Methylated DNA의 Immunoprecipitation

이 동영상은 메틸화된 DNA 면역침전 또는 밋업(meetup)을 위한 프로토콜을 보여줍니다. 편향되지 않은 방식으로 메틸화된 DNA를 특이적으로 분리하는 데 사용되는 방법입니다. 포유류의 DNA 메틸화는 시토신의 C 5 위치에 메틸기가 추가되는 것이 특징입니다.

CPG 디뉴클레오티드에 존재할 때, 그것은 정상적인 발달뿐만 아니라 여러 질병 과정에서 중요한 역할을 하는 가역적인 후성유전학적 표시입니다. DNA 메틸화의 정상적인 기능에는 암컷의 X 염색체 불활성화, 반복적인 요소 침묵, 게놈 각인 및 게놈 안정성 유지가 포함됩니다. DNA 메틸화는 또한 암, 데르 윌리 증후군, 엥겔만 증후군, 면역 결핍, 중심 불안정성 및 안면 이상 증후군과 같은 수많은 질병에서 역할을 하는 것으로 나타났습니다.

예를 들어, 암의 경우, 비정상적인 과메틸화와 프로모터는 중요한 종양 억제 유전자의 침묵을 초래할 수 있습니다. 부적절한 저메틸화는 염색체 불안정성과 종양유전자 활성화를 초래하는 반면, 먼저 DNA를 300에서 1000 염기쌍 크기의 단편으로 음파 스케이트를 타서 밋업이 이루어집니다. 그런 다음 초음파 처리 된 DNA는 섭씨 95도에서 변성됩니다.

5개의 프라임 메타진을 인식하는 1차 항체를 첨가하여 메틸화된 DNA 단편에 결합할 수 있습니다. 마그네틱 다이나 비드에 접합된 2차 항체는 1차 항체에 의해 결합된 DNA 단편을 분리하는 데 사용됩니다. 메틸화되지 않은 단편은 제거되고 항체는 proteinase에 의해 분해됩니다.

KA 페닐 클로로포름 정화는 소화된 단백질을 제거하고 침전은 DNA를 정제하여 이제 메틸화 단편을 위해 농축됩니다. Meetup, DNA는 PCR 마이크로어레이 및 시퀀싱과 같은 응용 분야에 사용될 수 있습니다. 밋업은 일반적으로 이틀 동안 진행됩니다.

첫째 날에는 DNA 준비, 초음파 처리, 면역침전 및 단백질 분해가 포함됩니다. 2일차에는 pH 클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 통해 메틸화를 위해 농축된 DNA를 정제하고 분리합니다. 실리콘화 원심분리기 튜브, DNA 선화 장치, 1차 항체, 안티 파이브 프라임 메타진 마우스, 단클론 항체, 2차 항체, dyna beads, 양에 접합, anti-US IgG 및 마그네틱 튜브 랙을 포함하여 밋업에 필요한 몇 가지 특수 재료

밋업 프로토콜의 첫 번째 단계는 DNA를 준비하는 것입니다. 사전에 DNA의 특성을 평가하는 것이 필수적입니다. 샘플의 정확한 정량화가 가장 중요하고 DNA 양을 결정하는 다양한 방법이 원치 않는 DNA 종의 존재에 의해 부정적인 영향을 받을 수 있기 때문에 샘플 DNA의 상태를 아는 것이 주로 이중 가닥인지 단일 가닥인지 여부를 알아야 합니다.

이중 가닥 DNA 수량은 NanoDrop 3, 300 nd 하중 1.5 μl를 사용하여 분광 측광으로 쉽게 평가할 수 있으며 측정 유형을 핵산으로 설정하고 DNA 50을 계산으로 선택한 다음 1.5 μl의 물로 기기를 초기화합니다. 받침대를 청소하고 1.5마이크로리터의 액체로 기기를 비웁니다. 샘플을 청소하고 받침대를 청소하고 샘플 1.5 마이크로 리터를 적재하고 측정을 누릅니다.

농도가 주어지고 사용할 수 있습니다. 나에게 필요한 마이크로리터의 수를 계산하려면 1.8의 A 2 60 대 2 80 비율이 이상적입니다. 1마이크로그램의 샘플이 준비됩니다.

그러나 200나노그램의 샘플만으로도 성공적인 결과를 얻을 수 있습니다. 밋업의 경우 DNA 샘플을 깨끗한 실리콘 튜브에 로드합니다. 최종 부피를 50마이크로리터로 가져오기 위해 충분한 멸균수를 추가합니다.

