면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers

안녕하세요, 저는 Geral Institute와 New York University School of Medicine의 Mike Dustin입니다. 오늘은 면역학적 시냅스(immunological synapse) 연구를 위한 지지 평면 바이올레이(planar Biolay)를 형성하는 절차를 안내해 드리겠습니다. 시작하겠습니다.

지질 이중층을 만들기 위해 1-2 밀리리터의 클로로포름 메탄올이 함유 된 유리관에 20 % 니켈, 킬레이트 지질 및 80 % 포스파티딜 콜린 용액을 적절량으로 준비합니다. 첫 번째 단계는 섭씨 30-37도의 따뜻한 수조에서 질소 가스 흐름 아래에서 용매를 증발시키는 것입니다. 일반적으로 약 15분이 소요됩니다.

그런 다음 동결 건조기를 사용하여 고진공 상태에서 90분 동안 남아 있는 용매를 제거합니다. 다음으로, 2%N 옥탈 글루코시드 세제 관심 식염수 완충액에 지질을 최종 농도 0.4 밀리몰로 용해시킵니다. 이것은 리포좀을 형성하기 위해 혼합 세제 인지질 균세포 용액을 생성합니다.

세제를 제거하고 리포좀을 형성하기 위해 트리스 식염수의 세 가지 변화에 대해 이 용액을 투석합니다. 우리는 일반적으로 약 10킬로달톤의 컷오프가 있는 6mm 직경의 튜빙이 있는 1밀리리터 정도의 부피로 작업하며 튜브를 고정하는 동안 기포를 제외하도록 주의합니다. 우리는 이 용액을 멸균 여과하고 깨끗한 조건에서 투석을 수행하고 70% 에탄올 멸균 장갑을 사용하여 처리합니다.

이 용액은 수정처럼 맑아야 하며 산화를 방지하기 위해 아르곤 가스에 보관됩니다. 솔루션이 탁하면 여러 개의 벽으로 된 소포가 생성되었으므로 다시 시작해야 합니다. 실험을 시작하기 위해서는 먼저 주어진 농도의 용해성 단백질에서 니켈 킬레이트 이중층의 주어진 표면적에 얼마나 많은 ICAM 1과 MHC가 증착되어 있는지 결정해야 합니다.

이를 위해 5마이크로미터 직경의 유리 속도로 이중층을 증착합니다. 이미징에 사용되는 플로우 셀의 것과 유사한 조건에서 단백질 용액으로 유리 구슬을 배양한 다음 유동 면역 플루오로 메트릭 분석으로 결합된 단백질의 밀도를 판독합니다. 분자당 플루오레세인 수가 알려진 FSI 표지 항체는 표면 결합 단백질을 검출하는 데 사용되며 플루오레세인 표준 비드는 유동 마이크로 형광계를 보정하는 데 사용됩니다.

우리는 ICAM 1의 평방 마이크로미터당 200개의 분자와 제곱당 0.2에서 20개의 분자를 가진 항원 제시 세포에 대한 조건을 근사화할 것입니다. I-E-K-M-C-C 91 1 0 3의 마이크로미터, 복잡한 평면 이중층은 리포좀이 유리와 융합할 때 자발적으로 형성되지만 유리를 청소하기 위해 적절하게 세척된 경우에만 형성됩니다. 우리는 황산과 30% 과산화수소의 갓 준비된 혼합물인 산성 피아나 용액을 사용하여 모든 유기 물질을 파괴하고 유리 표면을 매우 친수성으로 만듭니다.

피라냐와 함께 작업할 때는 산성 앞치마와 무거운 내산성 장갑을 포함한 완전한 보호복을 착용합니다. 폐기물은 유기 폐기물과 조심스럽게 분리하여 적절하게 처리해야 합니다. 산성 피라냐 용액을 준비하려면 건조 비커에 75ml의 진한 황산을 첨가한 다음 25ml의 30% 과산화수소를 조심스럽게 첨가합니다.

