면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers

안녕하세요, Geral Institute와 뉴욕 대학교 의과대학의 Mike Dustin입니다. 오늘은 면역 시냅스 연구를 위한 지지 평면 바이오레이어(planar Biolayer) 형성 절차를 안내해 드리겠습니다. 그럼 시작하겠습니다.

지질 이중층을 제조하기 위해, 유리 튜브에 1~2 mL의 클로로포름 메탄올을 넣고 20% 니켈 킬레이트 지질과 80% 포스파티딜콜린 용액을 적절한 양으로 준비합니다. 첫 번째 단계는 30~37 °C의 따뜻한 수조에서 질소 가스 기류 하에 용매를 증발시키는 것입니다. 이 과정은 보통 약 15분 정도 소요됩니다.

그 후 동결건조기를 사용하여 90분 동안 고진공 상태에서 남은 용매를 모두 제거합니다. 다음으로, 0.4 mM의 최종 농도가 되도록 2% N-octyl-β-D-glucoside 세제가 포함된 식염 버퍼에 지질을 녹입니다. 이를 통해 리포좀을 형성하기 위한 세제-인지질 혼합 미셀 용액이 만들어집니다.

계면활성제를 제거하고 리포좀을 형성하기 위해, 이 용액을 Tris saline으로 세 차례 교체하며 투석합니다. 일반적으로 컷오프가 약 10 kilodaltons인 직경 6 millimeter 튜브를 사용하여 1 milliliter 정도의 부피로 진행하며, 튜브를 클램핑할 때 공기 방울이 들어가지 않도록 주의합니다. 이 용액을 멸균 여과한 후 청결한 조건에서 투석을 수행하며, 70% ethanol로 멸균한 장갑을 사용하여 취급합니다.

이 용액은 투명해야 하며 산화를 방지하기 위해 아르곤 가스 하에 보관합니다. 용액이 탁하다면 다중층 소포가 생성된 것이므로 처음부터 다시 시작해야 합니다. 실험을 설정하기 위해서는 먼저 수용성 단백질의 특정 농도에서 니켈 킬레이트 이중층의 주어진 표면적에 ICAM-1과 MHC가 얼마나 증착되는지 결정해야 합니다.

이를 위해, 직경 5 µm의 유리 비드 위에 이중층을 증착합니다. 이미징에 사용되는 유동 셀과 유사한 조건에서 유리 비드를 단백질 용액과 함께 배양한 후, 유동 면역 형광 분석법을 통해 결합된 단백질의 밀도를 측정합니다. 분자당 플루오레세인 수가 알려진 FSI 표지 항체를 사용하여 표면 결합 단백질을 검출하며, 플루오레세인 표준 비드를 사용하여 유동 마이크로 형광 분석기를 보정합니다.

우리는 μm²당 200개의 ICAM-1 분자와 μm²당 0.2~20개의 I-E-K-M-C-C 91 1 0 3 분자가 존재하는 항원 제시 세포와 유사한 조건을 구축할 것입니다. 리포좀이 유리에 융합될 때 평면 이중층이 자발적으로 형성되지만, 이는 유리가 적절하게 세척된 경우에만 가능합니다. 우리는 모든 유기물을 제거하고 유리 표면을 매우 친수성으로 만드는 황산과 30% 과산화수소의 신선하게 조제된 혼합물인 piranha 용액을 사용합니다.

피라냐 용액을 다룰 때는 산 전용 앞치마와 두꺼운 내산성 장갑을 포함한 전체 보호복을 착용합니다. 폐액은 유기 폐기물과 주의 깊게 분리하여 적절하게 처리해야 합니다. 피라냐 산 용액을 준비하려면, 건조한 비커에 진한 황산 75 milliliters를 넣은 다음 30% 과산화수소 25 milliliters를 조심스럽게 첨가하십시오.

용액이 100 °C 이상으로 빠르게 가열되면, 건조된 커버슬립을 용액에 15분 동안 담급니다. 피라냐 용액에서의 배양 후, 커버슬립을 정제수에 담근 다음 양면을 각각 1분 동안 헹굽니다. 그 후 진공 장치를 사용하여 정제수를 제거하고 커버슬립을 건조합니다.

