인간의 사후 뇌 조직에서 핵의 연결을 격리

인간 뇌의 신경세포 특이적 유전자 발현을 조절하는 염색질 DNA 상호작용을 연구하기 위해서는 먼저 순수한 신경세포 핵 집단을 확보해야 합니다. 사후 인간 뇌 조직을 균질화하고 밀도 구배 원심분리를 사용하여 전체 핵을 분리합니다. 그 다음 신경세포 특이적 항체로 핵을 표지한 후 유세포 분석 정렬을 통해 분리하고, 마지막으로 초원심분리를 통해 농축합니다.

안녕하세요, 저는 매사추세츠 대학교 의과대학 정신건강의학과 Sharon mc Barian 박사님 연구실의 Anish Matan입니다. 오늘은 사후 인간 뇌 조직에서 신경세포 핵을 분리하는 절차를 보여드리겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.

분리할 각 핵 샘플에 대해, 1000 mg의 동결된 사후 뇌 조직에서 시작합니다. 이 양을 사용하면 형광 활성 세포 분리(fluorescence activated sorting) 후 약 500만 개의 신경세포 핵을 얻을 수 있습니다. 핵 추출을 시작하려면, 5 mL의 용해 버퍼(lysis buffer)가 담긴 튜브에 250 mg의 뇌 조직을 넣고 얼음에 배치합니다.

조직이 해동되면 얼음 위에서 1분 동안 분쇄합니다. 분쇄 후, 균질화된 조직을 15 ml 투명 초원심분리 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 둡니다. 나머지 조직에 대해 이 균질화 과정을 반복합니다.

다음으로, 균질화된 조직 용액이 sucrose 용액 위에 놓이도록 농도 구배를 형성하기 위해 sucrose 용액 9 mL를 초원심분리관 바닥에 조심스럽게 피펫팅합니다. 이제 초원심분리 과정 동안 균형이 유지되도록 초원심분리관의 무게를 측정합니다. 최상층에 lysis buffer를 추가하여 무게를 조정하십시오. 튜브의 무게 측정이 완료되면, SW 28 로터를 사용하여 초원심분리기에 넣고 4°C에서 107,163.6 RCF로 2.5시간 동안 초원심분리합니다.

원심분리가 완료되면, 농도 구배에서 발견되는 잔해 층과 상층액을 흡입하여 제거합니다. 이때 튜브 바닥에 있는 핵이 포함된 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 각 펠렛에 1X PBS 500 µL를 추가하고 얼음 위에서 20분 동안 방치합니다.

20분 후, 피펫팅을 통해 펠릿을 재부유시킵니다. 얼음 위에서 배양하면 펠릿이 어느 정도 스스로 용해되어 핵의 재부유가 쉬워지며, 결과적으로 핵이 받는 스트레스를 줄일 수 있습니다. 그런 다음 재부유된 핵을 2 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.

두 개의 초원심분리 튜브에 담긴 핵산 용액을 각각의 마이크로 원심분리 튜브에 합친 후, 샘플을 다시 얼음에 둡니다. 이제 핵 추출이 완료되었으므로, FACS 소팅을 통해 신경세포 핵을 분리하기 위한 면역 염색 단계로 넘어가겠습니다. 핵이 포함된 샘플을 1차 및 2차 항체와 블로킹 혼합물로 구성된 면역 염색 혼합물과 함께 배양할 것입니다. 면역 염색 혼합물을 만들기 위해, 1X PBS 300 µL에 신경세포 특이적 항체 NeuN 1.2 µL를 추가합니다. 그 다음 0.5% BSA와 10% normal goat serum이 포함된 1X PBS 기반의 블로킹 혼합물 100 µL를 첨가합니다.

마지막으로 LOR 4 88이라고 불리는 2차 항체 1 µL를 첨가하십시오. 또한 이 면역 염색 혼합물에 대한 음성 대조군 샘플용 면역 염색액을 준비하십시오. 1차 항체를 제외하고 그 대신 1X PBS 1.2 µL를 넣으십시오.

이제 면역염색 혼합물을 볼텍싱하고, 염색 혼합물이 반응하는 동안 상온의 암소에서 5분간 배양합니다. 음성 대조군 샘플을 위한 대조군 핵 샘플을 준비합니다. 1 XPBS 980 µL가 들어 있는 2 mL 튜브에 resus span 핵 20 µL를 분주합니다. 또한 핵 용액과 PBS만 포함된 비염색 대조군도 준비합니다.

이제 핵 20 µL를 다른 튜브로 옮기고 1X PBS를 사용하여 부피를 다시 1 mL로 맞춥니다. 그런 다음 모든 샘플을 다시 얼음 위에 둡니다. 이때쯤이면 면역 염색 혼합물이 모두 준비되었을 것입니다.

배양 단계에서 혼합물 401 µL를 적절한 시료에 첨가합니다. 핵 시료에는 신규 항체와 LOR 4 88이 모두 포함된 혼합물을 첨가합니다. 음성 대조군 시료에는 2차 항체인 LOR 4 88만 포함된 혼합물을 첨가하며, 무염색 대조군 시료에는 면역 염색 시약을 첨가하지 않습니다.

다음으로, 샘플을 콜드론(coldron)으로 옮겨 암실에서 45분 동안 회전시킵니다. 45분의 배양이 완료되었으므로, 이제 샘플을 매사추세츠 대학교 의과대학의 유세포 분석 코어 시설(flow cytometry core facility)로 옮겨 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated sorting)를 수행하겠습니다. 코어 시설로 운반하는 동안 샘플은 얼음 위 암소 상태로 유지해야 합니다. 유세포 분석 코어 시설에서 샘플은 먼저 40 micron 필터로 여과한 후, 저온 상태를 유지하며 수분 동안 기기로 분석합니다.

