라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

Dowling 연구실에서는 제브라피쉬 돌연변이체가 움직임을 감지하지 못하더라도 빛을 감지할 수 있는지, 즉 실명 상태가 아닌지를 확인하기 위해 제브라피쉬 망막의 생리학 및 발달 과정을 연구합니다. 이를 위해 시각 운동 반응(VMR)을 테스트하며, 수정 후 약 4일 된 제브라피쉬를 수집하여 실험에 사용합니다.

이들을 96-웰 플레이트에 배치하고 적절한 이미징 장치를 준비한 뒤, 비디오 트래킹 소프트웨어를 플레이트에 맞게 정렬합니다. 그런 다음, VMR이라고 부르는 명-암 또는 암-명 전환에 따른 물고기의 운동 반응을 추적합니다. 안녕하세요, 하버드 대학교 분자 및 세포 생물학과의 John Dowling 실험실 소속 Farida Imran입니다.

저는 제이슨 리오입니다. 하버드 대학교 분자 및 세포 생물학과의 알렉산더 시어(Alexander Shear) 교수 연구실 소속입니다. 오늘은 빛의 증가와 감소에 따른 제브라피시의 시각 운동 반응을 보여드리겠습니다.

그럼 시작하겠습니다. 시각-운동 반응 분석(visual motor response assay)을 시작하려면, 먼저 야생형 제브라피시 치어를 28°C의 명암 주기 조건에서 수정 후 최소 4일까지 배양하십시오. 최상의 행동 분석 결과를 얻기 위한 일반적인 명암 주기는 오전 9시부터 14시간 동안 점등하고, 오후 11시부터 10시간 동안 소등하는 것입니다.

치어가 너무 밀집되지 않도록 주의하십시오. 일반적으로 하나의 페트리 접시에 50마리 이하의 치어를 유지합니다. 수정 후 5일이 지나면, 치어가 충분히 헤엄칠 수 있는 공간을 확보하기 위해 650 µL 웰 크기의 96-웰 플레이트로 제브라피시를 옮깁니다.

플라스틱 전송 피펫을 사용하여 우물당 한 마리의 유충을 조심스럽게 옮깁니다. 물고기를 우물로 옮긴 후, 수면이 우물 상단에 거의 맞닿을 정도로 각 우물을 어류 배양수로 충분히 채웁니다. 녹화 카메라의 광학적 문제를 방지하기 위해 우물에 물을 너무 많이 또는 너무 적게 채우지 않도록 주의하십시오.

또한 웰(well) 내에 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 이제 제브라피쉬의 빛과 어둠에 대한 운동 반응을 모니터링할 준비가 되었습니다. 플레이팅된 제브라피쉬를 기록 장치로 옮기겠습니다.

그럼 기록 장치를 살펴보겠습니다. 물고기가 들어 있는 96-well 플레이트는 여기 흰색 트레이 내의 기록 챔버에 배치되며, 스프링이나 고무줄로 고정됩니다. 카메라는 상자의 뒤쪽에 위치하며, 여기 상단에 있는 거울을 통해 플레이트에 초점을 맞춥니다.

거울을 고정하는 나사를 돌려 거울의 각도를 조절할 수 있습니다. 기록 챔버의 하단에서는 적외선 LED로 조명을 비춥니다. 이를 통해 카메라는 어두운 환경에서도 물고기를 기록할 수 있습니다.

유충은 IR 광을 감지할 수 없으므로, 이러한 지속적인 IR 조사는 실험에 영향을 미치지 않습니다. 또한 백색 LED가 기록 챔버 하단에서 조명을 제공합니다. 이는 몇 시간 이상 지속되는 실험을 위해 IR 조명과 별도로 제어됩니다.

실험 기간 동안 일정한 온도를 유지하기 위해 챔버에 물을 천천히 흐르게 채울 수 있습니다. 물은 소형 수족관 펌프를 통해 저장조에서 펌핑되며, 일반적인 수중 수족관 히터를 사용하여 28°C로 가열합니다. 물은 커다란 배수 구멍을 통해 빠져나가 저장조로 재순환되어, 실험실 내의 불필요한 진동을 최소화합니다.

전체 기록 장치는 무거운 밸런스 테이블 위에 설치되어 있습니다. 기록 장치가 준비되면, 박스 덮개를 사용하여 동물을 덮어 빛으로부터 추가로 격리합니다. 이제 96의 정렬을 진행하겠습니다.

먼저 이 작업을 수행하기 위해 비디오 추적 소프트웨어의 컴퓨터 그리드가 표시된 웰 플레이트의 96웰 플레이트에 물고기가 들어있는 상태로 기록 챔버에 넣습니다. 장기 실험을 위해 항온수조를 사용하는 경우, 플레이트를 천천히 물에 넣어 물 높이가 조절되어 플레이트 위로 물이 넘치지 않도록 합니다. ViewPoint 비디오 추적 소프트웨어에서 모든 치어와 실험 과정이 컴퓨터 화면에 보이는지 확인하십시오.

