Name: 면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 학습하세요 지지 평면 이중층을 이용한 면역 시냅스 형성 연구 방법을 배우세요. TIRF 현미경을 활용한 세포 접착 단백질 고정 및 시냅스 역학 시각화 기술을 익혀 면역학 연구에 활용하세요.

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1. lipids 준비 <ol><li> 이중층의 상단에 전단지에 단백질을 연결하기 위해, 우리는 니켈 2를 사용 + 폴리 - 히스티딘 태그로 재조합 단백질을 고정 chelating의 lipids. 특정 세포 유형 니켈 2 + - 코팅 bilayers 이외의 특별히 준수지만, T - 세포는 일반적으로 T 세포 활성화를 공부하고이 방법이 최적 만들고하지 않습니다. </li><li> 지질 이중층 솔루션은 20% 니켈 2 솔루션을 준비하여 만든 + chelating의 지질 및 클로로포름 - 메탄올 1-2 ML있는 유리관에서 해당 금액의 80 % phosphatidylcholine. <ol><li> 따뜻한 (30-37 ° C) 물을 욕조에서 질소 가스 스트림에서 용매를 증발. 이것은 일반적으로 십오분 주위에 걸립니다. </li><li> 90 분간 lyophilizer을 사용하여 고진공 하에서 남아있는 용매를 제거합니다. </li></ol></li><li> 2퍼센트 혼합 세제 / 인지질 micelles의 솔루션을 만듭니다 트리스 - 생리 버퍼에 N - octyl - glucoside 세제에 lipids를 해산. 최종 인지질의 농도는 0.4 MM해야합니다. liposomes을 형성하기 위해 세제 및 양식 liposomes를 제​​거하는 트리스 - 살린 3 변경 사항에 대해이 솔루션을 dialyze. 우리는 보통 10 KDA이 떨어져 상처와 6mm 직경 스펙트럼 / 포어 # 2 튜브 1 개 ML의 순서에 볼륨과 함께 작동합니다. 우리는 튜브를 클램핑 때 어떤 공기 방울의를 제외주의합니다. 우리는 일반적으로 무균 필터이 솔루션 70 %의 에탄올 소독 장갑을 사용하여 처리하고 깨끗한 조건에서 투석을. </li><li> 이 솔루션은 수정 같이 맑은해야합니다. 그것은 산화를 방지하기 위해 아르곤 가스를 아래에 저장됩니다. 솔루션 흐린있다면, 다중 벽으로 둘러싸인 vesicles가 생성되었습니다, 당신은 다시 시작해야합니다. </li></ol> 2. ICAM - 1 및 MHC가 평면 이중층에 예금 얼마나 많은 결정 <ol><li> 실험을 설정하기 위해서는 ICAM - 1 및 MHC는 수용성 단백질의 특정 농도에 + chelating 이중층 니켈 2 주어진 표면 영역에 입금이 어느 정도 결정 먼저 필요합니다. 이렇게하려면, 예금 bilayers 5 마이크로 미터 직경의 유리 비즈에서 조건 하에서 단백질 솔루션 유리 비즈를 품어 그 대략적인 이미징에 사용되는 흐름 세포에 해당하고, 흐름 immunofluorometric 분석에 의해 바운드 단백질의 밀도를 읽어보십시오. </li><li> 플루오레신 당 분자 알려진 숫자 FITC - 표시된 항체는 표면 바운드 단백질을 감지하는 데 사용됩니다. 플루오레신 표준 구슬은 흐름 microfluorimeter을 교정하는 데 사용됩니다. </li><li> 우리는 조건을 확립 것을 대략 이들에 대한 항원 제시 ICAM - 1 200 molecules/μm2 및 I - EK - MCC91 - 103 복합 0.2-20 molecules/μm2와 세포. </li></ol> 3. 평면 bilayers 형성을위한 유리 커버 전표 청소 <ol><li> 평면 bilayers은 liposomes 유리에 퓨즈 때 저절로 형성하지만 유리가 깨끗한지 경우에만. </li><li> 피라 냐가 작업 때, 우리는 산성 앞치마와 무거운, 산성 모성 장갑을 포함한 전체 보호복을 착용하십시오. 조심스럽게 유기 폐기물에서 폐기물을 분리하고 적절하게 처리. </li><li> 산성 피라 냐가 솔루션을 준비하려면, 마른 비커에 농축 황산의 75 ML을 추가하고, 신중하게 30 % 과산화수소 25 ML를 추가합니다. 이 솔루션은 빠른 속도로 이상 100까지 가열 ° C. </li><li> 15 분 용액의 건조 coverslips 젖어. 솔루션에서 제거하고 양쪽에 잠시 물을 정화에 린스. 정화 물을 배수하기 위해 진공 소스를 사용하여 coverslips 건조. 