이는 소팅 전 예비 데이터를 얻기 위해 수행됩니다. 염색하지 않은 대조군은 음성 형광의 정도를 설정합니다. 이 정보를 바탕으로 형광에 대한 장비 민감도를 조절하십시오.

염색된 대조군은 형광을 제어하는 데 사용됩니다. 이 시점에서 형광 이탈로 인한 배경 노이즈를 확인하여 소팅에 필요한 적절한 게이트를 설정합니다. 샘플을 소팅하기 위해 여러 가지 서로 다른 게이트가 사용됩니다.

첫 번째 게이트에 대한 일반적인 데이터입니다. 이 팩스 분석 차트는 게이트 조정 후의 대표 샘플을 보여줍니다. 첫 번째 게이트는 형광 및 일반적인 시각적 경험과 같은 설정의 조합을 기반으로 데브리스와 생존 핵의 패턴을 인식합니다.

x축은 상대적 크기에 해당하는 전방 산란광(forward scatter)을 나타내며, y축은 과립도와 같은 내부 복잡성을 나타내는 측방 산란광(side scatter)을 나타냅니다. 첫 번째 게이트를 통해 샘플 내에서 발견되는 서로 다른 핵들의 크기를 가늠할 수 있습니다. 이를 통해 데브리(debris)와 실제 핵을 분리할 수 있으며, 여기는 두 번째 게이트에서 얻은 전형적인 데이터입니다.

이 팩스 차트는 응집체를 제거하면서 핵을 개별적으로 분리할 수 있게 하는 두 번째 게이트의 예를 보여줍니다. 이 게이트는 핵이 레이저를 통과하는 데 걸리는 시간의 차이를 분석합니다. 일반적으로 응집체는 통과하는 데 더 오랜 시간이 걸립니다.

응집체가 포함될 경우 일부 형광 핵이 비형광 핵과 결합하여 순도에 영향을 줄 수 있으므로 이 특정 파라미터는 매우 중요합니다. 마지막으로, 세 번째 게이트에서 얻은 전형적인 데이터입니다. 이 게이트는 2차 항체에 포함된 형광체와 일치하는 특정 형광 파장으로 설정되었습니다.

이 팩스 차트의 x축은 형광 수준을, y축은 딥 레드 채널 검출기인 PECY 7을 나타냅니다. 이러한 도트 블롯은 단일 색상 히스토그램과 비교했을 때 더 나은 시각적 정보를 제공합니다. SCADA를 배치하면 뉴런 핵 양성 세포를 뉴런 핵 음성 비뉴런 핵 세포로부터 분류하고 분리할 수 있습니다.

모든 게이트 선택이 완료되면, 핵들을 하나의 XPBS로 분리합니다. 전체 샘플에 대해 사실 정렬(fact sort)이 완료되면, 분리된 샘플의 Eloqua를 기기로 분석하여 정렬 순도를 확인합니다. 다음은 최적의 결과 예시입니다.

여기에서 핵의 혼합 집단이 포함된 분리 전 샘플과 대부분의 음성 핵이 제거된 분리 후 Eloqua를 비교하십시오. 순도 백분율은 설정된 게이트를 기준으로 샘플에 혼입된 이벤트 수를 기반으로 한다는 점에 유의하십시오. 샘플을 기기에 처음 통과시킬 때 일부 표백 현상이 발생하여 신호가 약해질 수 있으므로, 이를 보정하기 위해 일부 조정이 필요할 수 있음을 염두에 두십시오.

시료 분리가 완료되면 핵 처리 과정을 시작합니다. 이를 위해 분리된 시료 10 µL를 취하고, 수크로스 용액 2 µL, 1 M 염화칼슘 50 µL, 1 M 아세트산마그네슘 30 µL를 첨가합니다. 분리된 시료가 10 µL 미만인 경우, 1X PBS를 추가하여 부피를 10 µL로 맞추거나 그에 따라 첨가물의 양을 조절하십시오.

다음으로, 샘플을 여러 번 뒤집어 섞은 후 15분 동안 얼음에 보관합니다. 15분 후, 스윙 버킷 로터를 사용하여 4°C에서 1,786 RCF로 15분 동안 샘플을 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 튜브 바닥에 형성된 흰색 펠렛이 섞이지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.

그런 다음 펠렛을 이전 실험에 필요한 적절한 용액 200 µL에 녹입니다. 본 실험에서는 후속 칩 실험을 위해 펠렛을 다운잉 버퍼(downing buffer)에 녹입니다. 그 후 피펫팅을 통해 펠렛을 재현탁합니다.

이 단계에서 핵을 더 작은 튜브로 옮겨 -80°C 냉동고에 보관할 수 있습니다. 이후 사용 전까지 보관하십시오. 지금까지 인간 사후 뇌 조직에서 신경세포 핵을 분리하는 방법을 살펴보았습니다. 이렇게 분리한 핵을 사용하여 염색질 면역침전법과 같은 다양한 분석을 수행할 수 있습니다.

본 절차를 수행할 때, 핵이 고정되지 않은 상태여서 높은 온도에서 분해될 수 있으므로 샘플을 항상 얼음 위에 보관하는 것이 중요합니다. 또한, 인체 조직은 생물안전등급 2단계(BSL-2) 이상의 안전 기준에 따라 취급해야 합니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다.

시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.