Name: Methylated DNA의 Immunoprecipitation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 24 s
Description: 배우세요 메틸화된 DNA 면역침전(MeDIP) 프로토콜을 통해 비편향적으로 메틸화된 DNA를 분리하는 방법을 익히세요. 이 기법은 후성유전학 및 질병 연구에서 DNA 메틸화 패턴을 분석하는 데 필수적입니다.

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우리는이 비디오 및 문서를 비평에 참여를 위해 갈색과 램 실험실의 구성원을 감사하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구와 건강 연구에 대한 마이클 스미스 재단에 대한 캐나다 연구소에서 자금을 지원했다.

DNA 추출 및 샘플 준비 다른 샘플의 다양한 (교양 세포, 신선한뿐만 아니라 포르말린 고정 파라핀 - 임베디드 조직 얼어붙은)에서 DNA가 MeDIP 사용할 수 있습니다. 같은 histones으로 관련된 단백질없이 높은 정화 DNA를 사용하는 것이 중요합니다. 그것의 DNA quantitation 및 항체 바인딩 모두를 방해할 수 있으므로, 샘플에서 가능한 한 많은 RNA를 제거하는 것도 중요합니다. MeDIP에 사용되는 DNA의 양은 200 NG에서 사용할 DNA의 양에 따라 1 μg 범위 수 있습니다. 이 프로토콜을 입증하기 위해, DNA 1 μg가 사용됩니다. 다음 프로토콜은 교양 세포에서 고품질의 이중 좌초 DNA를 제공합니다. 다른 프로토콜은 다른 샘플 형식에서 DNA의 추출을위한 고용해야합니다. <ol><li> 1.7 ML Eppendorf 튜브에 세포 펠렛을 소화 버퍼 400 μl를 추가합니다. </li><li> 튜브에 proteinase K 100 μg을 추가하고 50 밤새 품어 ° C. </li><li> 500 μl 페놀 산도 7 추가하고 반전에 의해 부드럽게하지만 철저히 섞는다. </li><li> 실온에서 10 분 13 000g에 스핀. </li><li> 새로운 튜브로 수성 (위) 분수를 제거합니다. </li><li> 반복되면 3-5 단계를 반복합니다. </li><li> 500 μl 1시 1분 페놀 / 클로로포름 산도 7 추가하고 반전에 의해 부드럽게하지만 철저히 섞는다. </li><li> 실온에서 10 분 13 000g에 스핀. </li><li> 새로운 튜브로 수성 (위) 분수를 제거합니다. </li><li> RNase 40 μg을 추가하고 37 1 시간을 품어 ° C. </li><li> 500 μl 페놀 산도 7 추가하고 반전에 의해 부드럽게하지만 철저히 섞는다. </li><li> 실온에서 10 분 13 000g에 스핀. </li><li> 새로운 튜브로 수성 (위) 분수를 제거합니다. </li><li> 반복 일단 13을 통해 11 단계를 반복합니다. </li><li> 500 μl 1시 1분 페놀 / 클로로포름 산도 7 추가하고 반전에 의해 부드럽게하지만 철저히 섞는다. </li><li> 실온에서 10 분 13 000g에 스핀. </li><li> 새로운 튜브로 수성 (위) 분수를 제거합니다. </li><li> 1/10th 볼륨에게 3 M의 아세트산 나트륨 (40 μl)을 추가하고 잘 섞는다. </li><li> 100 % 에탄올 2 권 (900 μl)를 추가, 20 분에 대해 -20 ° C에서 잘 믹스, 장소. </li><li> 4 20 분 13 000g에 스핀 ° C. </li><li> , 에탄올을 제거 펄스 스핀, 그리고 잔류 에탄올을 제거하십시오. </li><li> 세척 500 μl 차가운 70 % 에탄올을 추가합니다. 4 20 분 13 000g에 스핀 ° C. </li><li> , 70 % 에탄올을 제거 펄스 스핀, 그리고 pipetting하여 잔류 에탄올을 제거하십시오. </li><li> 공기가 잔류 에탄올의 모든 흔적을 제거하는 실온에서 10 분 오픈 뚜껑과 펠릿 건조. </li><li> 4 밤새 소독 dH2O의 50 μl에 Resuspend의 DNA ° C. </li><li> NanoDrop 분광을 이용하여 DNA를 계량. 260 : 1.8 280 비율이 이상적입니다. </li><li> 100 BP의 사다리와 아가로 오스 겔에 DNA의 품질과 크기 범위를 확인합니다. 