피라 냐가 솔루션 괜찮아, 잘 퓸 후드에 표시된 캡 느슨한와 남아있는 피라 냐가 폐기물 컨테이너에 추가할 수있게 해줍니다. liposomes, coverslips, 그리고 단백질의 모든 준비가되면 면역 버렸네가 형성 될 준비가 된 것입니다. </li></ol> 4. bilayers을 형성 <ol><li> bilayers을 형성하기 위해 우리 실험실 통합 난방의 장점을 가지고 Bioptechs FCSII 회의소를 사용합니다. FCSII 시스템은 스테인레스 스틸베이스입니다 함께 클램프 반대편에 유체 홈과 0.5 mm 최고 가스켓 하나의 표면에 가열을위한 인듐 주석 산화물 코팅 microaqueduct 슬라이드와 microfluidic 매니폴드, 먼지없는 0.25 mm 흐름 챔버와 피라 냐가의 높이를 정의 가스켓은 이중층이 형성되는 40mm의 원형 coverslip 청소. </li><li> 이중층이 형성되는시 커버 슬립이 높은 친수성과 청소해야 할 동안 더 소수성의 경우, microacqueduct 슬라이드 실제로 잘 작동합니다. microaqueduct보다 소수성이 다음 깨끗한 물로 세척하고 완전히이 컨디셔닝 과정 후에 건조뿐만 사용 사이로 실온에서 60 분 1 % HSA로 치료에 의해 이루어집니다 만들기. 이 절차에 의해 왼쪽 변성 단백질의 코팅 리포좀 현탁액 1 μl는 원형, hemispherica를 형성하실 수 있습니다&gt; 0.25 mm 높은 내 놓습니다. </li><li> 평평한 표면 위에, 위쪽 감독 튜브, 흐름 세포 및 양식 평면 bilayers 조립 매니폴드를 배치합니다. 그런 다음 0을 넣으십시오. 그것이 평면 앉아 있는지 확인하고, 유체 튜브를 통해 위치에 구멍 5mm 개스킷. 부드럽게까지 직면하고있는 유체 채널과 개스킷에 microaqueduct 측면을 배치하고 슬라이드에 구멍이 microfluidic 튜브 정렬 것을 확인하기 전까지는 모든 하향 압력을 적용하지 않고 평면 좌석 있는지 확인하십시오. 채널은 유체 채널로 줄지어 않으며 주요 공기 공간이 없습니다되도록 microaqueduct 슬라이드의 위에 밖으로 직사각형 절단과 먼지없는 0.25 mm 개스 라이. </li><li> 각 드롭 사이의 중심 - 투 - 중심 거리 2.5 mm는 그러한 패턴에 microaqueduct 슬라이드의 표면에 5 리포좀 정지 X 1 μl 방울을 넣으십시오. 5 리포좀 방울 다른 작곡있을 수 있지만,이 경우 우리는 두 bilayers, 아니 니켈이 하나의 + + chelating의 lipids와 10 % 니켈 2 + + chelating lipids의 한.을 형성합니다 </li><li> 이 방울이 자리에되면, 신중하게 커버 한 움직임의 표면에 아래로 살짝 놓습니다. 가능한 한 빨리 기지로 클램프. 리포좀 방울 커버 슬립과 접촉을해야합니다. bilayers가 이미 형성 이후이 연락처는 부러진해서는 안됩니다, 모든 장애는 결함이 bilayers가 발생할 수 있습니다. </li><li> 현미경에 coverslip의 위치를​​ 돕기 위해 microacqueduct 슬라이드에 몇 가지 작은 잉크의 명소로 bilayers의 위치를​​ 표시하기 위해 기억하는 것이 중요합니다. 시스템이 equilibrated이 있는지 확인하기 위해 20 분이 걸립니다. 20 유연한 튜브의 cm와 3 방향 꼭지에 연결된 20 ML의 주사기를 사용하여 모든 솔루션을 전송합니다. 꼭지와 흐름 세포 사이의 죽은 볼륨을 최소화하기 위해 튜브의 짧은 길이에 의해 흐름 세포에 꼭지의 다른 포트를 연결합니다. 이 MM MgCl 2, 1 MM CaCl 2, 5 MM 포도당, 1 % 인간의 혈청 알부민을 포함한 생리 HEPES - 버퍼와 주사기를 채우십시오. </li><li> 기포가가되지 않도록 프라임 관 그리고 꼭지. 흐름 세포에 이것을 연결하고 공기 방울이 이중층을 통해 전달하지 않도록 보면서 한 동작에 5 ML 통해 밀어. 지금, 당신은 bilayers을 것입니다. </li></ol> 작성자 :이 동영상이 문서는 &quot;Amoeboid 로코의 테마 유사 면역 시냅스와 Kinapses 채취와 위로 헌터&quot;을 지원 <a href="http://arjournals.annualreviews.org/action/doSearch?action=runSearch&amp;type=advanced&amp;result=true&amp;prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Dustin%2C+Michael+L.%29" target="_blank">마이클 L. 더스틴</a> , <a href="http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.cellbio.24.110707.175226">세포 및 발달 생물학의 연례 검토</a> , 볼륨 24, 2008.

