$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Voordat u begint te bereiden:
- Wandering yhird instar Drosophila larven
- HL3.1 (Gewijzigd hemolymfe-achtige)-oplossing
- Sylgard (transparant silicone rubber) dissectie platen bereid in kleine (35 x 10 mm) plastic petrischaaltjes met behulp van methoden beschreven door Brent en McCabe (2008) 3.
- Snijd dissectie pinnen kort
- Elektrode pipetten
- Scherpe opname pipetten
HL3 Oplossing:
- Tijdens de dissecties en elektrofysiologische experimenten, zijn larve ondergedompeld in HL3.1 oplossing 2, dat bevat (in mm): 70 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 trehalose, 115 sucrose, en 5 HEPES, pH 7,2.
- Concentraties van CaCl 2 worden toegevoegd aan de HL3.1 oplossing voor de vereiste concentratie van extracellulaire Ca 2 + te verstrekken.
- Larvale dissecties worden uitgevoerd bij lage Ca 2 +-concentraties (tot spiersamentrekking te voorkomen) met behulp van HL3.1 + 0,25 mM CaCl 2, bewaard op ijs.
- Elektrofysiologische experimenten worden meestal opgenomen in HL3.1 + 1 mM CaCl 2, maar dit kan aangepast worden van 0,4 - 1 mM Ca 2 + als nodig is.
- De oplossing is HL3.1 filter gesteriliseerd voor gebruik, en bewaard bij 4 ˚ C.
De voorbereiding van het stimuleren en opname pipetten:
- Opname en het stimuleren van pipetten worden getrokken met een Sutter P-2000 Laser op basis van micropipet trekker met de volgende instellingen: Warmte = 390, Filament = 4, Snelheid = 35, Delay = 200 en Pull = 0.
- Stimulatie-elektroden zijn bereid uit dunwandige borosilicaatglas capillairen met brede uiteinden die waren iets groter dan de breedte van de afgehakte motor axonen. De gevormde uiteinden zijn firepolished voor een gladde afwerking (met behulp van een pipet Narashiga polijstmachine), om schade aan de zenuw te minimaliseren geven. Stimulatie-elektroden worden gevuld met bad-oplossing (HL3.1 + 1 mM Ca2 +).
- De opname elektroden zijn vervaardigd uit 1,2 mm borosilicaatglas, die wordt getrokken tot een scherpe pipet (30-60 mΩ) te vormen, en gevuld met 3M KCl.
Deel 1: Dissectie van Drosophila Larven
- Derde instar rondtrekkende larven worden ontleed om de spieren bloot in het lichaam muur zoals eerder beschreven 4.
- Dissecties worden uitgevoerd in HL3.1 + 0,25 mM Ca 2 + op kleine siliconen platen (35 x 10 mm). HL3.1 oplossing moet ijskoud voor dissecties zijn om de larve verdoven, en wordt gehouden op ijs voor en tijdens de dissecties.
- Larven zijn ontleed met behulp van methoden beschreven door Brent en McCabe (2008), dat is voor elektrofysiologie experimenten gewijzigd door toevoeging van 0,25 mM Ca 2 + aan de HL3.1 dissectie oplossing, en met behulp van korte dissectie pinnen (~ 2 mm in de lengte) die minder waarschijnlijk de microscoop objectief en elektroden raakte tijdens een experiment.
- Na dissectie, zijn de motor axonen van de larven verbroken. Dit wordt gedaan door zacht houden van de CNS en het verhogen van het licht, zodat de perifere zenuwen die de spieren posterior aan de ventrale ganglion innerveren kan worden gesneden zonder beschadiging van de spieren (figuur 1). De hersenen wordt vervolgens verwijderd.
- De ontleed larvale voorbereiding is twee keer gewassen met HL3.1 + 1 mM Ca 2 +.
Figuur 1. Schematische weergave van de stappen die betrokken zijn bij het snijden van de motor axonen van ontleed larven. Het CZS wordt opgetild met een pincet en de motor axonen worden gesneden aan de basis van de hersenen.
Deel 2: Intracellulaire opnamen van larvale spiercellen.