게놈 DNA의 조금은 10 NG는 SYBR 골드 같은 DNA의 소량에 매우 민감합니다 염료를 사용하여 얼룩 다음 1.7 % 아가로 오스 겔에서 실행할 수 있습니다. </li><li> 샘플 당 하나의 siliconized 튜브, 소독 DH 2 O.와 만들어진 볼륨의 나머지 부분과 함께 50 μl의 총 볼륨의 DNA 1 μg를 준비 </li></ol> DNA SONICATION DNA의 sonication과 MeDIP 프로토콜은 튜브 벽에 단백질이 아닌 특정 바인딩을 방지하기 위해 siliconzied 튜브에 수행되어야합니다. DNA 샘플을위한 최적의 sonication 시간은 겔 전기 영동 (단계 27)에서 결정된 DNA 샘플 조각의 정도를 기준으로합니다. 예를 들어, 교양 세포에서 추출한 DNA는 매우 높은 분자량의해야하고, 이후 종종 부분적으로 저하 아르 보존 시료에서 추출한 DNA보다 더 많은 sonication 필요합니다. 샘플이 균일하게 높은 분자량의 경우,는 각각 샘플을 확인하지 않고이 프로토콜에 설명되어있는 sonication과 함께 진행하는이 시점에서 합리적이다. 샘플 아카이브 샘플로 조각난있다면, 그것은 300 - 100bp 조각을 얻기 위해 sonication 시간을 줄임으로써 가능성 sonication 절차를 적응하기 위해 필요한 것입니다. 당신은 부분적으로 저하, sonication 매개 변수의 최적화 관심이 그 대표 샘플을 수행할 수 아르 샘플을 처리할 것으로 예상하십시오. 겔 전기 영동 (단계 27)에서 관찰의 DNA 조각의 정도에 따라, 실험자의 샘플에 대한 최적의 sonication 시간을 미리하실 수 있습니다. 여기 우리는 높은 분자량의 DNA를 사용하여 자동 sonicating 장치 (Diagenode에서 Bioruptor, UCD - 200 TM)와 sonication하여 300-1000 BP의 DNA 조각을 얻을 수있는 방법을 설명합니다. <ol><li> Biorupter에 물이 4 있어야 ° C. </li><li> 자동 설정 7 분 (30 초 최대 전력에서 30 초 해제)에 대한 Sonicate. </li><li> immunoprecipitation (IP) 반응에 대한 siliconized 1.7 ML의 원심 분리기 튜브의 sonicated 제품과 장소 800 NG를 (40 μl)를 제거합니다. </li><li> 입력으로 봉사하는 나머지 200 NG (10 μl) (IN) (4 스토어 ° C)을 참조 DNA를 별도로 설정합니다. </리&gt; </ol> METHYLATED DNA의 IMMUNOPRECIPITATON <ol><li> 물 목욕 10 분 95 ° C에서 IP 반응 (800 NG)에 사용되는 DNA를 변성. </li><li> 얼음 즉시 쿨. 다음 단계로 진행하기 전에 (얼음 약 5 분)을 완전히 DNA은 식지. </li><li> 5 μg 단클론 항체를 추가합니다. </li><li> 500 μl의 최종 볼륨 IP 버퍼 (이 프로토콜을 통해 상온에서 사용) 추가합니다. </li><li> 튜브 홀더를 회전 4에서 2 시간 ° C에 대해 숙고하다. </li><li> 5 단계가 완료되기 전에 (6-11 단계) 세탁하여 Dynabeads를 준비합니다. 첫째, vortexing하여 유리병에 철저하게 구슬을 resuspend. </li><li> 새로운 siliconized 튜브 (예를 들어, 8 개의 반응을하는 경우, 9, 즉 270 μl 정도 구슬을 제거)로, 반응 더하기 하나 당 resuspended Dynabeads 30 μl를 (~ 2 × 10 7) 전송합니다. </li><li> 상온에서 2 분에 대한 자성 랙에 튜브를 삽입합니다. </li><li> 뜨는을 피펫. 뜨는 제거하면, 피펫 팁과 내부 벽 (구슬은 자석을 유치 어디)에 대한 구슬을 감동하지 마십시오. </li><li> 자석에서 튜브를 제거하고 IP 버퍼의 초과 량 (750 μl - 1000 μl)의 구슬을 resuspend. 다시 실온에서 2 분을위한 자기 랙에 튜브를 삽입합니다. </li><li> 한 번 더 씻어을 반복하고 7 단계에서 제거 원래 볼륨의 IP 버퍼에 씻은 구슬을 resuspend. </li><li> 각 IP 반응을 씻어 Dynabeads 30 μl 추가 </li><li> 4 2 시간에 회전 튜브 홀더에 품어 ° C. </li><li> 배양이 완료되면, 상온에서 2 분을위한 자기 랙에 튜브를 놓으십시오. </li><li> 뜨는을 피펫. 