Detectie van eiwit ubiquitinering

Samenvatting

Ubiquitinatie is een belangrijke posttranslationele modificatie uitgevoerd door een set van drie enzymen. Mutaties van genen die betrokken zijn in deze wijziging worden geassocieerd met vele verschillende ziekten bij de mens. We beschrijven hier protocollen aan eiwit ubiquitinatie te detecteren in gekweekte cellen In vivo En reageerbuizen In vitro.

Samenvatting

Ubiquitinatie, de covalente bevestiging van de polypeptide ubiquitine aan eiwitten richten, is een belangrijke posttranslationele modificatie uitgevoerd door een set van drie enzymen. Zij omvatten ubiquitine-activerend enzym E1, ubiquitine-conjugatie enzym E2 en E3 ubiquitine ligase. In tegenstelling tot bij E1 en E2, E3 ubiquitine ligasen weer te geven substraat specificiteit. Aan de andere kant, een groot aantal deubiquitylating enzymen hebben rollen in de verwerking polyubiquitinated eiwitten. Ubiquitinatie kan leiden tot een verandering van eiwitten stabiliteit, cellulaire lokalisatie en de biologische activiteit. Mutaties van genen die betrokken zijn bij de ubiquitinatie / deubiquitination pad of gewijzigd ubiquitine-systeem de functie worden geassocieerd met vele verschillende ziekten bij de mens, zoals verschillende soorten kanker, neurodegeneratie, en metabole stoornissen. De detectie van een veranderde of normale ubiquitinatie van target eiwitten kunnen voorzien in een beter inzicht in de pathogenese van deze ziekten. We beschrijven hier protocollen aan eiwit ubiquitinatie te detecteren in gekweekte cellen

Protocol

Detectie van eiwit ubiquitinatie in gekweekte cellen

1. Transfecteren gekweekte cellen met plasmiden uiting van de eiwit van belang en (epitoop-gemerkte versie van) ubiquitine.
2. Compleet te maken cellysis buffer (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) met 2 mM natrium orthovanadate, 50 mM natrium-fluoride, en proteaseremmers.
3. Lyse cellen met 100 pl cellysis buffer per plaat (6 cm schotel). Als er een grotere schotel wordt gebruikt, dienovereenkomstig aan te passen volume. Swirl de schotel voorzichtig te laten de lysis buffer bestrijken het gehele gebied van volwassen cellen.
4. Verzamel de cellen met een cel schraper en overdra....

Discussie

In deze presentatie hebben we voor het eerst beschreven stappen die toelaten het detecteren van ubiquitine modificatie op een eiwit van interesse in gekweekte zoogdiercellen. Met het oog op ubiquitinatie specifiek te sporen op het eiwit van belang, niet op non-covalent interagerende eiwitten, gebruikten we een strikte voorwaarde voor cellysis, immunoprecipitatie en wassen ^1,3. Ubiquitinatie, gedetecteerd door immunoprecipitatie van target eiwit in zulk een harde voorwaarde, gevolgd door anti-ubiquitine immuno.......