- Plaats de dissectie plaat op de elektrofysiologie microscoop en dompelen de prep met HL3.1 + 1,5 mM Ca 2 + en bevestig het bad elektrode zo is het in contact komt met de oplossing.
- Alle experimenten worden uitgevoerd op spier-6 in de derde abdominale segment (A3). Perifere zenuwen die de spieren innerveren worden gestimuleerd met behulp van een zuig-elektrode 5.
- Plaats de elektrode in de schaal als eerste trillingen te vermijden wanneer de intracellulaire elektrode op zijn plaats. Plaats de elektrode in de nabijheid van de motor neuron innerveren de spieren 6 en zachtjes zuig totdat de cut zenuw zich in de glazen pipet. Wees voorzichtig niet aan de zenuwen rekken bij afzuiging wordt toegepast. Til de pipet een beetje dus het is niet het aanraken van de spier en zorg is het niet trekken aan de gesneden zenuwvezels (figuur 2).
Figuur 2. Een schema van de spieren en innerveren motorische neuronen van een abdominaal segment van de Drosophila larven. De positie van de stimulerende pipet en doorgesneden zenuwen en de registratie-elektrode in de positie op de spieren 6 worden geïllustreerd. - Intracellulaire opnames zijn gemaakt met scherpe micro-elektroden gevuld met 3 M KCl. De positie van de registratie-elektrode boven het midden van de spier 6 op de derde abdominale segment (A3) en stel de input offset zodat het nul staat voor het bad oplossing. Langzaam laat de elektrode en aanpak van de spier onder hoge optische vergroting totdat deze de spier oppervlak. Bekijk de oscilloscoop om te bevestigen dat de spier is doorgedrongen. De rust membraanpotentiaal moet minstens -60 mV, of het dier mag niet worden gebruikt. Sporadische miniatuur eindplaat potentialen moet nu zichtbaar zijn. Laat de cel om een minuut stabiliseren voordat u begint met opnemen.
- Veranderingen in de membraanpotentiaal worden gedetecteerd met een Axon HS-2A hoofd podium en een Axoclamp 2B versterker en opgenomen met Clampex v 8.2.0.235 (Axon Instruments). De Axoclamp 2B is gekoppeld aan een computer die pCLAMP software en werkt in combinatie met de Digidata 1322A-interface draait.
- Cellen werden opgenomen voor 3 minuten zonder enige stimuli om mEJP reacties te meten. Sporen werden geanalyseerd met behulp van Mini-analyse software (Synaptosoft, v 6.0.3) en de mEJP amplitude en de frequentie bepaald.
Nerve Stimulatie:
- Het afgesneden uiteinde van de motor neuron wordt gestimuleerd met een reeks van vierkante spanningspulsen (0,3 ms duur) met een intensiteit die voldoende is voor zowel de motor axonen, om een consistente reacties op te roepen in de hele spier.
- De prikkel wordt gegenereerd met de Master-8 puls generator, die is geprogrammeerd om continu pulsen te leveren afhankelijk van de duur en interval tijden.
- Laat vijf seconden tussen de stimuli voor de synaptische herstel op de NMJ.
- Bij het bepalen van de sterkte van de stimulus, te beginnen met het laagste niveau en langzaam verhogen van de intensiteit over meerdere studies. De minimale stimulus intensiteit die resulteert in een opgewekte reacties moet worden gebruikt in experimenten.
- Wanneer de juiste stimulus intensiteit is bereikt, moet er een verbinding EJP en een samentrekken van de spieren opgeroepen door de stimulus.
- Record ten minste 10 evoked potentials van elke spier en het gemiddelde van de amplitudes.
Deel 3: representatieve resultaten
Figuur 3. Vertegenwoordiger intracellulaire opname van de spieren 6 met de opgeroepen EJP is naar aanleiding van elektrische stimulatie van de segmentale zenuw, en de sporadische miniatuur eindplaat potentialen, of mEJP's. EJP amplitudes in de spieren 6 van gezonde wild-type larven, zoals de Canton S, zijn meestal rond de 40 mV en de mEJP amplitudes tussen 1-3 mV.