피펫 팁로 튜브의 내부 벽 (비즈는 자석을 유치 어디에) 감동하지 마십시오. IP 버퍼 500 μl를 추가합니다. 튜브의 내용을 믹스 2 분을위한 자기 선반에 놓으세요. 500 UL IP 버퍼 한 번에 함께 씻어 반복합니다. </li><li> 마지막 세척에서 뜨는을 제거한 후 소화 버퍼 400 μl의 구슬을 resuspend. </li><li> Proteinase K 100 μg과 반응을 치료하고 50 밤새 품어 ° C. </li></ol> IMMUNOPRECIPITATED DNA의 정제 <ol><li> 500 μl 1시 1분 페놀 / 클로로포름 산도 7 철저히 와동을 추가합니다. </li><li> 실온에서 10 분 13 000g에 스핀. </li><li> 새로운 튜브로 수성 (위) 분수를 제거합니다. </li><li> 수성 및 유기 층 사이의 계면이 흐린 나타나면 반복 1-3 단계를 반복합니다. </li><li> 10분의 1 일 볼륨 3 M의 아세트산 나트륨 (40 μl)와 와동을 추가합니다. </li><li> 1 글리코겐의 μl (20 μg / μl)와 와동을 추가합니다. </li><li> 100 % 에탄올, 소용돌이, 그리고 20 분에 대해 -20 ° C에서 장소 2 권 (1000 μl)를 추가합니다. </li><li> 4 20 분 13 000g에 스핀 ° C. </li><li> , 에탄올을 제거 펄스 스핀, 그리고 잔류 에탄올을 제거하십시오. </li><li> 세척 500 μl 차가운 70 % 에탄올을 추가합니다. 4 20 분 13 000g에 소용돌이 간략하게, 그리고 스핀 ° C. </li><li> , 70 % 에탄올을 제거 펄스 스핀, 그리고 pipetting하여 잔류 에탄올을 제거하십시오. </li><li> 공기가 잔류 에탄올의 모든 흔적을 제거하는 실온에서 10 분 오픈 뚜껑과 펠릿 건조. </li><li> 10 μl의 Resuspend DNA 펠렛은 DH 2 0을 살균. </li></ol> PCR에 의해 검증 <ol><li> 당신은 MeDIP 절차는 보통 인간의 DNA를 (남녀)를 사용하여 MeDIP 프로토콜을 수행하여 작업하고, 이후 methylation에 대한 풍부한 것으로 알려져 영역을 시금 있는지 확인하기 위해 검사 수도 있습니다. </li><li> PCR 튜브에 MeDIP 제품의 30 %, 다른 PCR 튜브에 MeDIP 제품의 또 다른 30 ​​%를 제거합니다. </li><li> PCR 튜브에 DNA에 10 NG, 다른 PCR 튜브에 DNA에 10 NG 놔. 이제 네 별도의 PCR 반응은 설정해야합니다. </li><li> PCR은 H19와 CTRL primers를 사용하여 수행은 표 1에서 지적했다. </li><li> 으로 표 2에 명시된 12.5 μl 총 볼륨 PCR 반응을위한 두 mastermixes (각 프라이머 세트)로 준비하세요. </li><li> Thermocycle PCR은 표 3에 제시된 조건을 사용합니다. </li><li> 시각화를위한 2 % 아가로 오스 겔에 PCR 제품의 5 μl를 실행합니다. </li><li> 성공 MeDIP에 대한 예상 결과는 표 4에 표시됩니다. </li></ol> 테이블 표 1 : H19 및 PCR 검증을 위해 CTRL primers. <table border="1"><tbody><tr><td> 프라이머 세트 </td><td> 앞으로 프리머 </td><td> 역방향 프리머 </td><td> 예상 제품 크기 </td></tr><tr><td> H19 </td><td> H19_F 5&#39; - cgagtgtgcgtgagtgtgag </td><td> H19_R 5&#39; - ggcgtaatggaatgcttgaa </td><td> 174 BP </td></tr><tr><td> CTRL (제어) </td><td> CTRL_F5&#39; - gagagcattagggcagacaaa </td><td> CTRL_R 5&#39; - gttcctcagacagccacattt </td><td> 139 BP </td></tr></tbody></table> 표 2. PCR 반응을위한 Mastermixes. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> H19 믹스 (사람마다 Rxn) </td><td> CTRL 믹스 (사람마다 Rxn) </td></tr><tr><tD&gt; ddH 2 O </td><td> 6.875 </td><td> 6.875 </td></tr><tr><td> 10X 버퍼 </td><td> 1.25 </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> dNTP 혼합 (10 MM 각) </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (50 ㎜) </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> Primers (H19_F / R 또는 CTRL_F / R) (10 μm의 각 F / R) </td><td> 0.625 </td><td> 0.625 </td></tr><tr><td> 플래티넘 DNA 형성 촉매 </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr></tbody></table> 표 3. PCR thermocyling 조건. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> 5시 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 40X </td><td> 95 ° C </td><td> 0시 반 </td></tr><tr><td> 56 ° C </td><td> 0시 반 </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 0시 15분 </td></tr></tbody></table> 표 4. 성공 MeDIP에 대한 PCR 결과를 예상. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2" align="center"> 템플릿 DNA </td></tr><tr><td> 프리머 사용되는 </td><td> IN </td><td> IP </td></tr><tr><td> H19 </td><td> 긍정적인 </td><td> 긍정적인 </td></tr><tr><td> CTRL </td><td> 긍정적인 </td><td> 부정 </td></tr></tbody></table>

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</ol>

질병에있는 중요한 역할의 DNA methylation의 재생의 성장 의식이있다,이 수정을 측정 assays의 따라서 개발은 13 초, 12 초, 3 점차 중요 해지고 있습니다. MeDIP 기술은 전체 게놈과 로커스 - 특정 레벨 6, 7 모두에서 검사를받을 수있는 도구입니다. 이 기술은 DNA를 시작하는 제한된 양의를 사용하여 DNA의 methylation 수준의 빠른 볼을 제공하며 서로 다른 소스 사이에서 쉽게 비교를 위해 수 있습니다. MeDIP 제품을 사용하는 다운 스트림 응용 프로그램은 전체 게놈 및 CPG 섬 oligonucleotide 배열, 관심 loci에 대한 직접적인 PCR의 assays뿐만 아니라, 시퀀싱 등 microarrays 다양한 있습니다. MeDIP는 methylated DNA와 6 unmethylated 구분하는 항체에 의존 DNA의 methylation 검출에 대한 독특한 접근 방식을 제...

<table><tbody><tr><td>Biorupter 초음파 파쇄기</td><td>도구</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200 TM</td><td></td></tr><tr><td>1.7ml SafeSeal 마이크로원심분리 튜브</td><td>기타</td><td>Sorenson BioScience</td><td>11510</td><td></td></tr><tr><td>ND 3300 분광광도계</td><td>도구</td><td>NanoDrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1차 항체: Anti-5&amp;rsquo;-methylcytosine mouse mAb</td><td>시약</td><td>Calbiochem</td><td>162 33 D3</td><td></td></tr><tr><td>2차 항체: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>112-01D</td><td></td></tr><tr><td>자성 튜브 랙</td><td>도구</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller</td><td>도구</td><td>Labnet International</td><td>H5500</td><td></td></tr><tr><td>IP 버퍼</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM NaPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. 