Name: 입양 DTH의 유도 후 귀에 영상 효과기 메모리 T 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 배우세요 쥐 귀에서 지연형 과민반응(DTH)을 유도하고 이광자 현미경으로 효과기 및 기억 T 세포를 실시간 영상화하는 방법. 면역 반응의 세포 역학을 생체 내에서 관찰할 수 있습니다.

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입양 DTH의 유도 조브 문서를 참조하십시오 : <a href="/index/Details.stp?ID=325">고양이의 입양 지연 유형 과민성의 유도 및 모니터링</a> 크리스틴 비튼, 조지 K. Chandy 생리학 및 생물 물리학의학과 캘리포니아 대학, 어바인 J. 시각 실험, 제 8 여기, 우리는 phagocytic 항원 제시 세포의 시각화 수 있도록 레이블이 지정되지 않은 항원과 1:1 비율 항원 (Ovalbumin) 텍사스 - 레드에 복합을 사용하여이 프로토콜을 수정했습니다. 이어 조직 하베스트 <ol><li> 귀하의 승인된 동물 프로토콜에 명시된 절차에 의해 원하는 시간 지점에서 쥐를 안락사. 여기, 우리는 isoflurane 마취의 과용을 사용합니다. 이것은 통풍이 잘 후드 안에있는 닫힌 용기에 이루어집니다. 동물의 흉강을 열고 심장을 절단하여 중 잘린에 의해 죽었다는 보장합니다. </li><li> 큰 가위를 사용하면 가능한 한 동물의 몸에 가까운 싱글 컷 (그림 1)과 귀를 제거합니다. <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_0/Figure_1.jpg" alt="Figure_1.jpg"> 그림 1. 쥐 (内耳)의 제거 </li><li> 얼음처럼 차가운 1X PBS 또는 RPMI - 1640의 ~ 10 ML을 포함한 15 ML 원뿔 관에 귀를를 놓습니다. 이 영상에 대한 조직을 준비하는 준비가 될 때까지 얼음 조직 샘플을 보관. </li><li> 최대한 빨리 이미지를 조직, 우리는 수확 즉시 군데 조직에 비해 얼음 1로 2 시간 조직에있는 세포 운동성에 뚜렷한 효과가 없다고하지만, 찾으십시오. </li></ol> 이미징을위한 조직 준비 표피와 피부 레이어의 I. 제거 * 참고 : 깊은 피부 레이어는 그대로 보관해야합니다. 제대로하면 큰 혈관은 그대로 유지되며 귀의 연골이 노출되지 않습니다. 더 염증 (관리 규정)이없는 특히 이것은 어려운 기술이며 그것은 해부 현미경을 사용하여 도움이됩니다. <ol><li> 10cm 조직 문화 요리에있는 원뿔 관의 조직과 언론 모두를 놓습니다. </li><li> 장갑 낀 손 (그림 2) 최대 직면하고있는 귀의 지느러미 측면과 귀 (말초)의 끝에 부드럽게 쥐의 귀를하라. <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_1/Figure_2.jpg" alt="Figure_2.jpg"> 그림 2. 귀에에서 트림 모피 </li><li> 귀 상단, 깊은 진피에서 진피를 분리 폐쇄 더몬트 끝 # 5 가위를 사용하는 동안 지속적인 조직에 엄지손가락으로. 귀 가장자리 피부 / 깊은 진피의 오버행이있다면 또는, 이것은 집게로 파악 할 수 있으며 부드럽게 아래 조직 (그림 3)에서 이것을 분리 뽑아. <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_2/Figure_3.jpg" alt="Figure_3.jpg"> 그림 3. 상단 진피의 제거 </li><li> 일단 피부의 작은 지역 또는 부드럽게 제거하고 피부 dislodged에서 껍질로 피부 레이어와 집게 사이자를 가위를 사용하여 분리 단계를 반복, 기본 조직에서 분리되었습니다. </li><li> 5 × 5 mm 또는 항원 주입의 초기 사이트 (그림 4)에서 최소 3mm는 귀 조직의 큰 영역을 쉽게받을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_3/Figure_4.jpg" alt="Figure_4.jpg"> 그림 4. 