DNA 초음파 처리 및 면역 침전은 DNA와 단백질이 튜브 벽에 비특이적으로 결합하는 것을 방지하기 위해 실리콘화 튜브에서 수행되어야 합니다. DNA가 준비되면 면역 침전이 더 작은 DNA 단편으로 더 효율적이므로 샘플을 단편화하기 위해 샘플이 초음파 처리되어야 하고, 샘플을 초음파 처리에 로드하고, 전력 설정이 높음으로 설정되어 있는지 확인하고, 기계가 30초로 설정되어 있는지 확인합니다. 30초 동안 끄면 베이스를 섭씨 4도의 물로 채웁니다.

샘플을 7분 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리가 완료되면 튜브를 제거하고 얼음 위에 올려 놓습니다. 예상되는 샘플, DNA 크기에 대한 초음파 처리 조건을 미리 최적화하는 것이 중요합니다.

예를 들어, 부분적으로 분해된 DNA 샘플은 더 짧은 초음파 처리 시간이 필요합니다. 초음파 처리 생성물은 표준 전기 영동 기술로 시각화 할 수 있습니다. 길이가 300에서 1000 염기쌍에 이르는 크기의 DNA 단편은 나중에 사용하기 위해 이 시점에서 바람직합니다.

마이크로어레이 및 PCR 분석에서는 DNA의 1/5을 입력 또는 참조 DNA로 사용하도록 예약해야 하며, 이 경우 800나노그램의 초음파 처리된 DNA가 면역침전을 위해 사용되고 나머지는 참조 DNA로 따로 보관됩니다. 배지 프로토콜의 다음 단계는 1차 항체를 추가하기 전에 면역침전 또는 IP 반응이며, DNA는 변성되어야 합니다. 1차 항체는 단일 가닥 DNA에 민감하기 때문에 변성이 필요합니다.

샘플을 섭씨 95도의 수조에 10분 동안 넣습니다. 변성 단계가 완료되면 즉시 튜브를 최소 5분 동안 얼음에 넣습니다. 이렇게 하면 Reen 무릎 꿇기로 인한 DNA가 변성되는 것을 방지하고 샘플이 냉각되었을 때 최적의 항체 결합을 허용합니다.

튜브를 짧게 돌려 내용물을 바닥으로 끌어당깁니다. 다음으로, 1차 항체를 추가해야 합니다. 사용되는 항체의 양은 각 배치 및 각 제조업체에 대해 적정해야 합니다.

이 경우, 5마이크로그램의 1차 항체를 첨가한 다음 면역침전 완충액 또는 IP 완충액을 최종 부피 500마이크로리터에 추가합니다. 다음으로, IP DNA를 회전기에 넣고 섭씨 4도에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 중 튜브 내에서 항체 응집체를 방지하기 위해 회전이 필요합니다.

1차 항체 배양이 완료되기 약 15분 전에 마그네틱 다이나 비드를 세척하고 준비합니다. 먼저 볼텍싱으로 바이알의 비드를 철저히 재현합니다. 그런 다음 30마이크로리터의 비드를 깨끗한 실리콘 튜브에 옮기고 해당 튜브를 마그네틱 랙에 올려 여러 반응을 위해 놓습니다.

반응당 30마이크로리터의 비드를 이송하며, 파이펫팅 오류 또는 일부 비드의 부주의한 손실을 허용하기 위해 한 번의 추가 반응에 충분한 양을 이송합니다. 예를 들어, 8개의 반응에 대해. 9회 반응 또는 270마이크로리터에 충분한 비드를 제거합니다.

마그네틱 비드는 마그네틱 랙의 벽을 향해 당겨집니다. 구슬이 이동하여 튜브 벽에 정의된 줄무늬로 정착할 때까지 2분을 기다립니다. 다음으로, 피펫 팁으로 뒷벽의 비드를 방해하지 않도록 조심스럽게 상층액 피펫을 제거하고 폐기하십시오.

과등액을 과도한 양의 IP 버퍼 와류로 교체하고 2분 동안 마그네틱 랙에 다시 올려 놓습니다. 이 세척을 한 번 더 반복하고 세척 비드를 IP 버퍼의 원래 부피에 다시 매달아 놓습니다. 배양이 완료되면 Rotator에서 샘플 튜브를 회수합니다.

면역침전을 완료하려면 30마이크로리터의 깨끗한 비드를 반응에 추가하고 튜브를 섭씨 4도에서 2시간 동안 회전기에 다시 넣습니다. 이 배양 동안, 2차 항체, 즉 항 마우스 IgG는 1차 마우스 항체에 결합할 것입니다. 항 마우스 항체는 마그네틱 다이나 비드에 접합되어 결합된 산물을 쉽게 회수하고 정제 단계를 따를 수 있습니다.

두 항체를 모두 사용한 배양이 완료되면 IP 튜브를 마그네틱 랙에 2분 동안 놓습니다. 이 시점에서 메틸화된 DNA는 1차 항체에 의해 결합되며, 이 항체 자체는 dyna bead conjugated secondary antibody에 의해 결합됩니다. 상층액을 제거 및 폐기하고 500마이크로리터의 IP 버퍼로 교체합니다.

