Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur over Solid Media

Samenvatting

In dit artikel geven we een algemeen protocol voor het meten van de levensduur van nematoden gehouden op vaste media met UV-gedode bacteriën voedsel.

Samenvatting

Veroudering is een degeneratieve proces wordt gekenmerkt door een progressieve verslechtering van de cellulaire componenten en organellen resulterend in sterfte. De nematode

Protocol

Deel 1: Bereid nematode groei media (NGM) platen

Deze paragraaf beschrijft de bereiding van het vaste NGM platen voor gebruik in de levensduur experiment. Een basis levensduur experiment zijn twee types van platen: standaard NGM platen, die geen additieven, en Amp / FUDR platen, die zowel ampicilline (Amp) en fluorodeoxyuridine (FUDR) toegevoegd aan de NGM hebben bevatten. Ampicilline wordt gebruikt om buitenlandse bacteriële besmetting te voorkomen. FUDR remt de celdeling, vermindert de productie van eieren, en voorkomt dat eieren van uitkomen. Het gebruik van FUDR voor een lange levensduur analyse heeft geen invloed op volwassen levensduur en verwijdert de noodzaak om de wormen overdragen om de paar dagen om ze te scheiden van groeiende larve. Beide types van platen zijn bezaaid met E. coli OP50 bacteriën, die vervolgens wordt gedood door blootstelling aan UV.

1. Bereid NGM (zie hoofdstuk 5 voor recept en opslag noten) en label petri platen. U moet een 60 mm petri plaat per 10 ml NGM. Als je begint met de eerder bereid solide NGM, blijven 1,2 stap. Als u begint met vers geautoclaveerd NGM, ga dan naar stap 1.4.
2. Volledig smelten solide NGM door de magnetron op hoog in de 30 seconden pulsen. Swirl media tussen de pulsen te druk gasbellen te voorkomen dat de opbouw.
3. Plaats vloeistof NGM in 55 ° C water bad of op de bank om af te koelen.
4. Zodra NGM bereikt 55 ° C toe te voegen 33 pi van 150 mm FUDR en 100 pi van 100 mg / ml ampicilline per 100 ml NGM (voor Amp / FUDR platen) en zwenk om te mengen. Voor NGM platen zonder extra medicijnen gaan rechtstreeks naar 1,5 stap.
5. Met behulp van steriele techniek, pipet 10 mL NGM in elkaar 60 mm petri-plaat. Vermijd de vorming van luchtbellen indien mogelijk. Als luchtbellen vormen wel, kunnen ze worden geknald met behulp van een pipet tip.
6. Laat platen op de bank met de deksels op om NGM stollen en droog. Indien mogelijk, laat platen bank voor 2 dagen voor het toevoegen van bacteriën, maar 1 dag zal werken als platen zijn eerder nodig zijn.
7. Op de dag voordat de platen af te drogen, zaad vloeibaar LB cultuur met een enkele kolonie vanuit een nieuw streak van E. coli bacterie OP50 op LB-agar. U moet zich voorbereiden op zijn minst 1 mL van een overnachting OP50 cultuur per 60 mm plaat.
8. Plaats OP50 cultuur in 37 ° C mogelijk maakt shaker en bacteriën om te groeien 's nachts (cultuur moet komen verzadiging).
9. Pellet OP50 bacteriën door het draaien bij 3.500 g gedurende 10 minuten.
10. Verwijder 90% van de supernatant en resuspendeer bacteriën om zich te concentreren cultuur 10x.
11. Pipetteer 100 ul van 10x geconcentreerde OP50 cultuur in het centrum van gestolde NGM platen. Swirl platen voorzichtig te spreiden bacteriën cultuur als dat nodig is (idealiter bacteriën moeten het centrale gebied van de NGM te dekken zonder dat de buurt van de plaat wanden). Probeer te vermijden dat het aanraken van de pipet tip om het oppervlak van de NGM, zoals gebreken in het oppervlak van de media zodat de wormen te graven in de NGM.
12. Laat platen op de bank 's nachts, zodat bacteriën cultuur te drogen op de vaste NGM (meestal duurt ongeveer 24 uur).
13. Eenmaal droog, bloot het oppervlak van de platen om een ​​UV-dosis voldoende is om de groei van de bacteriën te arresteren. Als u gebruik maakt van een Stratagene UV Stratalinker 2400:
    • Plaats platen in de Stratalinker en verwijder de deksels
    • Sluit de deur en zet de Stratalinker
    • Druk op 'Energie'
    • Geef '9999 'met behulp van het toetsenbord
    • Druk op 'Start'
    • De platen zullen worden blootgesteld aan UV voor ongeveer 5 minuten
14. Platen met UV-gedode bacteriën kunnen ondersteboven worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand.

