨가하고 37 °C에서 3분 동안 배양합니다. 각 웰을 1×PBS pH 7.4로 3회 세척합니다.그다음 BF GF가 포함되지 않은 배아줄기세포 배지 1 mL를 첨가하고, 셀 스크레이퍼를 사용하여 웰 바닥에서 콜로니를 긁어냅니다. 재현탁된 배아줄기세포를 15 mL Falcon 튜브에 수집하고, 상온에서 200 ×g로 5분간 원심분리하여 펠렛을 형성합니다. 매트리젤 플레이트에 인간 배아줄기세포를 재부착시키려면, 먼저 매트리젤 플레이트를 D-M-E-M-F 12로 세척한 후 10 ng/mL가 첨가된 meth condition 배지 2.5 mL를 첨가합니다.세포를 원심 분리한 후, 인간 귀 줄기세포 펠렛을 10 ng/mL의 BFGF가 첨가된 적절한 부피의 배지에 현탁하십시오. 세포 현탁액을 피펫으로 세 번 위아래로 섞어줍니다.Matrigel 내의 줄기세포 덩어리는 쉽게 분해된다는 점에 유의하십시오. 따라서 3회 정도 피펫팅하는 것으로 덩어리를 충분히 분해할 수 있으며, 콜로니가 너무 작아지는 것을 방지할 수 있습니다. 마지막으로, 웰당 3 mL를 맞추기 위해 인간 골수 줄기세포 현탁액 0.5 mL를 각 웰에 분주하십시오.최종 부피를 맞춘 후, 세포 덩어리들이 균일하게 분산되었는지 확인하고 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 넣습니다. 특정 amry 줄기세포 라인에 따라, amry 줄기세포는 분할 후 4~5일이 지나면 다시 합쳐져 컨플루언스(confluent) 상태가 됩니다. 콜로니들이 서로 닿기 시작할 때, 배양 중인 인간 amry 줄기세포가 다능성(pluripotency) 또는 줄기세포성(stemness)을 유지하고 있는지 확인하는 것이 중요합니다.배아줄기세포 배양 중 세포의 다능성을 확인하기 위해, 웰 중 하나의 OCT 4 및 SSEA 4 다능성 마커 발현을 면역형광 현미경으로 검사합니다. 6-웰 플레이트를 고정하고 OCT 4와 SSEA 4에 대해 염색합니다. 세포가 이 두 마커 모두에 대해 형광 표지된 것이 확인되면, 인간 배아줄기세포가 다능성을 유지하고 있으며 실험에 사용할 수 있음을 알 수 있습니다.지금까지 배아 줄기세포, 섬유아세포, 피더 세포를 이용한 방식과 metro job의 무혈청 조건 하에서 인간 배아 줄기세포를 배양하고 유지하는 방법을 살펴보았습니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 행운이 있기를 바랍니다.

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연구

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Biology

생물학

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트립신과 Passaging 색채 인간의 배아 줄기 세포 - 라인

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특정 세포로 hESCs의 감독 차별은 재생 의학에 많은 관심을 생성했다. 우리는 결정을위한 간결하고 단계별 절차를...

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이 문서는 인간의 배아 줄기 세포 집단에서 인간 간장 endoderm의 생성에 초점을 맞출 것이다.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

마우스 배아의 섬유아 세포 (MEFs)의 품질 등 CF-1과 같은 마우스의 오른쪽 변형에 의해 결정됩니다. 이들로부터 얻은 Pluripotency - 지원 MEFs 및 에어컨 매체 (CM) 공동 operatively 자기 갱신과 pluripotency를 유지에 Activin / 결절 및 FGF 경로에 필요한 Activin, 괴물과 Tgfβ1의 최적 농도를 포함해야합니다.

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

전환 문화에 피더 - 무료 조건에 지속적인 노력에도 불구하고, 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 유도와 문화 마우스 배아 피더 (MEFs)와 공동 문화에 달려 남아 있습니다. 여기, 우리는 신속하게 이전 실험에 hESC 문화에서 피더를 제거 소설 방법을 보여줍니다.

고밀도의 인간 배아 줄기 세포 문화의 급속한 섬유 아세포 제거

여기서, 우리는 인간의 생물학적 기능을 다시 요약 관대 배양 조건 하에서 수축성 근섬유 (myospheres)의 입체 클러스터를 형성하는 골격 근육 원종의 균질 한 집단을 생성 향해 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)의 후생 유전 학적 리 프로그래밍을 기반 프로토콜을 설명 골격 근육.

성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 Myospheres의 생성

우리는 발달 생물학의 지식과 발표된 연구를 바탕으로 인간 배아 줄기 세포와 인간 유도 만능 줄기 세포 모두에서 A9 중뇌 도파민 뉴런을 효율적으로 생성할 수 있는 최적화된 프로토콜을 개발했으며, 이는 파킨슨병에 대한 질병 모델링 및 세포 대체 요법에 유용할 것입니다.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

여기에서는 뼈 형태 생성 단백질 4 및 Activin/Nodal 경로의 억제제를 사용하여 인간 만능 줄기 세포에서 인간 융막 세포를 효율적으로 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 인간 만능 줄기 세포의 효율적인 분화에 적합하며 유전자 조작을 위해 많은 양의 세포를 생성할 수 있습니다.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

인간 배아 줄기 세포(hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)의 효소적 또는 기계적 패시징과 관련된 한계를 피하기 위해 EDTA 매개 탈유착을 사용하여 인간 포피 섬유아세포의 피더 세포층에 유지되는 hESC 또는 hiPSC 콜로니를 수확하기 위한 빠르고 효과적이며 비용 효율적인 고수율 방법을 확립했습니다.

에틸렌디아민테트라아세트산 매개 탈접착에 의한 공급세포에서 인간 만능 줄기세포의 신속하고 비용 효율적이며 효소 없는 패스페이징

배우세요 Matrigel에서 배양한 인간 배아줄기세포(hESCs)의 무사육 세포 조건 유지 및 전달 방법을. 면역형광 현미경으로 다능성을 확인하는 이 기술은 줄기세포 연구에 필수적입니다.

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