이미지에 대한 노출 조직 </li></ol> II. 이미징 스테이지에 조직을 확보 <ol><li> 준비 조직보다 약간 큰 크기로 플라스틱 커버 슬립 컷. </li><li> 3M Vetbond 슬라이드에 걸쳐 ™ 조직 안전한 접착제의 얇은 레이어를 확산. </li><li> 준비된 조직 (이 이미지에 가능성이있는 곳으로 가는게)의 코너를 파악, 미디어에서 제거하고, 소량은 렌즈 종이나 Kym에있는 조직의 아래쪽 초과 미디어를 제거하는 닦으십시오. </li><li> 접착제 커버 슬라이드 (즉시 서부 유럽 표준시 조직에 Vetbond 치료)로 조직의 가장자리를 터치. 부드럽게 (그림 5) 슬라이드를 만진되는 반대 엔드와, 평면 조직을 스트레칭 <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_4/Figure_5.jpg" alt="Figure_5.jpg"> 그림 5. 쪽지를 커버하기 위해 조직을 마운트 </li><li> 로 반전 조직 샘플 / 슬라이드 및 조직 및 슬라이드가 45도 각도로 얼굴 아래로 약하는 등 미디어 저수지에서 수영. Vetbond ™ 치료 각도에 거꾸로 조직을 개최하면 노출된 조직 표면에 경화에서 초과 접착제를 방지하는 데 도움이됩니다. 조직의 표면에 접착제가 레이저 (그림 6)을 차단합니다. <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_5/Figure_6.jpg" alt="Figure_6.jpg"> 그림 6. vetbond 조직 GLU 치료미디어 마른하여 전자 참고 : 단계 2-5은 마스터에 약간의 연습이 걸릴 수 있습니다. 처음 시도하기 전에 삭제 또는 추가 조직 조각과 연습을보십시오. </li><li> 슬라이드의 맨 아래에 실리콘 그리스의 DAB는 작은 금액입니다. </li><li> 재관류 챔버에서 슬라이드를 놓습니다. 재관류 미디어는 37 ° C를 흐르는하고 조직을 추가하기 전에 산소 있는지 확인합니다. 부드럽게 재관류 챔버의 바닥 및 플라스틱 커버 슬립 사이에 실리콘 그리스와 도장을 만들어 슬라이드의 가장자리 아래로 누르십시오. </li></ol> III. 두 광자 이미징 <ol><li> 밝은 - 현장 빛의 전송을 사용하여 조직의 꼭대기에 중점을두고 있습니다. 조명의 모든 전원을 끕니다. </li><li> 레이저를 켜고, 귀하의 다중 광자 현미경 시스템에 필요한 PMTs. </li><li> 높은 주문한 섬유 단백질의 두 번째 고조파 세대 (SHG) (콜라겐과 마이 오신)은 여기 레이저의 절반 파장에서 신호를 생산하고 있습니다. 우리는 현미경의 "푸른"채널을 사용하여 시각 수있는 450 nm의에서 SHG에 이르는, 900 nm의 여기에서를 사용합니다. 세대 SHG 것은 비선형 (2 광자) 과정이며, 따라서 형광의 2 광자 여기의 비슷한 광학 "sectioning"효과를 제공합니다. 병렬로 실행 원섬유이 시각되지 않습니다 반면 SHG의 절정 효율성은 원섬유는 레이저로 수직 때 발생 1. </li><li> 세포 가득한 좋은 이미지 영역을 찾아, 세포의 대부분 중앙에 있으며, 영상을 시작 귀하의 수집 영역을 설정합니다. 참고 : DTH 반응, T 세포와 다른 세포 infiltrates는 종종 다른 분야 세포 2 침투은없는하는 동안 함께 집중해야 볼 수 있습니다. 따라서 이미지에 가장 좋은 지역을 찾으려면 조직을 검색 시간이 좀 걸릴 수 있습니다. </li><li> 이미징 동안 셀 속도와 극성을 평가하여 세포 생존을위한 확인하십시오. 최소한 사진 손상을 보장하기 위해 허용되는 이미지 품질을 제공하는 낮은 레이저 파워를 사용하십시오. </li><li> 필요에 따라 새로운 조직 준비 스왑. </li></ol>