용액은 섭씨 100도 이상까지 빠르게 가열된 다음 드라이 커버 슬립을 용액에 15분 동안 담그십시오. 피라냐에서 이 배양 후 커버 슬립을 정제수에 담근 다음 양쪽을 1분 동안 헹굽니다. 그런 다음 진공 공급원을 사용하여 덮개 미끄러짐을 건조시켜 정제수를 배출합니다.

피라냐 용액을 식히고 피라냐 폐기물 용기에 넣고, 뚜껑이 느슨한 상태로 남아 있고 흄 후드에 잘 표시되어 이중층을 형성합니다. 우리 연구실은 통합 가열의 장점이 있는 bi FCS 두 개의 챔버를 사용합니다. FCS 2 시스템은 0.5mm 상단 개스킷이 있는 미세유체 매니폴드, 한쪽 표면은 가열을 위해 인듐 주석 산화물로 코팅된 마이크로 수로 슬라이드, 다른 면에는 유체 홈이 있는 스테인리스강 베이스에 있습니다.

플로우 챔버의 높이를 정의하는 먼지가 없는 0.25mm 개스킷과 피라냐가 청소한 40mm 원형 커버 슬립은 이중층이 형성되어 플로우 셀을 조립하고 평면 이중층을 형성합니다. 튜브가 평평한 표면에 위로 향하도록 매니폴드를 놓습니다. 그런 다음 유체 튜브 위에 구멍이 있는 0.5mm 개스킷을 놓고 평평하게 놓았는지 확인합니다.

유체 채널이 위를 향하도록 마이크로 수로 슬라이드를 부드럽게 배치하고 슬라이드의 구멍이 미세 유체 튜브를 정렬하는지 확인할 때까지 아래쪽 압력을 가하지 않고 평평하게 안착되었는지 확인합니다. 그런 다음 마이크로 수로 슬라이드 위에 직사각형 컷아웃이 있는 먼지가 없는 0.25mm 개스킷을 놓고 채널이 유체 채널과 정렬되고 주요 공기 공간이 없도록 마이크로 수로 슬라이드의 표면에 최대 5개의 1마이크로리터 드롭의 리포솜 현탁액을 놓고 각 방울 사이의 중심 간 거리가 2.5mm가 되도록 패턴으로 배치합니다. 5개의 리포좀 방울은 조성이 다를 수 있지만, 이 경우 니켈 킬레이트 지질이 없는 것과 10% 니켈 킬레이트 지질이 있는 이중층만 형성합니다.

이러한 방울이 제자리에 고정되면 한 번의 동작으로 커버 슬립을 표면에 조심스럽게 놓고 가능한 한 빨리 베이스에 고정합니다. 리포좀 방울은 커버 슬립과 접촉해야 합니다. 이중층이 이미 형성되었을 수 있고 중단으로 인해 이중층에 결함이 발생할 수 있으므로 이 접촉이 끊어져서는 안 됩니다.

이 시점에서, 현미경에서 커버 슬립의 위치를 쉽게 잡을 수 있도록 슬라이드에 몇 개의 작은 잉크 점으로 이중층의 위치를 표시하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 시스템이 평형을 이룰 때까지 20분 동안 기다렸다가 약 20cm의 유연한 튜브에 연결된 20ml 주사기와 3방향 스톱 콕을 사용하여 모든 용액을 전송합니다. 그런 다음 스톱 콕의 다른 포트를 짧은 길이의 튜브로 플로우 셀에 연결하여 스톱콕과 플로우 셀 사이의 데드 볼륨을 최소화합니다.

주사기에 염화마그네슘, 염화칼슘 포도당 및 인간 혈청 알부민을 포함하는 heis 완충 식염수로 채웁니다. 튜브를 프라이밍하고 기포가 없도록 수탉을 멈춥니다. 그런 다음 이것을 플로우 셀에 연결하고 기포가 이중층을 통과하지 않는지 확인하면서 한 번의 동작으로 5ml를 밀어 넣습니다.