튜브의 내용물을 섞어 2분 동안 랙에 다시 놓습니다. IP 버퍼로 이 세척을 한 번 더 반복합니다. 마지막 세척 Resus에서 상층액을 제거한 후 마지막으로 비드를 매달립니다.

400마이크로리터의 소화 완충액에서 100마이크로그램의 단백질분해효소 K로 반응을 처리하고 섭씨 50도에서 밤새 배양합니다. proteinase K 처리는 항체 단백질 및 DNA와 관련된 잔류 단백질을 소화하여 메틸화된 DNA가 용액으로 방출될 수 있도록 하는 데 필요합니다. DNA 정제는 밋업 절차의 두 번째 날에 수행되며 인큐베이터에서 다이제스트 튜브를 회수합니다.

흄 후드에서 pH 7의 일대일 페노 클로로포름 500마이크로리터를 튜브에 추가하고 13, 000에서 10분 동안 튜브를 완전히 회전시킵니다. G. 계면을 방해하거나 유기 층을 제거하지 않고 튜브에서 상단 수성상을 조심스럽게 제거하십시오. 수성상을 새 튜브로 옮깁니다.

인터페이스가 흐린 것처럼 보이는 경우 두 번째 추출이 수행될 수 있습니다. 다음으로,이 경우 3 몰 아세트산 나트륨의 10 번째 부피 인 40 마이크로 리터를 추가합니다. 1마이크로리터의 글리코겐은 펠릿 청소를 용이하게 하기 위한 운반체로 사용될 수 있습니다.

튜브를 소용돌이쳐 내용물을 혼합합니다. 그런 다음 100% 에탄올 2량을 넣고 와류를 일으키고 냉동 후 섭씨 영하 20도의 냉동고에서 20분 동안 얼립니다. 침전된 DNA는 13, 000 G 및 섭씨 4도의 원심분리기에서 20분 동안 회전합니다.

튜브 바닥에 DNA 펠릿이 형성됩니다. 원심분리기에서 튜브를 꺼내 에탄올을 제거합니다. 튜브 바닥의 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.

잔류 에탄올을 제거하기 위해 펄스 스핀이 필요할 수 있습니다. 펠릿을 세척하기 위하여는, 감기, 70%ethanol 와류의 500 마이크로리터를 추가하고, 13, 000 G 및 4 섭씨 온도에 20 분 동안 다시 회전시키십시오. 두 번째 스핀이 완료되면 70% 에탄올 펄스 스핀을 제거하고 A 피펫으로 잔류 에탄올을 제거합니다.

펠릿을 건조시키고 나머지 에탄올이 증발할 수 있도록 캡을 열어 둔 상태로 튜브를 랙에 두십시오. 마지막으로, Reus는 메틸화를 위해 농축된 DNA와 10마이크로리터의 멸균수만 포함된 펠릿을 현탁시켜 DNA 펠릿이 사용하기 전에 용해될 수 있는 충분한 시간을 허용합니다. PCR로 밋업 숙련도를 검증하는 것이 좋습니다.

이는 정상적인 인간 DNA 프라이머 증폭을 위해 메틸화 및 비메틸화 DNA 단편을 구분하여 증폭하도록 설계된 PCR 반응을 실행하여 수행할 수 있습니다. H 19 각인 대조군 영역은 메틸화되지 않은 게놈 영역을 증폭하도록 설계된 프라이머와 함께 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 프라이머 서열 및 PCR 사이클링 조건은 동반된 프로토콜에서 찾을 수 있습니다.

이 시점에서, 밋업 프로토콜의 시작 부분에서 따로 설정해 놓은 입력 또는 참조 DNA를 검색해야 합니다. 한 세트의 PCR 반응은 입력 DNA를 사용하여 설정되고 다른 세트는 메틸화를 위해 농축된 IP DNA를 사용합니다. 밋업이 성공적일 경우, IP PCR은 메틸화 프라이머를 사용하는 제품을 생산하고 대조군 프라이머를 사용하는 제품은 생산하지 않습니다.

반대로, 입력 PCR은 메틸화와 비메틸화를 모두 포함하므로 두 프라이머를 모두 사용하여 제품을 생산해야 합니다. DNA 단편. 메틸화 단편을 위해 농축된 DNA는 PCR 염기서열분석 및 마이크로어레이 분석과 같은 다양한 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

다른 분자 생물학 기술과 통합되면 메틸화 프로파일링 또는 후성유전체학 연구를 위해 유전자좌 특이적 또는 게놈 폭 방식으로 DNA의 메틸화 상태를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.