<ol><li>Koo, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+the+voltage-gated+potassium+channel+Kv1.3+inhibits+immune+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo.</a> J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).</li>
<li>Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophil+activation+and+T+lymphocyte+infiltration+in+allergen-induced+late+phase+skin+reactions+and+classical+delayed-type+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity.</a> J Immunol. 147, 816-822 (1991).</li>
<li>Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoaggressive+effector+T+cells+in+the+course+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+visualized+in+the+light+of+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy.</a> J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).</li>
<li>Kawakami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+effector+cell+trafficking+and+autoantigen+recognition+within+the+unfolding+autoimmune+encephalomyelitis+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion.</a> J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Imaging+of+Effector%2FMemory+T+Cells+During+DTH+and+Suppression+by+Kv1.3+Channel+Block%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block.</a> Immunity. , In Press (2008).</li>
</ol>

입양 dth의 유도 후 귀에 영상 효과기 메모리 t 세포

Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH

효과기 / 메모리 T의 lymphocytes - 지연 유형 과민성 (DTH)은 주요 선수들이 CCR7하는 면역 반응이다. 여기, 우리는 쥐의 귀에 DTH 반응의 진행 상황을 유도하고 기록하는 방법을 보여줍니다. 효과기 / 메모리 T 세포 응답 - ​​이것은 CCR7의 2 광자 이미징을위한 쥐의 귀 조직의 준비 시범옵니다. 효과기 / 메모리 T 세포 라인 (비튼, C J. 시각 실험, 이슈 8) - 입양 DTH는 GFP - 레이블 OVA 특정 CCR7의 intraperitoneal 주사로 유도합니다. 전지는 다음 시각화를 허용하도록 텍사스 - 레드에 OVA와 OVA 복합의 1:1 혼합 (OVA - TR)과 호수 (제어 EAR)과 다른 하나의 귀를 주사하여 도전하기 전에 48 시간 동안 쥐의 평형을 사용할 수 있습니다 주민 항원 제시 세포. 우리는 영상 두번째 고조파 생성하여 콜라겐 섬유의 시각화와 함께 면역 반응 동안 피부 깊은 계층 내에서 세포의 운동성 유용 조직 준비 방법을 설명합니다. 귀 조직은 5 X 5mm의 사각형 (약간 큰 더이다)​​로 절단 후 37 이미징 챔버에 실리콘 그리스를 사용하여 보안과 산소 - 부풀어 오른 조직 문화 매체에 의해 superfused 아르 Vetbond ™를 사용하여 플라스틱 커버 미끄러져에 탑재되어 ° C .

여기서 우리는 쥐의 귀에 지연 유형 과민성 (DTH) 반응의 진행 상황을 유도하고 기록하는 방법을 보여줍니다. 이것은 이펙터 / 메모리 T 세포 응답의 2 광자 이미징을위한 쥐의 귀 조직의 준비 시범옵니다.

입양 DTH의 유도 후 귀에 영상 효과기 메모리 T 세포

지연형 과민반응(DTH)은 CCR7- 작동/기억 T 림프구가 주요 역할을 하는 면역 반응입니다. 본 연구에서 우리는 ...를 입증합니다.

안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 어바인(University of California Irvine) 생리학 및 생물물리학과 Micah Hollins 교수님 연구실의 대학원생 Melanie Matthew입니다. 오늘은 Christine Beaton 박사님과 함께 쥐의 귀에서 반응성 작동 세포 또는 기억 T 세포 집단을 영상화하는 방법을 보여드리겠습니다.Christine Beaton 박사가 먼저 쥐의 귀에 지연형 과민반응(DTH)을 유도하겠습니다. 그런 다음 이광자 현미경을 이용한 쥐 귀의 인시튜(in situ) 이미징으로 넘어가겠습니다. 이틀 전, Lewis 쥐의 서혜부에 GFP로 표지된 알부민 특이적 T 세포를 주입했습니다.오늘은 동일한 쥐의 귀에 실험을 진행하겠습니다. 오른쪽 귀에는 알부민을 주입하고, 왼쪽 귀에는 PBS를 주입하겠습니다.제가 주입하는 albumin의 용량은 20 µL에 20 µg입니다. 그리고 사용 중인 albumin은 Texas Red가 표지된 albumin과 표지되지 않은 albumin을 1:1 비율로 혼합한 것입니다. 여기 제가 주입하는 방법을 보여드릴 오른쪽 부위가 있습니다.저는 오른손잡이라서 왼손을 사용합니다. 왼손의 장갑을 벗고, 한 손가락은 귀 아래에, 다른 손가락은 귀 위에 놓아 피부를 팽팽하게 당겼습니다. 이렇게 하면 바늘의 위치를 정확히 확인하여 매우 얇은 공기층인 두 피부층 사이로 진입할 수 있습니다. 이를 위해 매우 얇은 27 gauge 바늘을 사용합니다.뒤집어 보면 Texas red가 어디에 들어갔고 PBS가 어디에 들어갔는지 확실히 알 수 있습니다. 현재는 챌린지 후 42시간이 지난 상태이며, 스프링 로드 마이크로미터를 사용하여 귀의 두께를 측정하겠습니다. 알부민으로 챌린지한 오른쪽 귀와 챌린지하지 않은 왼쪽 귀를 모두 측정할 것이며, 두 귀의 두께 차이를 통해 염증의 강도를 파악할 수 있습니다.오, 62 0 60 0 61, 0 60 또는 58 또는 57 또는 57입니다. 그리고 반대쪽 귀는 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46, 4 50입니다. 안녕하세요. Christine Beaton 씨가 DTH 반응을 측정한 후 제거한 쥐를 방금 저희에게 전달해 주었습니다.저희는 이를 얼음 위에 실어 이곳으로 운반해 왔습니다. 이것은 쥐의 왼쪽 귀입니다. 그리고 저희는 현재 Ian Parker의 연구실에서 이광자 현미경 관찰을 수행하고 있습니다.이제 이 귀 조직들을 i

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

지연 유형 과민성 (DTH)는 CCR7 - 효과기 기억 T의 lymphocytes로 인한 염증 반응이다. 여기 루이스 쥐에 적극적으로 DTH를 유발하고 염증 반응을 모니터링하는 방법을 보여줍니다.