면역 시냅스와 kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 bilayers

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

지원되는 평면 bilayers는 면역 버렸네에서 분자 상호 작용을 모델로 사용할 수있는 강력한 도구입니다. lymphocytes와 항원 제시 세포 간의 상호 작용을 모방하기 위해, 우리는 폴리 - 히스티딘 태그 이중층의 위쪽 전단지에 재조합 세포 접착 및 MHC 단백질을 앵커로 Ni2 + - chelating의 lipids를 사용합니다. 평면 bilayers은 지방질을 준비 이중층이 형성 유리 표면을 처리하고, 다음 lymphocytes가 추가됩니다 흐름 세포를 포함하는 전문 챔버의 이중층을 형성하여 생성됩니다. 그런 다음, bilayers은 니켈과 그의 - 태그 재조합 단백질로 청구됩니다이 추가됩니다. 마지막으로, lymphocytes은 흐름 세포와 TIRF 현미경으로 주사는 이미지 버렸네 형성과 구조하는 데 사용할 수있는 제어하는​​ T 세포의 운동, 수용체 정렬의 사이트 및 수용체 저하의 사이트.

지원되는 평면 bilayers는 면역 버렸네에서 분자 상호 작용을 모델로 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 지질 bilyer의 위쪽 전단지에 버렸네 형성을 조절하고 TIRF 현미경을 사용하여 버렸네 형성을 시각화하는 것으로 알려진 세포 부착 단백질을 고정하는 방법을 보여줍니다.

면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers

지지 평면 이중층(Supported planar bilayers)은 면역 시냅스의 분자 상호작용을 모델링하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. 상호작용을 모방하기 위해...

