입양 DTH의 유도 후 귀에 영상 효과기 메모리 T 세포

안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 어바인(University of California Irvine) 생리학 및 생물물리학과 Micah Hollins 교수님 연구실의 대학원생 Melanie Matthew입니다. 오늘은 Christine Beaton 박사님과 함께 쥐의 귀에서 반응성 작동 세포 또는 기억 T 세포 집단을 영상화하는 방법을 보여드리겠습니다.

Christine Beaton 박사가 먼저 쥐의 귀에 지연형 과민반응(DTH)을 유도하겠습니다. 그런 다음 이광자 현미경을 이용한 쥐 귀의 인시튜(in situ) 이미징으로 넘어가겠습니다. 이틀 전, Lewis 쥐의 서혜부에 GFP로 표지된 알부민 특이적 T 세포를 주입했습니다.

오늘은 동일한 쥐의 귀에 실험을 진행하겠습니다. 오른쪽 귀에는 알부민을 주입하고, 왼쪽 귀에는 PBS를 주입하겠습니다.

제가 주입하는 albumin의 용량은 20 µL에 20 µg입니다. 그리고 사용 중인 albumin은 Texas Red가 표지된 albumin과 표지되지 않은 albumin을 1:1 비율로 혼합한 것입니다. 여기 제가 주입하는 방법을 보여드릴 오른쪽 부위가 있습니다.

저는 오른손잡이라서 왼손을 사용합니다. 왼손의 장갑을 벗고, 한 손가락은 귀 아래에, 다른 손가락은 귀 위에 놓아 피부를 팽팽하게 당겼습니다. 이렇게 하면 바늘의 위치를 정확히 확인하여 매우 얇은 공기층인 두 피부층 사이로 진입할 수 있습니다. 이를 위해 매우 얇은 27 gauge 바늘을 사용합니다.

뒤집어 보면 Texas red가 어디에 들어갔고 PBS가 어디에 들어갔는지 확실히 알 수 있습니다. 현재는 챌린지 후 42시간이 지난 상태이며, 스프링 로드 마이크로미터를 사용하여 귀의 두께를 측정하겠습니다. 알부민으로 챌린지한 오른쪽 귀와 챌린지하지 않은 왼쪽 귀를 모두 측정할 것이며, 두 귀의 두께 차이를 통해 염증의 강도를 파악할 수 있습니다.

오, 62 0 60 0 61, 0 60 또는 58 또는 57 또는 57입니다. 그리고 반대쪽 귀는 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46, 4 50입니다. 안녕하세요. Christine Beaton 씨가 DTH 반응을 측정한 후 제거한 쥐를 방금 저희에게 전달해 주었습니다.

저희는 이를 얼음 위에 실어 이곳으로 운반해 왔습니다. 이것은 쥐의 왼쪽 귀입니다. 그리고 저희는 현재 Ian Parker의 연구실에서 이광자 현미경 관찰을 수행하고 있습니다.

이제 이 귀 조직들을 in situ 이광자 이미징을 위해 준비하겠습니다. 여기 쥐 귀의 기저부를 준비할 예정입니다. 이 부분은 조직이 훨씬 두껍고 털이 삐져나와 있어, 바로 절개하기 시작하면 조금 지저분해질 수 있습니다.

먼저 털을 일부 제거하겠습니다. 귀를 부드럽게 잡습니다. 엄지와 검지 사이에 조직을 넣고 잡으면 조직을 훨씬 더 쉽게 제어할 수 있습니다.

저는 포셉을 사용하는 것보다 이 방법을 선호하는데, 포셉을 사용하면 조직의 상태를 쉽게 느끼기 어렵고 조직이 손상될까 봐 항상 걱정되기 때문입니다. 따라서 우리가 수행하는 동작을 직접 느낄 수 있어야 하므로, 저는 그냥 손가락을 사용하는 것을 좋아합니다.

이것은 쥐 귀의 이 부분에서 진피층이 벗겨져 나가는 모습입니다. 털을 일부 다듬으면서, 진피의 일부를 조심스럽게 다듬자 자연스럽게 벗겨졌습니다. 이를 위해 곡선형의 매우 작은 박리용 가위를 사용했습니다.

조직을 찌르지 않도록 주의하며, 귀의 기저부에서 상단 방향으로 천천히 이동하며 진피층의 일부를 부드럽게 절개합니다. 영상 촬영을 위해 아주 큰 윈도우를 만들 필요는 없습니다. 바로 이 정도 영역이면 조직으로 침투하는 세포들의 훌륭한 영상을 얻기에 충분합니다.

보시는 바와 같이 귀의 기저부부터 끝부분까지 거의 모든 영역에 온전한 혈관들이 남아 있습니다. 이 전체 영역은 DTH 이미징에 매우 적합합니다. 따라서 이미지 분석 스테이지에 접착하여 고정할 수 있도록, 노출시킨 해당 조직 조각을 절제하겠습니다.