쥐에서 Active 지연 유형 과민성 (DTH)의 유도 및 모니터링

지연 유형 과민성 (DTH)는 CCR7 - 효과기 기억 T (TEM) lymphocytes로 인한 염증 반응이다. 여기서 우리는, 항원 특정 TEM 세포를 활성화 루이스 쥐에서 입양 DTH를 유발하고 염증 반응을 모니터링하는 방법을 보여줍니다.

고양이의 입양 지연 유형 과민성의 유도 및 모니터링

유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 세포로부터 T lymphocytes의 생성은 T 세포 기반 immunotherapy에 대한 배아 줄기 세포를 사용하는 대체 방식을 제공합니다. 방법 중 하나를 이용하여...

T Lymphocytes쪽으로 유도 Pluripotent 줄기 세포의 분화 감독

우리는 잠재적으로 이식 거부의 높은 위험없이 이식 후 면역 억제제의 철수를 결정하는 데 사용할 수있는 유용한 진단 분석을 설명합니다. 분석은 지연 형 과민 반응의 원리를 사용하여받는 사람이 탑재 된 두 기증자 특정 이펙터 및 규제 면역 반응의 정확한 평가를 제공합니다.

항원 특정 규제 트랜스 생체 지연 형 과민 분석

이 비디오는 in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte 또는 CTL 생산을 모니터링하는 면역학적 방법을 보여줍니다. 마우스에는 유전자 조작된 증식성 염료 염색 공여체 CD8+ T 림프구가 사전 주입됩니다. 보조제와 함께 오브알부민을 피하 주사하면 세포독성 CD8+ T 림프구가 생성되며, 이는 면역염색 및 유세포 분석을 통해 수확 후 확인됩니다.

보조 매개 세포독성 T 림프구 생성을 모니터링하기 위한 면역학적 기술

염증 부위에서 이펙터 CD4 T 세포의 삽입 운동을 제어하는​​ 메카니즘은 상대적으로 알려져 있지 않다. 우리는 시각화 현장에서 이러한 세포의 동적 거동의 연구를 허용 염증 귀 진피의 시험 관내 -primed CD4 T 세포에서 조작하는 비 침습적 방법을 제시한다.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

이 보고서는 쥐 눈물샘 추출물, 오발 부민 및 완전 프로 인트 보조제의 유액으로 면역화하여 루이스 쥐의 만성 실험자가 면역안을 유도 한 다음, 눈물 결말과 눈물샘에 눈물샘 추출물과 오발 부민을 주사하는 방법에 대해 설명합니다 6 주 후에.

안구 조직에서 이펙터 기억 T 세포의 증가를 동반 한 만성자가 면역 건식 ​​쥐 모델

여기, 선물이 orthotopic 인간의 기본 뇌 종양을 들고 immunodeficient 마우스에 준비 및 수용자 인간 림프 톨의 stereotaxic 관리에 대 한 프로토콜. 이 연구는 타당성과 세포 immunotherapies intrabrain 전달의 antitumor 효능에 대 한-의 증거-개념을 제공합니다.

정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의

접촉 과민증 (CHS)은 알레르기 성 접촉 피부염 (ACD)의 뮤린 실험 모델입니다. CHS는 가슴과 복부의 면도 된 피부를 페인팅하여 반응성 합텐으로 감작을 기반으로하며, 희석 된 합텐으로 후속 귀 피부 챌린지를 통해 다양한 방법으로 평가되는 붓기 반응을 일으 킵니다.

알레르기 성 접촉 피부염의 뮤린 모델로서의 접촉 과민증

이 연구는 표피(EC) 면역을 통해 생쥐의 면역 반응을 조절하는 피부의 역할을 보여줍니다. 단백질 항원을 사용한 EC 면역은 병원체 관련 분자 패턴과 결합할 때 접촉 과민증 또는 피부 유도 억제에서 면역 반응을 억제할 수 있습니다. EC 면역은 면역 요법에 대한 효과적이고 주사 바늘이 없는 접근 방식으로서 가능성을 보여줍니다.

표피 유도 면역조절의 쥐 모델(Murine Model of Epicutanely-Induced Immunomodulation)

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