실온 보관</td></tr><tr><td>분해 버퍼</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

methylated dna의 immunoprecipitation

Methylated DNA Immunoprecipitation

DNA의 methylation 패턴의 식별은 methylation은 유전자 발현에 큰 영향을 미칠 것으로 알려져으로 epigenetics의 연구에서 일반적인 절차이며, 정상적인 발달뿐만 아니라 질병에 관여<sup&gt; 1-4</sup&gt;. 그러므로, methylated DNA가 아닌 methylated DNA 구별하는 능력은 연구 methylation 프로파일을 생성하기 위해 필수적입니다. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP)는 관심의 샘플에서 methylated DNA의 추출을위한 효율적인 기술입니다<sup&gt; 5-7</sup&gt;. DNA의 짧은 200 NG의 예제는 항체 또는 immunoprecipitation (IP), 반응 충분합니다. DNA는 300-1000 BP의 크기에 이르기까지 조각으로 sonicated이며, immunoprecipitated (IP)과 입력 (IN) 부분으로 나뉘어져 있습니다. IP DNA는 이후 단클론 항체가 methylated DNA를 바인딩 수 있도록, 변성 그리고 안티 5&#39;mC와 incubated 열 수 있습니다. 이 후, 차 항체에 대한 친화력이있는 이차 항체를 포함하는 자성 비즈를 추가하고, incubated 있습니다. 이러한 비드 링크된 항체는 첫 번째 단계에서 사용하는 단클론 항체를 바인딩합니다. 항체 복합 (methylated DNA)에 바운드 DNA는 솔루션의 단지를 빼내 자석을 사용하여 DNA의 나머지 부분에서 분리됩니다. IP 버퍼를 사용하는 몇 가지 세척은 다음 언바운드 아닌 methylated DNA를 제거하기 위해 수행됩니다. methylated DNA / 항체 단지 그 다음은 methylated DNA가 그대로 둔 항체를 소화 Proteinase K와 소화하고 있습니다. 단백질 물질을 제거하는 클로로포름 추출 후 나중에 사용하기 위해 시켰던과 물에 resuspended : 농축 DNA는 페놀로 정화됩니다. PCR 기법은 IP의 증폭 제품을 분석하여하고 부족으로 알려진 methylated 시퀀스를 포함하는 것으로 알려진 지역에 대한 DNA에 MeDIP 절차의 효율성을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 정화 methylated DNA는 다음 로커스 특정 (PCR) 또는 게놈 전체 (microarray 및 시퀀싱) methylation 연구에 사용하고, 같은 유전자 발현 프로 파일링 및 배열 비교 게놈 하이브 리다이 제이션 등 다른 연구 도구와 함께 적용하면 (특히 유용합니다 수 있습니다 CGH)<sup&gt; 8</sup&gt;. DNA의 methylation에 추가 수사를 차례로, aberrantly methylated DNA의 특징과 같은 암 같은 질병에 대한 새로운 치료 또는 전조의 연구 도구를 개발에 유용할 수 있습니다 새로운 epigenetic 목표의 발견으로 이어질 것입니다<sup&gt; 2, 4, 9-11</sup&gt;.

이 동영상은 methylated DNA의 immunoprecipitation (MeDIP)에 대한 프로토콜을 보여줍니다. MeDIP가 선택 (안티 - 5 MC) 5 methylcytosine에 대한 특이성과 항체를 사용하여 게놈 DNA 샘플에서 methylated DNA 조각을 추출 두 하루 절차입니다.

