인간의 사후 뇌 조직에서 핵의 연결을 격리

인간 뇌에서 신경 세포 특정 유전자 발현을 관장하는 염색질 DNA 상호 작용을 연구하기 위해서는 먼저 순수한 신경 핵 집단을 얻어야 합니다. 사후 인간 뇌 조직은 균질화되고 전체 핵은 밀도 구배 원심분리를 사용하여 분리됩니다. 그런 다음 핵은 유동 계량 분류를 통해 분리된 신경 세포 특이적 항체로 표지되고 마지막으로 초원심분리로 농축됩니다.

안녕하세요, 저는 매사추세츠 대학교 의과대학 정신의학과 샤론 맥 바리안 박사 연구실의 아니쉬 마탄입니다. 오늘은 사후 인간 뇌 조직에서 신경 세포를 분리하는 절차를 보여 드리겠습니다. 시작하겠습니다.

분류할 각 핵 샘플에 대해 1,000mg의 냉동 사후 뇌 조직으로 시작합니다. 이 양으로 형광 활성화 분류 후 약 500만 개의 신경 세포를 얻을 수 있습니다. 핵 추출을 시작하려면 5mil의 용해 완충액이 들어 있는 다운 다우너에 뇌 조직 250mg을 넣고 얼음 위에 놓습니다.

조직이 해동되면 얼음 위에서 1분 동안 사용합니다. 다우닝 후 균질화된 조직을 15mil 투명 초원심분리기 튜브로 옮긴 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 나머지 조직에 대해 이 균질화를 반복합니다.

다음으로, 9mil의 자당 용액을 초원심분리 튜브의 바닥에 조심스럽게 피펫팅하여 균질화된 조직 용액이 자당 용액 위에 오도록 농도 구배를 설정합니다. 이제 초원심분리기 튜브의 무게를 측정하여 초원심분리 중에 균형이 잡혔는지 확인합니다. 최상층에 용해 완충액을 추가하여 무게를 조정합니다.튜브의 무게를 잰 후 SW 28 로터 초원심분리기 샘플을 사용하여 초원심분리기에 넣습니다.amp4도에서 2.5시간 동안 107163.6 RCF에서 튜브

원심분리가 완료되면 스내트(snat)와 농도 구배에서 발견된 파편층을 흡인합니다. 핵이 들어 있는 튜브 바닥의 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 각 펠릿에 하나의 XPBS 500마이크로리터를 넣고 20분 동안 얼음 위에 두십시오.

20분 후, resus는 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 현탁시킵니다. 얼음 위에서 배양하면 펠릿이 자체적으로 약간 용해될 수 있으므로 핵을 다시 부유시키는 것이 더 쉬워져 핵이 경험하는 스트레스의 양이 줄어듭니다. 그런 다음 resus 현탁액과 핵을 두 개의 mil 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

두 개의 울트라 센트 튜브의 핵 용액을 각 마이크로 원심 튜브에 결합하고 다시 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 이제 핵 추출이 완료되었으므로 신경 세포를 분리하기 위해 면역 염색 단계로 넘어가서, 핵이 포함된 샘플을 1차 및 2차 항체로 구성된 면역 염색 혼합물로 분류하고 1.2마이크로리터의 신경 특이 항체에서 300마이크로리터의 1XPBS로 면역 염색 혼합물을 새로운 N으로 만들기 위한 연결 고리를 차단합니다. 그런 다음 하나의 XPBS에 0.5%BS, A 및 10%일반 코드 세럼을 함유한 100마이크로리터의 블로킹 믹스를 추가합니다.

마지막으로 LOR 4 88이라는 2차 항체 1마이크로리터를 추가합니다. 또한 이 면역 염색 혼합물에 대한 음성 대조군 샘플에 대한 면역 염색을 준비합니다. 1차 항체 새로운 말단을 제외하고 1.2마이크로리터의 1 XPBS로 교체합니다.

이제 와류 면역 염색 혼합물을 만들고 염색 혼합물이 배양하는 동안 어둠 속에서 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 음성 대조군 샘플에 대한 대조 핵 샘플을 준비합니다.20마이크로리터의 resus span 핵을 1개의 XPBS의 980마이크로리터를 포함하는 2mil 튜브에 넣습니다. 또한 핵 용액과 PBS만 포함하는 염색되지 않은 대조군을 준비합니다.

이제 Eloqua는 핵 20마이크로리터를 다른 튜브에 넣고 하나의 XPBS로 부피를 1mil까지 다시 높입니다. 그런 다음 모든 샘플을 얼음 위에 다시 놓습니다. 이제 면역 염색 혼합물이 완성되었습니다.

배양: 혼합물 401마이크로리터를 적절한 샘플에 추가합니다. 핵 샘플은 새로운 것과 LOR 4 88을 모두 포함하는 혼합물을 받았다. 음성 대조군 샘플은 2차 항체 LOR 4 88만 포함하는 혼합물을 받았고, 염색되지 않은 대조군 샘플에는 면역 염색이 첨가되지 않았습니다.

다음으로, 샘플을 콜드론으로 옮기고 45분 동안 어둠 속에서 회전시킵니다. 이제 45분의 배양이 완료되었으므로, 저는 샘플을 매사추세츠 의과대학 유세포 분석 핵심 시설로 걸어가 형광 활성화 분류를 수행할 것입니다.핵심 시설로 운송하는 동안 샘플은 얼음 위에 보관하고 어두운 곳에 보관해야 합니다. 유세포 분석 핵심 시설에서 샘플은 먼저 40미크론 필터를 통해 여과된 다음 차갑게 유지된 상태에서 몇 분 동안 기기를 통과합니다.