Deel 2: Voer een getimede eileg tot een leeftijd-gesynchroniseerde populatie van de dieren te verwerven

In deze paragraaf geven we het genereren van een populatie van wormen met een gemeenschappelijke luik-date is. Dit wordt bereikt door te Reproductief actieve volwassenen om eieren te leggen op een bord voor een bepaalde periode van tijd en waardoor die eieren te ontwikkelen.

1. (Optioneel) Breng circa 20 jonge volwassen wormen om een ​​frisse NGM plaat zonder FUDR. Laat platen bij 25 ° C, zodat de wormen te verspreiden en te eten door alle van de bacteriële voedsel. Nadat de bacteriën voedsel is geconsumeerd pas uitgekomen wormen zullen in de groei gearresteerd Dauer podium. Je zult om te Dauer larve zien rond te starten binnen een week, afhankelijk van het aantal wormen u in eerste instantie over te dragen aan de plaat. Dauer larve kan gebruikt worden voor de volgende stappen voor maximaal 1 maand.
2. (Optioneel) Transfer 20 tot 30 Dauer larve een nieuwe NGM plaat zonder FUDR. In de aanwezigheid van voedsel Dauer larve zal Reproductief actieve volwassenen worden binnen 2 dagen en blijven voor de voortplanting actief voor een paar dagen daarna bij 25 ° C.
3. Overdracht 10-15 Reproductief actieve volwassenen een nieuwe NGM plaat zonder FUDR. Deze plaat wordt aangeduid als de getimede eileg (TEL) plaat.
4. Laat de TEL plaat bij 25 ° C gedurende 6 uur, om t makenhij wormen tijd om eieren te leggen.
5. Verwijder de volwassen wormen uit TEL plaat. Plaat kunnen visueel worden geïnspecteerd voor eieren voordat u volwassenen. Als de wormen nog niet gelegd een voldoende aantal eieren die de TEL plaat kan worden achtergelaten bij 25 ° C tot een totaal van 24 uur voor het verwijderen van volwassen wormen.
6. Plaats TEL plaat bij 20 ° C tot de eieren zijn uitgekomen en de wormen hebben ontwikkeld om de L4 larvale stadium (in het algemeen 2 dagen voor wild-type C. elegans, maar kan langer duren voor de stammen met langzame ontwikkeling fenotypes).

Deel 3: Score dieren voor de levensduur

In deze paragraaf volgen we de leeftijd-gesynchroniseerde bevolking van wormen uit deel 2 tot ze sterven. Wormen zijn bijgehouden op Amp / FUDR platen ei-productie en bacteriële besmetting te voorkomen en worden geacht dood als ze niet reageren op prikkels van buitenaf.