Methylated DNA의 Immunoprecipitation

DNA 메틸화 패턴의 식별은 후성유전학 연구에서 일반적인 절차인데, 이는 메틸화가 ...에 상당한 영향을 미치는 것으로 알려져 있기 때문입니다.

이 영상에서는 메틸화된 DNA 면역침강법(methylated DNA immunoprecipitation) 또는 meetup 프로토콜을 설명합니다. 이는 편향되지 않은 방식으로 메틸화된 DNA를 특이적으로 분리하는 데 사용되는 방법입니다. 포유류의 DNA 메틸화는 시토신의 C5 위치에 메틸기가 추가되는 것이 특징입니다.CPG 디뉴클레오타이드에 존재할 때, 이는 정상적인 발달뿐만 아니라 여러 질병 과정에서 중요한 역할을 하는 가역적인 후성유전학적 표지가 됩니다. DNA 메틸화의 정상적인 기능에는 여성의 X 염색체 불활성화, 반복 서열의 소멸, 게놈 각인 및 게놈 안정성 유지가 포함됩니다. 또한 DNA 메틸화는 암, 드윌리 증후군, 엔겔만 증후군, 면역결핍 중심절 불안정성 및 안면 기형 증후군과 같은 수많은 질병에서 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다.예를 들어, 암에서는 비정상적인 과메틸화와 프로모터로 인해 필수적인 종양 억제 유전자의 발현이 억제될 수 있습니다. 부적절한 저메틸화는 염색체 불안정성과 온코진 활성화를 초래하며, 분석은 먼저 DNA를 300에서 1000 base pairs 크기의 조각으로 초음파 분쇄하여 수행합니다. 그 후 초음파 분쇄된 DNA를 95 °C에서 변성시킵니다.5-메틸사이토신을 인식하는 1차 항체를 첨가하여 메틸화된 DNA 단편에 결합하도록 합니다. 마그네틱 다이나비드(magnetic dyna beads)가 접합된 2차 항체를 사용하여 1차 항체가 결합한 DNA 단편을 분리합니다. 메틸화되지 않은 단편은 제거하고, 항체는 단백질 분해 효소(proteinase)로 소화시킵니다.KA 페닐 클로로폼 정제 과정을 통해 소화된 단백질을 제거하고, 침전을 통해 DNA를 정제하면 메틸화된 단편이 농축됩니다. 정제된 DNA는 PCR 마이크로어레이 및 시퀀싱과 같은 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 정제 과정은 일반적으로 2일에 걸쳐 수행됩니다.첫째 날에는 DNA 준비, 초음파 처리 면역침전 및 단백질 소화 단계가 진행됩니다. 둘째 날에는 메틸화가 농축된 DNA를 정제하고 분리하기 위해 pH 클로로포름 추출과 에탄올 침전 단계를 수행합니다. 실리콘 처리된 원심분리 튜브, DNA 초음파 처리 장치, 1차 항체(anti 5-methylcytosine mouse monoclonal antibody), 2차 항체(sheep anti-mouse IgG가 접합된 Dynabeads), 그리고 자석 튜브 랙을 포함하여 준비가 필요한 몇 가지 특수 재료가 있습니다.Meetup 프로토콜의 첫 번째 단계는 DNA 준비입니다. 사전에 DNA의 성질을 평가하는 것이 필수적입니다. 샘플의 정확한 정량이 매우 중요하며, 원치 않는 DNA 종의 존재로 인해 DNA 양을 결정하는 다양한 방법들이 부정적인 영향을 받을 수 있으므로, 샘플 DNA가 주로 이중 가닥인지 또는 단일 가닥인지 그 상태를 파악해야 합니다.이중 가닥 DNA 양은 NanoDrop 3,000을 이용한 분광 광도법으로 쉽게 측정할 수 있습니다. 1.5 µL를 로딩하고 측정 유형을 핵산으로 설정한 후, 계산 방식을 DNA 50으로 선택하고 1.5 µL의 물로 기기를 초기화합니다. 페데스탈을 세척하고 1.5 µL의 액체로 기기의 바탕값을 측정합니다. 샘플이 용해되면 페데스탈을 세척하고 샘플 1.5 µL를 로딩한 후 측정 버튼을 누릅니다.농도가 제공되며 이를 사용할 수 있습니다. 필요한 마이크로리터 수를 계산하려면, 여기서는 1.8의 A260 대 A280 비율이 이상적입니다. 1 µg 샘플을 준비합니다.하지만 200 nanograms 정도의 적은 양의 샘플로도 성공적인 결과를 얻기에 충분합니다. 준비 단계로, 깨끗한 실리콘 처리 튜브에 DNA 샘플을 넣으십시오. 최종 부피가 50 microliters가 되도록 멸균수를 충분히 첨가하십시오.DNA와 단백질이 튜브 벽에 비특이적으로 결합하는 것을 방지하기 위해 DNA 소니케이션 및 면역침강은 반드시 실리콘 코팅된 튜브에서 수행해야 합니다. DNA 준비가 완료되면 샘플을 소니케이션해야 합니다. 