이 작업은 정렬하기 전에 몇 가지 예비 데이터를 가져오기 위해 수행됩니다. 염색되지 않은 대조군은 음성 형광의 정도를 설정합니다. 이 정보를 기반으로 형광에 대한 기계 감도를 조정합니다.

염색 대조군은 독감을 통제하는 데 사용됩니다. 이 시점에서 형광 부족으로 인한 모든 배경 소음은 분류에 필요한 적절한 게이트를 설정합니다. 샘플을 분류하기 위해 여러 가지 게이트가 사용됩니다.

다음은 첫 번째 게이트에 대한 몇 가지 일반적인 데이터입니다. 이 팩스 분석 차트는 게이트가 조정된 후의 대표적인 샘플을 보여줍니다. 첫 번째 게이트는 형광 및 일반적인 시각적 경험과 같은 설정의 조합을 기반으로 파편과 생존 가능한 핵의 패턴을 인식합니다.

x축은 상대적 크기에 해당하는 전방 산란을 나타내고 Y축은 세분성과 같은 내부 복잡성을 설명하는 사이트 산란을 나타냅니다. 첫 번째 게이트는 또한 샘플 내에서 발견되는 다양한 핵의 크기에 대한 아이디어를 제공할 수 있습니다. 이를 통해 실제 핵에서 파편을 분리할 수 있으며, 다음은 두 번째 게이트의 일반적인 데이터입니다.

이 팩스 차트는 두 번째 게이트의 예를 보여주며, 이를 통해 핵을 개별적으로 정렬하고 응집체를 버릴 수 있습니다. 이 게이트는 핵이 레이저를 통과하기 위해 걸리는 시간의 차이를 살펴봅니다. 집계인 항목은 일반적으로 통과하는 데 더 오래 걸립니다.

이 특정 매개변수는 응집체의 포함이 일부 형광 핵이 비형광 핵에 결합될 수 있기 때문에 순도를 방해할 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 마지막으로, 다음은 세 번째 게이트의 일반적인 데이터입니다. 이 게이트는 2차 항체에서 발견되는 형광과 일치하는 특정 형광 파장으로 설정됩니다.

이 팩스 차트에서는 x축을 따라 형광 수준을 볼 수 있고 Y축을 따라 짙은 빨간색 채널 감지기인 PECY Seven을 볼 수 있습니다. 이러한 점 블롯은 단일 색상 히스토그램과 비교할 때 더 나은 시각적 효과를 제공합니다. SCADA를 배치하면 새롭고 긍정적인 뉴런 핵과 새롭고 부정적인 비뉴런 핵을 분류하고 분리할 수 있습니다.

모든 게이트가 선택되면 핵이 하나의 XPBS로 분류됩니다. 전체 샘플이 사실 분류를 거치면 기기를 통해 분류된 샘플의 Eloqua를 실행하여 정렬의 순도를 확인합니다. 다음은 최적의 결과의 예입니다.

여기에서는 핵의 혼합 집단을 포함하는 presort 샘플과 대부분의 음성 핵을 제거한 정렬된 Eloqua를 비교합니다. 순도 백분율은 설정된 게이트를 기준으로 샘플을 오염시키는 이벤트의 수를 기반으로 합니다. 샘플을 기계를 통해 처음 실행할 때 약간의 표백이 발생할 수 있으므로 이를 설명하기 위해 약간의 디밍이 발생할 수 있으며 일부 조정이 필요할 수 있습니다.

샘플이 분류되면 핵 처리를 시작합니다. 이렇게하려면 분류 된 샘플 10 mils를 취하고 2 mil의 자당 용액, 50 마이크로 리터의 1 몰 염화칼슘 및 30 마이크로 리터의 1 몰 마그네슘 아세테이트를 추가합니다. 분류된 샘플이 10mil 미만인 경우 XPBS 1개를 추가하여 부피를 최대 10mil까지 높이거나 그에 따라 추가 재료를 조정하십시오.

그런 다음 샘플을 여러 번 뒤집어 얼음 위에 15분 동안 놓습니다. 15 분 후에, 그네 물통 회전자 1, 4개도에 15 분 동안 786 RCF에 있는 centrif 특징 표본. 원심분리 후 튜브 바닥에 있는 흰색 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 흡입합니다.

그런 다음 펠릿을 이전 실험에 필요한 적절한 용액 200마이크로리터에 용해시킵니다. 이 경우, 우리는 후속 칩 실험을 위해 펠릿과 다우닝 버퍼를 용해합니다. 그런 다음 파이프로 펠릿을 위아래로 다시 매달아 놓습니다.

이 시점에서 핵을 더 작은 튜브로 옮기고 섭씨 영하 80도의 냉동고에 넣을 수 있습니다. 더 사용하기 전까지는, 음, 방금 인간의 사후 뇌 조직에서 뉴런 핵을 분리하는 방법을 보여드렸습니다. 이 핵을 사용하여 염색질 면역침전과 같은 다양한 분석을 수행할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때 핵은 고정되어 있지 않고 장온도에서 분해될 수 있으므로 항상 샘플을 얼음 위에 보관하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 생물 안전성 레벨 2 이상의 안전 기준으로 인체 조직을 취급하는 것이 중요합니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.