안녕하세요, Geral Institute와 뉴욕 대학교 의과대학의 Mike Dustin입니다. 오늘은 면역 시냅스 연구를 위한 지지 평면 바이오레이어(planar Biolayer) 형성 절차를 안내해 드리겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.지질 이중층을 제조하기 위해, 유리 튜브에 1~2 mL의 클로로포름 메탄올을 넣고 20% 니켈 킬레이트 지질과 80% 포스파티딜콜린 용액을 적절한 양으로 준비합니다. 첫 번째 단계는 30~37 °C의 따뜻한 수조에서 질소 가스 기류 하에 용매를 증발시키는 것입니다. 이 과정은 보통 약 15분 정도 소요됩니다.그 후 동결건조기를 사용하여 90분 동안 고진공 상태에서 남은 용매를 모두 제거합니다. 다음으로, 0.4 mM의 최종 농도가 되도록 2% N-octyl-β-D-glucoside 세제가 포함된 식염 버퍼에 지질을 녹입니다. 이를 통해 리포좀을 형성하기 위한 세제-인지질 혼합 미셀 용액이 만들어집니다.계면활성제를 제거하고 리포좀을 형성하기 위해, 이 용액을 Tris saline으로 세 차례 교체하며 투석합니다. 일반적으로 컷오프가 약 10 kilodaltons인 직경 6 millimeter 튜브를 사용하여 1 milliliter 정도의 부피로 진행하며, 튜브를 클램핑할 때 공기 방울이 들어가지 않도록 주의합니다. 이 용액을 멸균 여과한 후 청결한 조건에서 투석을 수행하며, 70% ethanol로 멸균한 장갑을 사용하여 취급합니다.이 용액은 투명해야 하며 산화를 방지하기 위해 아르곤 가스 하에 보관합니다. 용액이 탁하다면 다중층 소포가 생성된 것이므로 처음부터 다시 시작해야 합니다. 실험을 설정하기 위해서는 먼저 수용성 단백질의 특정 농도에서 니켈 킬레이트 이중층의 주어진 표면적에 ICAM-1과 MHC가 얼마나 증착되는지 결정해야 합니다.이를 위해, 직경 5 µm의 유리 비드 위에 이중층을 증착합니다. 이미징에 사용되는 유동 셀과 유사한 조건에서 유리 비드를 단백질 용액과 함께 배양한 후, 유동 면역 형광 분석법을 통해 결합된 단백질의 밀도를 측정합니다. 분자당 플루오레세인 수가 알려진 FSI 표지 항체를 사용하여 표면 결합 단백질을 검출하며, 플루오레세인 표준 비드를 사용하여 유동 마이크로 형광 분석기를 보정합니다.우리는 μm²당 200개의 ICAM-1 분자와 μm²당 0.2~20개의 I-E-K-M-C-C 91 1 0 3 분자가 존재하는 항원 제시 세포와 유사한 조건을 구축할 것입

supported-planar-bilayers-for-formation-study-immunological-synapses

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경에 의한 유리를 지원 평면 bilayers에서 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성을 시각화하는 방법을 설명합니다. 메소드는 또한 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성시 발생하는 신호 전달 분자의 활성화 및 재배포를 탐지하기 immunofluorescence 염색법과 결합 할 수 있습니다.

의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

이 비디오는 지원되는 지질 이중층(SLB)에서 자연살해(NK) 세포의 면역학적 시냅스 형성을 시각화하는 기술을 보여줍니다. SLB는 먼저 형광단 표지된 NK 세포 활성화 수용체 리간드로 표지된 다음 NK 세포로 배양합니다. 그 후, 세포는 중합된 액틴 및 퍼포린 양성 용해 과립을 위해 염색됩니다. 이 접근 방식을 사용하면 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경을 사용하여 시냅스 형성을 시각화할 수 있습니다.