1. Overdracht L4 larve tot gezaaid Amp / FUDR platen. Voor iedere stam of conditie worden getest, is het typisch op te zetten 2-3 borden met 25-30 wormen per plaat. Beelden van de C. elegans levensfasen zijn bedoeld voor referentie (Figuur 1) ^1.
2. Plaats Amp / FUDR platen bij 20 ° C gedurende 24 uur.
3. Na 24 uur, visueel te beoordelen wormen, media, en bacteriën. Overdracht wormen in de frisse Amp / FUDR platen als een van de volgende wordt waargenomen:
   • Wormen hebben gegeten het grootste deel van de bacteriële voedsel. Vroeg in de levensduur van wormen experiment zal moeten worden overgebracht 1 tot 2 keer een week om de bacteriën te voorkomen dat uitgeput.
   • Een groot aantal van de larven aanwezig zijn. Dit is meestal een indicatie dat de wormen werden overgebracht naar de Amp / FUDR platen als jonge volwassenen in plaats van L4S en waren in staat om enkele eieren te leggen voordat de FUDR van kracht werd. De FUDR zal de larven in het algemeen te voorkomen groeien in volle volwassenen, maar af en toe een paar zal uitgroeien tot volwassenen en worden verward met de proefdieren.
   • Live / groeiende bacteriën worden waargenomen. In het algemeen zal de combinatie van Amp-en UV-doden ervoor te zorgen dat er geen levende bacteriën het experiment worden besmet, maar af en toe het zich voordoet.
   • Schimmelgroei is waargenomen op de media. Als vroeg genoeg bij bent, kan schimmelgroei meestal worden gesneden met behulp van een pipet tip of spatel. Als het eenmaal groeit groter te zijn dan een paar millimeter in diameter is het meestal makkelijker om de wormen te dragen aan een nieuwe plaat.
   • Met behulp van de dissectie bereik, bepalen of elke worm is levend of dood.
   • Tik voorzichtig de plaat. De worm is levend als het beweegt in reactie op de tikken.
   • Als de worm niet reageert op het aanboren van de plaat, zoom in op het hoofd regio.
   • Tik voorzichtig de worm het hoofd met platina overdracht te plukken. De score van de worm als dood als het niet reageert door het bewegen van zijn hoofd.
   • Dode wormen kunnen worden verwijderd uit de plaat.
4. Noteer de datum en het aantal wormen die zijn levend en dood.
5. Keer terug platen tot 20 ° C.
6. Herhaal stap 3.3 tot 3.6 om de 2 tot 3 dagen totdat alle wormen zijn gestorven.

Deel 4: Representatieve resultaten.

De ruwe gegevens die door een nematode levensduur experiment is een lijst van data met de bijbehorende aantallen wormen die nog in leven en dood voor elk getest stam. Het aantal wormen die sterven op elke dag is meestal omgekeerd om het aandeel van de wormen leven op elke dag (Figuur 2A), die grafisch wordt uitgezet als een survival curve (Figuur 2B te berekenen; de dag van de getimede eileg wordt beschouwd als dag 0 ). De levensduur voor elke individuele worm in de studie kan worden berekend op basis van de telling van de wormen die sterven op elke dag en gebruikt voor het gemiddelde en mediane levensduur te berekenen voor vergelijking tussen de stammen. De telling van het aantal wormen in leven op elke dag wordt niet direct gebruikt in de levensduur analyse. Worms onderhouden op vaste media zal zo nu en 'vluchten', of kruipen of op de muur van de plaat of naar beneden onder de media. Het aantal wormen leven op elke dag gebruikt kan worden om te bepalen hoeveel wormen gevlucht in de loop van het experiment. Wormen die vluchten worden meestal verwijderd uit de analyse. Als benchmark, de typische gemiddelde levensduur van N2, de C. elegans wild-type stam, gehouden op UV-gedode bacteriën bij 20 ° C is ongeveer 25 dagen gemeten vanaf ei.

Deel 5: Oplossingen

Nematoden Groei Media (NGM), 100 ml:
Te combineren:
0,3 g	NaCl
0,25 g	Pepton
2 g	Agar-agar
Autoclaaf gedurende 40 minuten en laat afkoelen tot 55 ° C, dan toevoegen:
100 ul	1 M MgSO 4
100 ul	5 mg / ml Cholesterol
100 ul	1 M CaCl2
1,625 mL	1,5 M KPI pH 6,0
Vloeistof NGM kan onmiddellijk worden gebruikt om de platen gieten of de gelegenheid te stollen en opgeslagen op lange termijn bij kamertemperatuur

Luria Broth (LB), 1L:
10 g	BactoTryptone
5 g	Gist Extract
10 g	NaCl
10 ml	1 M Tris pH 8,0
Een L	gedeïoniseerd water
Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur.

1 M MgSO 4, 300 ml:
73,95 g	MgSO 4
300 ml	gedeïoniseerd water
Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur.

5 mg / ml Cholesterol, 200 ml:
1 g	cholesterol
200 ml	100% ethanol
Filter steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur.