면역침강은 DNA 단편의 크기가 작을수록 더 효율적이므로 소니케이션을 통해 DNA를 단편화해야 합니다. 샘플을 소니케이터에 넣고 전원 설정이 'high'로 되어 있는지, 기기 설정이 30초 작동, 30초 휴지로 설정되어 있는지 확인하십시오. 하단 수조의 표시선까지 4 °C의 물을 채우십시오.샘플을 7분 동안 초음파 처리하십시오. 초음파 처리가 완료되면 튜브를 꺼내 얼음에 박으십시오. 예상되는 샘플의 DNA 크기에 맞추어 초음파 처리 조건을 사전에 최적화하는 것이 중요합니다.예를 들어, 부분적으로 분해된 DNA 샘플의 경우 초음파 처리 시간을 더 짧게 설정해야 합니다. 초음파 처리 결과물은 표준 전기영동 기법으로 시각화할 수 있습니다. 이후 단계에서 사용하기 위해, 이 시점에서는 길이가 300에서 1000 base pairs 범위인 DNA 단편이 필요합니다.마이크로어레이 및 PCR 분석에서는 DNA의 5분의 1을 투입 DNA 또는 대조 DNA로 남겨두어야 하며, 이 경우 초음파 처리된 DNA 800 nanograms를 면역침전물에 사용하고 나머지는 대조 DNA로 따로 보관합니다. 미디어 프로토콜의 다음 단계는 면역침전 또는 IP 반응으로, 1차 항체를 첨가하기 전에 DNA를 변성시켜야 합니다. 1차 항체는 단일 가닥 DNA에 민감하기 때문에 변성 과정이 필요합니다.샘플을 95 °C의 항온수조에 10분 동안 둡니다. 변성 단계가 완료되면 즉시 튜브를 얼음에 옮겨 최소 5분 동안 유지합니다. 이렇게 하면 변성된 DNA의 재결합을 방지하여 샘플이 냉각되었을 때 항체가 최적으로 결합할 수 있게 됩니다.튜브를 짧게 원심 분리하여 내용물을 바닥으로 모읍니다. 다음으로, 1차 항체를 첨가합니다. 사용되는 항체의 양은 각 배치 및 제조사별로 적정(titration)하여 결정해야 합니다.이 사례에서는 5 µg의 1차 항체를 첨가한 후, 면역침강 완충액(immunoprecipitation buffer 또는 IP buffer)을 넣어 최종 부피를 500 µL로 맞춥니다. 다음으로, IP DNA를 로테이터(rotator)에 넣고 4 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 중 튜브 내에서 항체가 뭉치는 것을 방지하기 위해 회전이 필요합니다.1차 항체 반응이 완료되기 약 15분 전에 마그네틱 다이나 비드(magnetic dyna beads)를 세척하고 준비합니다. 먼저, 보텍싱(vortexing)을 통해 바이알 내의 비드를 완전히 재현탁합니다. 그다음, 비드 30 µL를 깨끗한 실리콘 처리 튜브에 옮기고, 해당 튜브를 다중 반응용 마그네틱 랙에 놓습니다.반응당 30 microliters의 비드를 분주하되, 피펫팅 오차나 비드의 의도치 않은 손실을 고려하여 1회분 추가량을 준비하십시오. 예를 들어, 8회 반응의 경우 9회분에 해당하는 비드 또는 270 microliters를 취하십시오.마그네틱 비드는 마그네틱 랙의 벽면 쪽으로 끌려가게 됩니다. 비드가 이동하여 튜브 벽면에 일정한 선 형태로 가라앉을 때까지 2분 동안 기다립니다. 다음으로, 피펫 팁으로 뒷벽의 비드를 건드리지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 제거하여 버립니다.상층액을 과량의 IP buffer로 교체한 후 vortexing하고, 다시 자성 랙에 2분 동안 둡니다. 이 세척 과정을 한 번 더 반복하고, 세척된 비드를 원래 부피의 IP buffer에 재현탁합니다. 배양이 끝나면 Rotator에서 샘플 튜브를 꺼냅니다.면역침전법을 완료하려면, 30 µL의 깨끗한 비드를 반응액에 첨가하고 튜브를 다시 회전 장치에 넣어 4 °C에서 2시간 동안 반응시킵니다. 이 배양 과정 동안 anti-mouse IgG인 2차 항체가 1차 마우스 항체에 결합합니다. anti-mouse 항체는 마그네틱 DynaBeads에 접합되어 있어, 결합된 생성물을 쉽게 회수하고 이어지는 정제 단계를 수행할 수 있습니다.두 항체 모두를 이용한 배양이 완료되면, IP 튜브를 마그네틱 랙에 2분 동안 둡니다. 이 시점에서 메틸화된 DNA는 1차 항체에 결합되어 있으며, 1차 항체는 다시 dyna bead가 결합된 2차 항체와 결합된 상태가 됩니다. 상층액을 제거하여 버리고 500 µL의 IP 버퍼로 교체합니다.튜브의 내용물을 혼합하고 랙에 다시 2분 동안 둡니다. 