지원되는 지질 이중층에서 NK 세포 면역학적 시냅스 형성의 초고해상도 이미징

이 비디오는 일차 인간 T 세포와 지지된 지질 이중층(SLB) 사이의 면역 시냅스 형성을 연구하는 시험관 내 기술을 보여줍니다. T 세포 표면 단백질은 SLB에 고정된 각 리간드와 상호 작용하여 면역 시냅스를 형성한 다음, lytic granule이 시냅스를 향해 이동하며, 이는 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

지원되는 평면 지질 이중층과의 T 세포 상호 작용을 연구하기 위한 In Vitro 기술

이 비디오는 T 림프구와 형광 항원을 운반하는 상피 세포 간의 상호 작용을 조사하여 면역학적 시냅스 토폴로지의 라이브 셀 이미징을 보여줍니다. 형광 현미경 검사는 내피 세포에서 적색 세포질 변위와 노란색 막 고리를 보여주어 면역학적 시냅스의 형성을 나타냅니다.

Live-Cell Imaging을 통한 면역학적 Synapse 토폴로지 평가

여기에서는 면역학적 시냅스를 형성하는 유리 지지 지질 이중층 기술과 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경의 초고해상도 이미징 기술의 조합을 설명합니다. 이 프로토콜의 목표는 이러한 두 가지 기술을 성공적으로 수행하는 데 필요한 지침을 사용자에게 제공하는 것입니다.

유리 - 지원 평면 지질 이중층에 자연 살해 세포 면역 시냅스의 슈퍼 해상도 이미징

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

적응 면역은 T 세포와 항원 제시 세포 사이에 형성된 역동적인 '면역학적 시냅스'에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜은 연구가 부족한 생리학적 APC이자 새로운 유형의 '평면 세포 APC 모델'로서 내피 세포를 조사하는 방법을 설명합니다.

이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

여기서 우리는 IS의 형성 동안 B 림프구에서 세포 편광 사건을 특성화하는 두 가지 접근법을 기술한다. 첫 번째, 세포 기관 모집 및 시 냅 스 막에서 세포 골격 재배열의 정량화 포함. 두 번째는 면역 시냅스에 대한 편광을 겪는 중심도의 조성의 변화를 특성화하는 생화학적 접근법입니다.

면역 시 냅 스 형성 하는 동안 B 세포에서 세포 역학 공부

이러한 프로토콜은 면역학적 시냅스 형성및 면역학적 시냅스를 향한 후속 편광 분비 트래픽을 모두 이미지화한다. 세포 접합체는 초항원 펄스 라지 세포 (항원 제시 세포역할을 함)와 Jurkat 클론 (이펙터 도우미 T 림프구로 작용)사이에 형성되었습니다.

인간 면역학적 시냅스 이미징

여기에서 우리는 비드 지원 지질 Bilayers를 사용하여 합성 항원 제시 세포의 단계별 재구성을 위한 프로토콜을 제시하고 활성화된 T 세포에서 시냅스 출력을 심문하는 그들의 사용.

T 세포 면역 시냅스의 미립자 출력을 연구하기 위해 비드 지원 지질 이중층의 준비

그라마시딘 A-도핑된 액상 계면 이중층을 조립, 전기자극, 분석하는 실험 프로토콜이 제시됩니다. 지질-단백질 구조-기능 관계는 막 면적, 이온 플럭스, 단일 채널 전도도 변화를 측정하고, 이러한 반응을 전기 시냅스에서 영감을 받은 막 모델에서 이온 전도의 가소성 유사 변화와 연관하여 정량화합니다.

액상 인터페이스 이중층을 이용한 지질-단백질 막 구조-기능 특성 분석

학습하세요 지지 평면 이중층을 이용한 면역 시냅스 형성 연구 방법을 배우세요. TIRF 현미경을 활용한 세포 접착 단백질 고정 및 시냅스 역학 시각화 기술을 익혀 면역학 연구에 활용하세요.

면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers

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