1 M CaCl 2, 500 ml:
27,75 g	CaCl 2
500 ml	gedeïoniseerd water
Filter steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur.

1,5 M KPI pH 6,0, 1L:
Te combineren:
31,4 g	KPI dibasisch
179,6 g	KPI monobasisch
850 ml	gedeïoniseerd water
Warmte tijdens het mengen, zodat KPI op te lossen in oplossing. Pas de pH op 6.0 met 10 N NaOH.
Voeg gedeïoniseerd water tot 1 L.
Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur.

1 M Tris, pH 8,0:
60,57 g	Tris
400 ml	gedeïoniseerd water
Pas de pH op 8.0 met HCl.
Voeg gedeïoniseerd water tot 500 ml.
Filter steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur.

150 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR), 10 ml:
0,3693 g	FUDR
10 ml	steriel gedemineraliseerd water
Bewaren bij -20 ° C.

100 mg / ml ampicilline (Amp), 10 ml:
1 g	Ampicilline
10 ml	steriel gedemineraliseerd water
Bewaren bij -20 ° C.

50 mg / ml carbenicilline (Carb), 10 ml:
500 mg	Carbenicilline
10 ml	steriel gedemineraliseerd water
Bewaren bij -20 ° C.

1 M Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), 10 ml:
2,38 g	IPTG
10 ml	steriel gedemineraliseerd water
Bewaren bij -20 ° C.

Figuur 1. Bright gebied beelden van C. elegans levensfasen, zoals ei, de vier larvale stadia (L1 - L4), en volwassen. Alle panelen tonen hermafrodieten, behalve de lagere-rechts, dat een volwassen man (Afbeelding van Wood (1988)) laat zien.

Figuur 2. Representatieve resultaten van een C. elegans levensduur experiment vergelijken van wild-type stam N2 naar een stam met een mutatie in het daf-2-gen. (A) Een tabel met verzamelde gegevens, waaronder het aantal dagen sinds wormen waren eieren, het aantal dode wormen waargenomen op elke dag, en het percentage van het oorspronkelijke monster nog in leven op elke dag (zoals berekend uit de dagelijkse tellingen van dode wormen) . (B) Survival curves die overeenkomt met de levensduur gegevens in (A).

Figuur 3. Vertegenwoordiger vergelijking van de lipofuscine tussen jong en oud volwassen C. elegans. Helderveld beelden worden getoond op de linker-en DAPI kanaal fluorescentie beelden aan de rechterkant. Top panelen tonen een vier dagen oude worm-en onderzijde panelen tonen een 11 dagen oude worm (zoals gemeten uit eieren).

Discussie

De genetische controle van de levensduur is uitgebreid onderzocht in C. elegans, grotendeels te danken aan het gemak en de snelheid waarmee levensduur kan worden vastgesteld. Het protocol besproken in dit artikel beschrijft een raamwerk voor het verkrijgen van reproduceerbare levensduur gegevens in C. elegans en kan ook worden toegepast op relatednematode soorten. ² Door het maken van een aantal eenvoudige aanpassingen van deze procedures kunnen worden aangepast aan de levensduur te meten on...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agar	Reagens	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Ampicillin	Reagens	MidSci	0339
BactoTryptone	Reagens	Fisher Scientific	DF0123-17-3 (211705)
BactoPeptone	Reagens	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
CaCl2	Reagens	Fisher Scientific	NC9699248 (1332-01)
Carbenicillin	Reagens	Gold Biotechnology	C0109
Cholesterol	Reagens	Sigma-Aldrich	C75209
Fluorodeoxyuridine (FUDR)	Reagens	Sigma-Aldrich	F0503
Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG)	Reagens	Gold Biotechnology	I2481C5
KPi Dibasic	Reagens	Fisher Scientific	5087862 (3252-01)
KPi Monobasic	Reagens	Fisher Scientific	5087861 (3246-01)
MgSO4	Reagens	Fisher Scientific	NC9561800 (2500-01)
NaCl	Reagens	Fisher Scientific	S251
Tris	Reagens	Sigma-Aldrich	T1503
Yeast Extract	Reagens	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)