이 세척 과정을 IP 버퍼로 한 번 더 반복합니다. 마지막 세척 후 상층액을 제거하고, 비드를 최종적으로 현탁합니다.400 µL의 소화 완충액(digestion Buffer)에 100 µg의 proteinase K를 넣어 반응시키고 50 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. proteinase K 처리는 항체 단백질과 DNA에 결합된 잔류 단백질을 소화하여 메틸화된 DNA가 용액 속으로 방출되도록 하는 데 필요합니다. DNA 정제는 실험 절차의 둘째 날에 수행하며, 배양기에서 소화된 튜브를 꺼냅니다.흄 후드 내에서 pH 7의 1:1 페놀-클로로포름 500 µL를 튜브에 넣고 충분히 볼텍싱합니다. 튜브를 13,000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 계면을 흐트러뜨리거나 유기층을 제거하지 않도록 주의하며 튜브 상층의 수층을 조심스럽게 제거합니다. 제거한 수층을 새 튜브로 옮깁니다.계면이 흐릿하게 보일 경우 2차 추출을 수행할 수 있습니다. 다음으로, 3 M sodium acetate를 전체 부피의 10분의 1만큼, 이 경우에는 40 µL 첨가합니다. 펠렛 회수 효율을 높이기 위한 운반체로 1 µL의 glycogen을 사용할 수 있습니다.튜브를 볼텍싱하여 내용물을 혼합합니다. 그런 다음 100% ethanol을 2배 부피로 첨가하고, 볼텍싱한 후 -20 °C 냉동고에서 20분 동안 냉동합니다. 냉동 후, 침전된 DNA를 13,000 G, 4 °C 조건의 원심분리기로 20분 동안 원심분리하여 가라앉힙니다.튜브 바닥에 DNA 펠릿이 형성됩니다. 원심분리기에서 튜브를 꺼내 에탄올을 제거하십시오. 이때 튜브 바닥의 펠릿이 손상되지 않도록 주의하십시오.잔류 에탄올을 제거하기 위해 펄스 스핀(pulse spin)이 필요할 수 있습니다. 펠릿을 세척하려면 차가운 70% ethanol 500 microliters를 첨가하여 볼텍싱(vortex)하고, 4°C에서 13,000 G로 20분 동안 다시 원심분리하십시오. 두 번째 원심분리가 완료되면 70% ethanol 펄스 스핀을 수행하고 파이펫으로 잔류 에탄올을 제거하십시오.펠렛을 건조시키고 남아있는 에탄올을 증발시키기 위해 튜브 캡을 연 상태로 랙에 둡니다. 마지막으로, 메틸화가 농축된 DNA만 포함된 펠렛에 10 µL의 멸균수를 넣어 재현탁하며, 사용 전 DNA 펠렛이 충분히 용해될 수 있도록 시간을 둡니다. PCR을 통해 회수 효율을 검증하는 것이 권장됩니다.이는 정상 인간 DNA 프라이머를 사용하여 메틸화된 DNA 단편과 비메틸화된 DNA 단편을 차등적으로 보여주는 생성물을 증폭하도록 설계된 PCR 반응을 수행함으로써 가능합니다. H 19 각인 조절 영역은 메틸화되지 않은 게놈 영역을 증폭하도록 설계된 프라이머와 함께 사용할 수 있습니다. 예시 프라이머 서열 및 PCR 사이클 조건은 첨부된 프로토콜에서 확인할 수 있습니다.이 시점에서, 미팅 프로토콜(meetup protocol) 시작 시 따로 보관해 두었던 입력 DNA 또는 대조 DNA를 회수해야 합니다. 한 세트의 PCR 반응은 입력 DNA를 사용하여 설정하고, 다른 세트는 메틸화가 농축된 IP DNA를 사용하여 설정합니다. 미팅이 성공적이었다면, IP PCR은 메틸화 프라이머를 사용했을 때만 산물을 생성하고 대조 프라이머를 사용했을 때는 산물을 생성하지 않을 것입니다.반대로, 입력 PCR은 메틸화된 DNA 단편과 비메틸화된 DNA 단편을 모두 포함하고 있으므로 두 프라이머를 모두 사용하여 생성물을 만들어내야 합니다. 메틸화된 단편이 농축된 DNA는 PCR 시퀀싱 및 마이크로어레이 분석과 같은 다양한 다운스트림 응용 분야에 사용될 수 있습니다.다른 분자 생물학적 기법과 통합하여 사용하면, 메틸화 프로파일링 또는 후성유전학 연구를 위해 특정 유전자좌 또는 게놈 전체 범위에서 DNA의 메틸화 상태를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

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Methylated DNA의 Immunoprecipitation

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