이제 히스 태그가 지정된 단백질을 이중층에 도입하기 위해 이중층을 갖게 됩니다. 먼저 카젠으로 막고 니켈로 충전해야 합니다. 1밀리리터 주사기에 카젠 니켈 이온 용액을 채우고 기포를 가두지 않고 측면 포트에 연결합니다.

용액을 주입한 후 완전한 차단이 허용될 때까지 20분 정도 기다립니다. 그런 다음 20ml 주사기에서 H-B-S-H-S-A로 차단 용액을 씻어냅니다. 이제 폴리히스 태그가 지정된 ICAM 1 및 IEK를 포함하는 H-B-S-H-S-A 용액 0.5ml를 주입합니다.

이 실험에서 ICAM 1은 SCI 5로 표시됩니다. 따라서 LFA one ICAM one 상호 작용은 이중층에서 ICAM one rearrangement를 이미징하여 단백질이 이중층에 부착하는 동안 단백질이 니켈 하전 이중층에 결합할 수 있도록 30분 동안 허용할 수 있습니다. 맞춤형 스테이지 인서트를 사용하여 플로우 셀을 도립 현미경에 고정합니다.

그런 다음 가열 전자 장치를 연결하여 시스템이 섭씨 37도에서 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 앞에서 만든 마크를 사용하여 플로우 셀을 배치하여 대물렌즈가 이중층 중 하나와 정렬되도록 하고, 간섭 반사 현미경을 사용하여 자기장 다이어프램의 반사광 이미지에 초점을 맞춰 초점면을 찾습니다. 마지막으로, flow cells에서 결합되지 않은 ICAM one을 세척합니다.

ICAM에서 이중층의 형광 이미지를 획득하고, 잔디 M 및 광시야 모드에서 한 채널을 획득합니다. 이것은 니켈이 없는 이중층에 대해 니켈 코팅된 이중층에 대한 ICAM 하나의 결합을 확인하기 위한 것입니다. 이제 플로우 셀(flow cell)이 세포를 수용할 준비가 되었습니다.

이 시연을 위해 레트로바이러스 ENC 코팅 GFP P zap 70으로 형질도입된 ND T-세포 수용체 형질전환 T 세포를 사용하고, H-B-S-H-S-A로 세포를 한 번 세척한 다음 Alexa 5 68 표지된 FAB로 세포를 T 세포 수용체에 배양하여 TCR 마이크로 클러스터를 추적할 수 있습니다. 15분 후 세포를 1에서 10으로 희석합니다. 이렇게 하면 H 57 항체가 잔디 M 이미징을 방해하지 않도록 충분히 희석되지만, 초기에 결합된 fab이 해리되기 시작할 때 T 세포 수용체의 포화도를 유지한 다음 flow cell에 주입합니다.

우리는 면역 학적 시냅스를 3 색 잔디 M 모드로 이미지화합니다. 여기에는 LFA one, ICAM one 상호 작용의 형성, TCR 클러스터 및 C smac의 형성 및 GFP ZAP 70을 모집하는 TCR 마이크로 클러스터의 지속적인 형성이 포함됩니다. 이러한 결과 중 일부는 획득 중에 명백하게 드러나는 반면, 다른 결과는 완전히 평가하기 위해 후처리 분석이 필요합니다.

자, 방금 지원되는 평면 이중층을 사용하여 면역학적 시냅스를 연구하는 방법을 보여드렸습니다. 이러한 실험이 작동하려면 T 세포의 상태가 매우 양호하고 PPS 완충 식염수가 장기 T 세포 배양에 적합하지 않다는 것이 매우 중요합니다. 따라서 배양에서 세포를 꺼내 이 배지에 넣은 다음 매우 빠르게 사용하려고 합니다.

장기적인 실험을 하고 싶다면 피스 완충 식염수를 대체할 수 있는 아주 좋은 무혈청 배지 제형이 있습니다. 이렇게 하면 사이토카인 생산이나 T 세포의 증식과 같은 말단 말점 연장을 원하는 경우 세포가 훨씬 더 오래 살아 있게 유지할 수 있습니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.