피라냐 용액을 식힌 후, 흄 후드 내에 뚜껑을 느슨하게 닫은 상태로 명확하게 표시해 둔 피라냐 폐액 컨테이너에 넣으십시오. 이중층을 형성하기 위해 우리 실험실에서는 통합 가열 기능의 장점이 있는 bi FCS two 챔버를 사용합니다. FCS two 시스템은 스테인리스강 베이스 위에 있으며, 이는 0.5 millimeter 상단 가스켓이 있는 미세유체 매니폴드와, 한쪽 표면은 가열을 위해 인듐 주석 산화물이 코팅되어 있고 다른 쪽에는 유체 홈이 있는 마이크로 아쿠덕트 슬라이드를 함께 고정하는 구조입니다.

유동 챔버의 높이를 결정하는 먼지가 없는 0.25 millimeter 가스켓과 이중층이 형성될 피라냐 세척된 40 millimeter 원형 커버슬립을 사용하여 유동 셀을 조립하고 평면 이중층을 형성합니다. 튜브가 위를 향하도록 매니폴드를 평평한 표면에 놓습니다. 그런 다음 구멍이 유체 튜브 위에 오도록 0.5 millimeter 가스켓을 배치하고 평평하게 안착되었는지 확인합니다.

유체 채널이 위를 향하도록 마이크로 수로 슬라이드를 조심스럽게 놓으며, 슬라이드의 구멍이 미세유체 튜브와 일치하는지 확인될 때까지 아래로 압력을 가하지 말고 평평하게 안착시킵니다. 그런 다음 직사각형 컷아웃이 있는 먼지 없는 0.25 millimeter 가스켓을 마이크로 수로 슬라이드 위에 올려, 가스켓의 채널이 유체 채널과 일치하고 큰 공기 층이 생기지 않도록 합니다. 각 방울의 중심 간 거리가 2.5 millimeters가 되는 패턴으로 마이크로 수로 슬라이드 표면에 1 µL 리포좀 현탁액을 최대 5방울까지 떨어뜨립니다. 5개의 리포좀 방울은 서로 다른 조성을 가질 수 있으나, 본 실험에서는 니켈 킬레이팅 지질이 없는 이중층 하나와 10% 니켈 킬레이팅 지질을 포함하는 이중층 하나, 이렇게 두 개의 이중층만 형성하겠습니다.

이 방울들을 배치한 후, 커버 슬립을 표면 위에 한 번의 동작으로 조심스럽게 덮고 가능한 한 빨리 베이스에 고정하십시오. 리포좀 방울들이 커버 슬립과 접촉해야 합니다. 이 접촉 상태는 유지되어야 하는데, 이는 지질 이중층이 이미 형성되었을 가능성이 높으며, 어떠한 교란이라도 발생하면 결함이 있는 이중층이 형성될 수 있기 때문입니다.

이 단계에서는 현미경에서 커버슬립의 위치를 잡는 데 도움이 되도록 슬라이드 위에 지성 펜으로 이중층의 위치를 작게 표시하는 것이 중요합니다. 시스템이 평형 상태에 도달할 때까지 20분 동안 기다린 후, 약 20 cm의 유연한 튜브와 3방향 스톱콕(three-way stop cock)이 연결된 20 mL 주사기를 사용하여 모든 용액을 옮깁니다. 스톱콕의 다른 포트는 스톱콕과 유동 셀(flow cell) 사이의 데드 볼륨(dead volume)을 최소화하기 위해 짧은 길이의 튜브로 유동 셀에 연결합니다.

염화 마그네슘, 염화 칼슘, 포도당 및 인간 혈청 알부민이 포함된 HEBS 완충 식염수로 시린지를 채웁니다. 튜브와 스톱콕을 프라이밍하여 공기 방울이 없도록 합니다. 그런 다음 이를 유동 셀에 연결하고, 이중층 위로 공기 방울이 지나가지 않는지 확인하면서 5 mL를 한 번의 동작으로 밀어 넣습니다.

이제 지질 이중층에 His-tag 단백질을 도입할 준비가 되었습니다. 먼저 카제인(casein)으로 블로킹한 후 니켈로 충전해야 합니다. 1 mL 주사기에 카제인 니켈 이온 용액을 채우고, 공기 방울이 들어가지 않도록 주의하며 이를 사이드 포트에 연결하십시오.

