August 14th, 2008
여기서 우리는 쥐의 귀에 지연 유형 과민성 (DTH) 반응의 진행 상황을 유도하고 기록하는 방법을 보여줍니다. 이것은 이펙터 / 메모리 T 세포 응답의 2 광자 이미징을위한 쥐의 귀 조직의 준비 시범옵니다.
안녕하세요, 저는 멜라니 매튜입니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스(University of California Irvine)의 생리학 및 생물물리학과에 있는 미카 홀린스(Micah Hollins) 연구실의 대학원생입니다. 오늘은 크리스틴 비튼(Christine Beaton) 박사와 함께 쥐의 귀에서 반응 효과 또는 기억 T 세포 집단을 이미지화하는 방법을 보여드리겠습니다.
Christine Beaton 박사는 먼저 쥐 귀에서 지연형 과민성 DTH를 유도합니다. 그런 다음 두 개의 사진 현미경을 통한 쥐 귀의 현장 이미징으로 넘어갈 것입니다. 이틀 전에 나는 루이스에 하이퍼에서 알부민 특이적 T 세포의 표지된 GFP를 주사했다.
그리고 오늘 저는 같은 귀 쥐에 도전 할 것입니다. 그래서 오른쪽 귀에 알부민을 주사할 것입니다. 그리고 왼쪽 귀에 PBS를 주사할 것입니다.
내가 주사하는 알부민의 용량은 20마이크로리터에 20마이크로그램입니다. 그리고 제가 사용하는 알부민은 텍사스 레드의 알부민과 알부민의 비표시 중 하나가 혼합된 것입니다. 이것이 제가 어떻게 주입할 것인지 보여드릴 오른쪽입니다.
그래서 저는 왼손이고 오른손잡이입니다. 그래서 왼손은 장갑을 벗고 한 손가락은 귀 아래에, 다른 손가락은 위에 올려 피부를 펴서 바늘로 제가 어디에 있는지 정확히 볼 수 있고 매우 얇은 공기 중의 두 피부층 사이로 들어갈 수 있도록 했습니다. 그래서 그것을 위해 저는 27 게이지 바늘을 사용하여 거기에 매우 얇은 것을 넣습니다.
그래서 제가 이걸 뒤집어 보면, 텍사스 레드가 어디로 갔고 PBS가 어디로 갔는지 확실히 볼 수 있습니다. 이제 챌린지 후 42시간이 지났고 저는 스프링이 장착된 마이크로미터를 사용하여 귀 두께를 측정하려고 합니다. 그래서 저는 양쪽 귀를 측정하려고 하는데, 알부민을 투여한 오른쪽 귀와 투여되지 않은 왼쪽 귀를 측정하고 두께의 차이를 통해 염증의 강도를
알 수 있습니다.아, 62 0 60 0 61, 0 60 또는 58 또는 57 또는 57. 그리고 다른 쪽 귀는 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46, 4 50. Hi.So Christine Beaton은 DTH 반응을 측정한 후 제거한 쥐를 방금 주었습니다.
우리는 그들을 얼음에 실어 여기로 운반했습니다. 이것은 쥐의 왼쪽 귀입니다. 우리는 지금 이안 파커(Ian Parker)의 실험실에서 두 개의 광자 현미경을 보고 있습니다.
그래서 저는 이 귀를 in situ two photon imaging을 위해 준비할 것입니다. 그래서 저는 여기 귀 밑에 쥐 귀 중 하나를 준비할 것입니다. 조직이 훨씬 두꺼워지고 머리카락이 튀어나와 있는데 자르기 시작하면 약간 지저분해질 것입니다.
그래서 제가 가장 먼저 할 일은 머리카락 몇 가닥을 자르는 것입니다. 귀를 살짝 잡고 있을 뿐입니다. 내 손가락은 엄지와 검지 사이에 조직을 잡으면 실제로 조직을 제어하는 것이 훨씬 쉬워집니다.
저는 집게를 사용하는 것보다 집게를 사용하는 것을 선호하는데, 집게는 조직이 무엇을 하는지 쉽게 느낄 수 없고 항상 조직이 손상될까 봐 걱정하기 때문입니다. 그래서 우리는 그것으로 무엇을 하고 있는지 느낄 수 있기를 원합니다. 그래서 저는 손가락을 사용하는 것을 좋아합니다.
이것은 쥐 귀에서 여기에서 벗겨지는 진피층입니다. 그래서 머리카락 일부를 다듬으면서 진피 중 일부를 부드럽게 다듬을 수 있었습니다. 그렇게 할 수 있는 아주 작은 해부 가위가 있습니다.
조직을 잽싸게 찔러넣고 싶지않고 귀 바닥에서 위쪽으로 올라가면서 진피층을 부드럽게 잘라낼 수 있습니다. 따라서 이미징을 위해 매우 큰 창이 필요하지 않습니다. 바로 여기 이 영역만으로도 조직에 침투하는 세포의 멋진 이미지를 얻을 수 있습니다.
보시다시피 여기 귀 아랫부분과 귀 끝까지 온전한 혈관이 남아 있습니다. 이 전체 영역은 DTH 이미징에 정말 좋습니다. 그래서 저는 제가 노출시킨 조직 조각을 잘라서 이미징 단계에 붙일 수 있는 작은 조직 조각을 만들 것입니다.
그러니 여기에 컷을 만들고 뒤집으십시오. 여기서 자를 수 있습니다. 우리는 이미징을 위해 두 개의 광자 스코프를 준비할 수 있는 멋진 작은 조직 조각을 가지고 있습니다.