여기서 절단한 다음, 방향을 돌려주세요. 여기를 절단할 수 있습니다. 이제 두 광자 현미경으로 이미징 준비를 할 수 있는 적절한 크기의 조직 조각이 준비되었습니다.

이것들은 조직 크기에 맞춰 절단한 파손되지 않는 플라스틱 커버슬립입니다. 그다음 bet bond를 사용하여 조직을 이 커버슬립 위에 고정합니다. 그리고 실리콘 그리스를 사용하여 이 파손되지 않는 플라스틱 커버슬립을 in situ 이미징 스테이지에 고정합니다.

약간의 곡률이 있는 이 작은 귀 조직 조각을 가져와서, 접착제로 고정하면서 평평하게 펴주어야 합니다. 이상적인 방법은 아니지만, 이렇게 하면 가능합니다. 이제 커버슬립 하나를 가져와서 귀의 크기를 대략적으로 가늠한 뒤, 생각하시는 것보다 조금 더 크게 절단하십시오.

조직을 커버슬립에 고정하기 위해, bet long이라는 조직 안전 슈퍼글루를 사용합니다. 3M 제품을 사용하여 커버슬립 위에 몇 방울 떨어뜨립니다.

너무 많이 사용하지 않도록 주의해야 합니다. 또한 접착제가 고르게 도포되었는지 확인해야 합니다. 따라서 렌즈 페이퍼를 작게 잘라 모서리 부분을 이용해 커버슬립 위에 접착제를 얇게 펴 바르겠습니다.

접착제를 약간 더 추가하겠습니다. 이 접착제는 물에 닿는 즉시 경화됩니다. 따라서 조직 샘플을 다룰 때 매우 주의해야 합니다. 곡면 부분에 있어 이미징하지 않을 가능성이 높은 조직의 모서리 부분을 잡겠습니다.

약간만 물기를 제거하겠습니다. 렌즈 페이퍼를 사용하여 바닥 부분을 완전히 말려줍니다. 그리고 이 쥐 귀 조직의 모서리를 커버슬립에 접촉시키겠습니다.

그리고 제가 만진 부분은 즉시 경화되어야 합니다. 나머지 부분은 가장자리를 가볍게 눌러서 살짝 평평하게 만들겠습니다. 그렇게 하여 적절한 이미징 프레임을 확보할 수 있기를 바랍니다.

이제 조직을 배지에 담가 접착제를 경화시키겠습니다. 접착제가 조직 윗면에 묻는 것을 방지하기 위해, 조직을 뒤집은 다음 배지가 담긴 저장조에 한쪽 모서리부터 천천히 담급니다. 이렇게 하면 조직이 잘 고정되며, 조직 이미징 챔버에서 이미징을 수행할 수 있습니다. 이제 in situ 이미징을 위해 준비한 조직 조각을 스테이지 위에 장착하겠습니다.

여기에 바닥면에 실리콘 그리스를 바른 조직 조각이 있으며, 이를 배지 흐름 속에 조심스럽게 놓습니다. 이제 실리콘 그리스로 인해 조직이 스테이지 바닥에 고정되었습니다. 온도 프로브를 바로 옆에 두고 배지 흐름을 가열합니다.

이제 초점을 맞추겠습니다. 초점용 조명인 밝은 필드(bright field) 조명을 켜겠습니다. 20x 대물렌즈를 사용하여 챔버 쪽으로 내리겠습니다.

조직에 닿지 않도록 주의하십시오. 접안렌즈를 통해 귀 조직에 초점을 맞춥니다. 이제 보입니다.

여기 쥐 귀의 진피층에 있는 자가형광 녹색 모낭이 보입니다. 이 모낭 주변은 조밀한 콜라겐 층으로 둘러싸여 있습니다. 이 층은 T 기억 세포의 T 광자 이미징을 위해 제거하는 층입니다.

자가형광을 띠는 모낭과 상부 진피층의 밝은 콜라겐이 이미지를 가릴 수 있습니다. 여기서 Texas red가 접합된 volin을 섭취한 APC들이 푸른색 콜라겐 섬유를 따라 배치되어 있는 것을 확인할 수 있습니다. 콜라겐 섬유가 푸른색으로 보이는 것은 콜라겐 섬유를 따라 얻어지는 2차 조화파 생성(second harmonic generation) 다광자 이미징 때문입니다.

우리는 매우 운동성이 강한 T 세포를 가지고 있습니다. 이 세포들은 콜라겐 섬유를 따라 위아래로 이동하며 APC와 상호작용합니다. 따라서 이 영상에서 여러분은 Christine Beaton 박사가 Lewis 쥐에서 입양성 DTH를 유도하는 과정을 보셨습니다.

이어서 영상 촬영을 위한 쥐 귀 준비 과정, 반응성 T 작동 기억 세포, 그리고 이를 수행하기 위한 쥐 귀 모델 및 이광자 기술에 대해 보여드렸습니다.