용액을 주입한 후, 완전히 블로킹될 수 있도록 20분 동안 기다립니다. 그 다음 20 milliliter 시린지를 사용하여 H-B-S-H-S-A로 블로킹 용액을 씻어냅니다. 이제 polyhis 태그가 붙은 ICAM one 및 IEK가 포함된 H-B-S-H-S-A 용액 0.5 milliliters를 주입합니다.

본 실험에서는 ICAM-1을 SCI-5로 라벨링합니다. 따라서 LFA-1과 ICAM-1의 상호작용은 이중층 내 ICAM-1의 재배열을 이미징함으로써 추적할 수 있습니다. 단백질이 니켈이 충전된 이중층에 부착되는 동안, 단백질이 이중층에 결합할 수 있도록 30분간 대기합니다. 커스텀 스테이지 인서트를 사용하여 플로우 셀을 도립 현미경에 고정합니다.

그다음 가열 전자 장치를 연결하여 시스템이 37 °C에서 평형을 이루도록 합니다. 이전에 표시해 둔 표식을 사용하여 대물렌즈가 이중층 중 하나와 일치하도록 플로우 셀의 위치를 잡고, 간섭 반사 현미경을 사용하여 필드 다이어프램의 반사광 이미지에 초점을 맞춤으로써 초점 평면을 찾습니다. 마지막으로, 플로우 셀에서 결합되지 않은 ICAM-1을 세척하여 제거합니다.

turf M 및 와이드필드 모드에서 ICAM-1 채널을 통해 이중층의 형광 이미지를 획득합니다. 이는 니켈이 없는 이중층과 비교하여 니켈 코팅 이중층에 ICAM-1이 결합되었음을 확인하기 위함입니다. 이제 플로우 셀에 세포를 주입할 준비가 되었습니다.

본 시연에서는 retrovirus ENC coating GFPs P zap 70로 형질전환된 ND T-cell receptor transgenic T 세포를 사용합니다. 세포를 H-B-S-H-S-A로 한 번 세척한 다음, TCR 마이크로클러스터를 추적할 수 있도록 T-cell receptor에 대한 Alexa 5 68 표지 FAB와 함께 세포를 배양합니다. 15분 후, 세포를 1:10으로 희석합니다. 이렇게 하면 H 57 항체가 충분히 희석되어 turf M 이미징을 방해하지 않으면서도, 처음에 결합했던 fab가 해리되기 시작할 때 T cell receptor의 포화 상태를 유지할 수 있습니다. 그 후, 세포를 플로우 셀(flow cell)에 주입합니다.

우리는 3색 turf M 모드로 면역 시냅스를 이미징합니다. 여기에는 LFA-1과 ICAM-1 상호작용의 형성, TCR 클러스터 및 c-SMAC의 형성, 그리고 GFP-ZAP-70을 모집하는 TCR 마이크로 클러스터의 지속적인 형성이 포함됩니다. 이러한 결과 중 일부는 획득 과정에서 분명하게 나타나지만, 다른 결과들은 이를 완전히 파악하기 위해 사후 처리 분석이 필요합니다.

지금까지 지지 평면 이중층(supported planar bilayers)을 사용하여 면역 시냅스를 연구하는 방법을 살펴보았습니다. 이러한 실험이 성공하려면 T세포의 상태가 매우 좋아야 한다는 점이 매우 중요하며, PPS 완충 식염수는 T세포의 장기 배양에 적합하지 않습니다. 따라서 세포를 배양액에서 꺼내 이 매질에 넣은 후, 매우 빠르게 사용하는 것이 좋습니다.

더 장기적인 실험을 수행하고자 하는 경우, HEPES 완충 식염수 대신 사용할 수 있는 매우 우수한 무혈청 배지 조성들이 있습니다. 사이토카인 생성이나 T 세포 증식과 같은 장기적인 종말점 분석을 수행하려는 경우, 이러한 배지를 사용하면 세포를 훨씬 더 오래 생존시킬 수 있습니다. 이것으로 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.