이것은 우리가 조직 크기에 맞게 자르는 깨지지 않는 플라스틱 커버 슬립입니다. 그런 다음 베팅 본드를 사용하여 조직을 여기에 장착합니다. 그런 다음 실리콘 그리스를 사용하여 이 깨지지 않는 플라스틱 커버 슬립을 현장 이미징 스테이지에 고정합니다.
이 작은 공기 티슈 조각을 가져갈 건데, 약간의 곡률이 있어서 접착제로 붙일 때 평평하게 펴야 합니다. 이상적이지는 않지만 작동합니다. 그래서 이 커버 슬립 중 하나를 가져다가 자르고, 귀 크기를 추정하고 생각보다 조금 더 크게 자르
면 됩니다.커버 슬립에 티슈를 장착합니다. 우리는 bet long이라는 티슈 안전 슈퍼 접착제를 사용합니다. 우리는 3M에서 그것을 얻어 커버 슬립에 몇 방울 떨어뜨립니다.
나는 너무 많은 것을 갖고 싶지 않다. 또한 균등하게 분산되어 있는지 확인하고 싶습니다. 그래서 저는 렌즈 종이의 작은 조각을 가져다가 모서리를 사용하여 여기 커버 슬립을 가로질러 접착제를 심하게 만들 것입니다.
여분의 접착제를 약간 올리면이 접착제가 물에 닿 자마자 경화됩니다. 따라서 조직 샘플에 매우 신중해야 합니다. 그래서 저는 여기에서 그것의 조직 모서리를 잡을 것인데, 그것이 구부러진 부분에 있기 때문에 우리가 이미지화하지 않을 것입니다.
조금만 말리겠습니다. 그것의 바닥은 렌즈 종이 위에 있기 때문에 모두 건조됩니다. 그리고 저는 그 모서리를 만질 것입니다, 이 쥐 귀 조직을 커버 슬립에 만질 것입니다.
그리고 그것은 내가 만진 곳에서 즉시 경화되어야합니다. 나머지는 가장자리를 부드럽게 눌러 약간만 평평하게 만들 것입니다. 그래서 우리는 멋진 이미징 프레임을 가질 수 있기를 바랍니다.
이제 제가 할 일은 접착제를 미디어에 담궈 경화시키는 것입니다. 따라서 접착제가 조직 위에 묻는 것을 방지하기 위해 거꾸로 뒤집어 미디어 저장소의 한 구석에 천천히 담그고 잘 붙어 조직 이미징 챔버에서 이미지를 만들 수 있습니다. 이제 현장 이미징을 위해 준비한 조직 조각, 맥주 조직 조각을 무대에 장착할 것입니다.
여기 바닥에 실리콘 그리스가 있는 조직 조각이 있고 우리는 그것을 미디어의 흐름에 부드럽게 놓습니다. 이제 스테이지 바닥에 붙어 있는 것은 실리콘 그리스입니다. 바로 옆에 있는 온도 프로브로 매체의 흐름을 밝게 하십시오.
이제 우리는 집중할 것입니다. 그래서 저는 우리의 초점, 새로운 빛, 밝은 껍질을 켤 것입니다. 그래서 저는 20 x 목표를 가지고 챔버 안으로 내려갈 것입니다.
티슈에 닿지 않도록 한다. 접안렌즈를 통해 보고 귀 조직에 초점을 맞춥니다. 그리고 거기 있습니다.
여기에서 쥐 귀의 진피층에 있는 자가형광 녹색 털 여포를 볼 수 있습니다. 이 모낭을 둘러싸고 있는 것은 콜라겐의 조밀한 층입니다. 이것은 T 펙터 메모리 세포의 T 광자 이미징을 위해 제거하는 층입니다.
자가형광 모낭은 상부 진피층의 밝은 콜라겐과 같이 이미지를 흐리게 합니다. 자, 여기 보시다시피 텍사스 레드 컨활용 볼린을 흡수한 APC가 이 파란색 콜라겐 섬유를 따라 자리 잡고 있습니다. 콜라겐 섬유는 콜라겐 섬유를 따라 광자 이미징으로 들어가는 두 번째 조화 생성으로 인해 파란색입니다.
우리는 운동성이 높은 tcell을 가지고 있습니다. 그들은 콜라겐 섬유를 위아래로 기어 다니며 APC와 상호 작용합니다. 이 비디오에서 크리스틴 비튼(Christine Beaton) 박사가 루이스 쥐에게 DTH를 입양시키는 것을 보셨는데요.
그런 다음 이미징을 위한 귀 준비, 반응성 T 효과기 메모리 셀, 쥐 귀 및 이를 위한 두 가지 광자 기술을 보여드렸습니다.
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이 기사는 쥐 귀에서 지연형 과민증(DTH) 반응을 유도하고 기록하는 방법을 시연하고, 그 후 T 세포 반응의 2광자 영상을 위해 쥐 귀 조직을 준비하는 과정을 설명합니다.
This method enables direct visualization of effector memory T cell dynamics in a tissue-specific immune response, supporting mechanistic de-risking in immunology target validation. By combining adoptive DTH induction with two-photon imaging, it provides quantitative, spatially resolved data on T cell motility and antigen-presenting cell interactions. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking cellular behavior to functional immune outcomes in a disease-relevant system.
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, enabling iterative refinement of immunomodulatory candidates based on real-time immune cell behavior.