Een eenvoudige, goedkope en effectieve methode voor de bereiding Drosophila embryo's voor live-imaging analyse wordt gepresenteerd. Onze-protocol zorgt voor vochtigheid en gas uit te wisselen en comprimeert niet de Drosophila embryo. Deze methode is geschikt voor het GFP-gebaseerde live beeldvorming van Drosophila embryo's met behulp van een stereomicroscoop of rechtop samengestelde microscoop.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
De voorbereiding van Drosophila Embryo's voor Live-Imaging Met behulp van de Opknoping Drop Protocol
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Groen fluorescerend eiwit (GFP)-gebaseerde timelapse live-imaging is een krachtige techniek voor het bestuderen van de genetische regulatie van dynamische processen zoals weefsel morfogenese, cel-cel adhesie, of celdood. Drosophila embryo's uitdrukken GFP zijn gemakkelijk beeld gebracht met behulp van stereoscopische of confocale microscopie. Een doel van een live-imaging protocol is het minimaliseren van nadelige effecten zoals uitdroging en hypoxie. Eerdere protocollen voor het bereiden van Drosophila embryo's voor live-imaging analyse hebben betrokken plaatsen dechorionated embryo's in halogene olie en daartussen ze tussen een halogene gas-permeabel membraan en een dekglaasje
Protocol
Voorbereiding
- Verzamel embryo's op standaard druivensap agarplaten 4. Het is handig om een geautomatiseerde Drosophila Egg Collector (flymax Scientific Equipment BV) te gebruiken. Met behulp van synchrone geënsceneerde embryo collecties zal het aantal dechorionations die moeten worden uitgevoerd om voldoende aantallen embryo's te verkrijgen bij de gewenste ontwikkelingsstadium te verminderen.
- Bereid een dechorionation dia door het aanbrengen van een stukje dubbelzijdige tape op een objectglaasje, verwijder de steun van de tape.
- De voorbereiding van de live-imaging kamer door het snijden van een stukje weefsel te pas....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Beschrijven we een nieuwe methode voor het bereiden Drosophila embryo's voor live-imaging-analyse, die we de opknoping druppel protocol. Helaas is het niet mogelijk om de opknoping druppel protocol te gebruiken bij het werken met een omgekeerde microscoop. In dit geval de daartussen techniek (zoals beschreven in de samenvatting hierboven) moet worden gebruikt en compressie van de embryo's blijft een punt van zorg.
In experimenten waar de cel vorm en grootte worden gemeten om krachten.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Wij dankbaar erkennen steun aan BHR door middel van een Discovery Grant als een research tools en Instrument Grant van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC). Erkennen wij ook H. Oda en de Bloomington Drosophila voorraad Centrum voor het aanbieden van genetische aandelen die werden gebruikt in het voorbeeld live-imaging sequenties.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
Standaard uitrusting en materialen die nodig zijn om embryo's voor te bereiden op live-imaging met behulp van de opknoping druppel protocol zijn de volgende items: microscoopglaasjes, dekglaasjes (22 x 40 mm, nr. 2), dubbelzijdig plakband, juwelier pincet (Dumont stijl nr. 5 ), halogene olie-serie 56 en serie 700 (Halocarbon Products Corp), een mes of een enkele rand scheermesje, tissue papier, schaar, gedestilleerd water, voor algemeen gebruik tape, en een pipet geschikt is voor het leveren van 20 tot 40 pl. De live imaging protocol vereist ook een custom-made live-imaging kamer. Dit wordt voorbereid door het snijden van een 5 mm denk polycarbonaat plastic folie aan de afmetingen van een standaard microscoop slide (75 x 25 mm) en met behulp van een rotor met een 3 mm diepe depressie te creëren in de foto (20 x 55 mm). Toegang tot een stereomicroscoop (dissectiemicroscoop) en een glasvezel-verlichting bron is ook vereist.
Referenties
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
- Schock, F., Perrimon, N. Cellular processes associated with germ band retracti....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