소프트웨어의 컨트롤을 사용하여 비디오 추적 소프트웨어의 그리드를 96-웰 플레이트의 웰과 정렬하여, 각 물고기가 그리드의 정사각형 안에 위치하도록 합니다. 이 단계는 모든 기록 과정에서 매우 중요합니다. 추적 컴퓨터는 이 각 박스에 대해 움직임을 개별적으로 계산하게 됩니다.

따라서 컴퓨터 그리드를 잘못 정렬하면 일부 어류의 움직임이 누락되거나, 더 심한 경우 인접한 두 마리의 물고기가 동일한 영역에 위치하게 되어 정렬 후 한 마리로 계산될 수 있습니다. 조명의 점등 및 소등 시간은 컴퓨터에 프로그래밍되어 있습니다.

우리는 일반적으로 박스 내에서 3시간 동안 약한 암적응 과정을 거치게 합니다. 이는 기저 활성 수준을 확보할 뿐만 아니라, 피펫팅 및 핸들링 이후 유충이 진정될 수 있는 기회를 제공합니다. 다음으로, 기록 챔버의 문을 닫고 기록을 시작합니다.

실제로 우리는 물고기 한 마리당 초 단위로 활동량을 기록하지만, ViewPoint 소프트웨어는 실제로 프레임별 데이터를 기록합니다. 아래 화면에서 단일 물고기의 실시간 추적 경로를 확인할 수 있습니다. 픽셀 이동 관점에서 볼 때, 흰색 선은 픽셀 변화 수가 설정된 임계값 미만임을 나타내며, 녹색 선은 픽셀 변화가 임계값 설정 이상임을 나타냅니다.

임계값은 사용하는 특정 카메라 및 조명 설정에 따라 다소 차이가 있을 수 있습니다. 본 연구의 설정에서는 일반적으로 4픽셀의 임계값을 사용합니다. 즉, 4픽셀 미만이 변화하는 경우에는 배경으로 간주합니다.

4개 이상의 픽셀이 움직이면 물고기가 이동하고 있음을 나타냅니다. 이러한 임계값은 거의 모든 치어의 수영 및 회전 동작을 감지한다는 것을 경험적으로 확인하였습니다. 기록 상자가 치어를 상당히 잘 분리하고 있음에도 불구하고, 우리는 여전히 실내 조명을 끄고 문을 여닫거나 댄스 파티를 하거나 운동 루틴을 수행하는 것과 같은 기계적 소음으로 인한 방해를 최소화하도록 주의를 기울입니다.

실험이 완료되면 수집된 데이터를 Excel 시트 또는 선호하는 분석 소프트웨어로 옮기십시오. 데이터의 형태는 다음과 같습니다. 여기에는 실험 시작부터의 시간과 초 단위의 경과 시간, 그리고 초당 각 유충의 활동성이 포함되어 있습니다.

여기 실험 전체 기간 동안 단일 유충의 활동성을 보여주는 그래프가 있으며, 그래프의 화살표는 여러 번의 온/오프(on and off) 반응을 나타냅니다. 이 그래프는 실험 전체 기간 동안 40마리 물고기의 평균 활동성을 보여주며, 화살표로 표시된 바와 같이 여러 번의 온/오프 반응이 나타납니다. 보시다시피, 온/오프 반응은 뚜렷하고 일관되게 나타납니다.

이 시각 운동 반응 실험은 돌연변이 물고기를 대상으로도 수행할 수 있습니다. 이러한 연구를 위해, 일반적으로 최적의 대조군 설정을 위해 야생형 물고기와 돌연변이 물고기를 동일한 플레이트에 체커보드 형태로 배치합니다. 야생형 물고기와 동일한 플레이트에 돌연변이 물고기를 사용할 때는 각 웰에 어떤 유형의 물고기가 배치되었는지 반드시 기록하십시오.

각 플레이트에 배치된 물고기를 추적하는 방법에 대한 제안입니다. 다음은 야생형과 변이형 유충을 비교한 시각 운동 반응 결과입니다. 다시 한번, 야생형 유충에서 뚜렷하고 일관된 온/오프 반응이 나타나는 것을 확인할 수 있습니다.

하지만 눈 발달이 결여된 chalk 돌연변이 유충은 빛의 증가나 감소에 대해 활동성이 유의미하게 증가하지 않았으며, 기저 활동 수준이 낮았습니다. 이러한 결과는 야생형의 반응을 NRC 돌연변이라고도 불리는 NO OKR 돌연변이와 비교한 것입니다. NRC 돌연변이는 OKR 테스트를 기반으로 완전히 맹인인 것으로 생각되었습니다.

VMR 테스트를 통해 NRC 돌연변이체가 정상적인 off 반응을 보이며, on 반응은 지연되고 둔하다는 것을 입증하였습니다. 따라서 NRC 돌연변이체는 이전에 생각했던 것처럼 완전히 맹인이 아닙니다. 지금까지 빛의 증가와 감소에 대한 제브라피시 labate의 시각 운동 반응을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때, 물고기는 밤보다 낮 동안 더 활발하며 빛의 강도 변화에 더 잘 반응하므로 실험을 낮에 진행하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이것으로 모두입니다.

시청해주셔서 감사합니다. 실험에서 좋은 결과 얻으시길 바랍니다.