$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1) Voorbereiding voor microscopische chirurgie
- De chirurgische station moet schoon en ontsmet met een verdunde bleekwater oplossing vóór het instellen van instrumenten en accessoires materialen. Instrumenten zullen worden geautoclaveerd een dag voorafgaand aan de operatie en opgeslagen in een steriele container. Zet de Hot Bead sterilisator (Fine Science Tools) gebruikt om pathogenen en microbiële verontreinigingen te verwijderen uit instrumenten tussen de procedures op verschillende dieren.
- Sluit de thermische barrière gebruikt om de lichaamstemperatuur te handhaven tijdens de chirurgische procedure. Uiteengezet wattenstaafjes en gaasjes worden gebruikt om het bloeden te controleren. Bereid kleine (<2mm 3) stukken van Gel Foam om te worden gebruikt voor micro-hemostase en onder te dompelen in een steriele zoutoplossing.
- Plaats rat in een inductie-kamer en verdoven met Isofluraan (5% verdampt in zuurstof, stroomsnelheid 2,0 l / min). Verwijder de dieren van kamer naar de voorbereiding tafel en scheren een breed terrein van bont van de beoogde chirurgische veld. Veeg met 70% isopropyl alcohol te beginnen bij het midden van het veld en straalt naar buiten, gevolgd door schrobben met Polyhydroxidine Solution (Xenodine) op dezelfde manier. Herhaal deze volgorde wasbeurten 3 keer.
- Plaats dier op de thermische barrière, dek neus en mond met inhalatie kegel, te verminderen tot 3% isofluraan en debiet tot 0,2 L / min. Lever geschikte dosis van antibiotica (ampicilline) door de sub-cutane injectie en pijnstillende (Buprenorfine 0,05 mg / kg) door intramusculaire injectie.
- De chirurg zal schrobben hun handen met Xenodine oplossing en spoel na met water. Een steriele chirurgische jurk zal worden gemonteerd op de chirurg, handen worden gedroogd met een handdoek en steriel afgedekt met steriele handschoenen. Deze procedure is gevolgd voor elke chirurgische procedure zoals beschreven in deze tekst.
- Het deksel voor de steriele instrumenten zullen worden verwijderd door een assistent en instrumenten zullen worden aangelegd op een steriele die door de chirurg.
2) doorsnijding van PN tot degeneratie bevorderen
- Met het dier liggend op zijn kant maakt een rechte lijn incisie van de kop van het dijbeen naar de knie, waarbij parallel en ongeveer 3 mm van het dijbeen. Knip de oppervlakkige biceps femoris spieren langs dezelfde lijn als de huid incisie, de onderliggende musculus vastus lateralis bloot te leggen.
- Met een schaar een kleine snede in de vastus lateralis bij de knie en verlengen omhoog naar de kop van het dijbeen. Opnieuw met een schaar voorzichtig de vastus lateralis scheiden totdat de samengevoegde tibialis en n. peroneus takken van de nervus ischiadicus worden gevisualiseerd (parallel aan het dijbeen).
- Trace deze takken naar de kop van het dijbeen tot aan de hoofdstam van de n. ischiadicus is geïdentificeerd. Net onder de splitsing van de n. ischiadicus gebruiken fijne tang om zorgvuldig te scheiden bindweefsel (epineurium) rond de nervus tibialis tak (dit is de grotere tak).
- Eenmaal geïsoleerd slip een 6-0 zijden ligatuur rond de nervus tibialis en draai. Gebruik micro schaar om de zenuw rostraal van de ligatuur transect. Passeren de hechting lijn door de vastus lateralis spier-en stropdas af in een knoop. Dit zal een lijn voor het eenvoudig de locatie van het afgesneden uiteinde van de nervus tibialis als de zenuw is tot 7-10 dagen later worden geoogst.
- Degeneratie van de nervus tibialis voorafgaand aan de transplantatie biedt een omgeving beter geschikt is voor axonale groei dan doet een frisse zenuw voorbereiding.
- Sluit de vastus lateralis spier met 6-0 zijde hechtingen. Sluit de biceps femoris met 6-0 zijde hechtingen. Sluit de huid met Michel wond clips. Schakel de stroom van Isofluraan, verwijder dan de inademing neus en plaats dier in kooi op de thermische barrière en terug te keren naar huis kooi als het eenmaal is alert en actief.
3) Afschaffing van PN-segment
- Verdoven van dieren, scheren en reinigen van de beoogde chirurgische veld zoals hierboven beschreven (1.3). Leg het dier op thermische barrière.
- Verwijder de wond clips en een aparte eerdere huidincisie. Gesneden door de hechting van de oppervlakkige spieren te vastus lateralis bloot te leggen en dwars door hechtdraad in deze spier.
- Trace de hechting lijn tot het einde van tibialis gesneden en hechtdraad uit zenuw. Gebruik fijne tang om epineurium ontleden van een 15 mm lengte van de nervus tibialis en via deze distale einde te snijden. Verwijder de zenuw segment en onder te dompelen in steriele Hanks Balanced Salt Solution.
- Als dit een heteroloog graft experiment euthanaseren van het dier door intraperitoneale injectie van Euthasol. Als dit is een autologe transplantatie experiment, het been spieren en de huid gesloten is, zoals beschreven in 2.6) en het dier voorbereid voor cervicale dwarslaesie, zoals hieronder beschreven.
4) Cervicale hemisectie letsel en transplantatie
Dag 1
- Verdoven van dieren, scheren en reinig de intenDED chirurgische veld, zoals hierboven beschreven (1.3). Leg het dier op thermische barrière. Dien antibiotica en pijnstillers, zoals hierboven (1.4).
- Zoek de occipitale inkeping en de prominente T2 rugwervels proces en maken een incisie de volledige lengte tussen deze externe bezienswaardigheden. Snijden door de middellijn van het oppervlakkige trapezius spier en scheiden de onderliggende cervicale rhomboideus spieren. Uit elkaar te houden de spieren door het invoegen van een spreader.
- De diepe supraspinale spieren moet worden gesneden uit de rugwervels processen C4, C5 en C6. Met behulp van rongeurs het uitvoeren van een gedeeltelijke laminectomie C5 tot de gehele rechterkant en het mediale gedeelte van de linkerkant van het ruggenmerg bloot te leggen. Gebruik de prominente dorsale ader als een mijlpaal voor het ruggenmerg middellijn.
- Gebruik een micro-scalpel of een 30 gauge naald te doorboren de dura mater en de uitbreiding van de incisie over de C5 ruggenmerg. Maak een kleine incisie in de onderliggende subarachnoïdale en pia mater.
- Met een getrokken glas micro-canule beginnen de rug-, rechts van het ruggenmerg aspiraat, met behulp van zachte druk en micro-tang om het weefsel scheiden en de verwijdering ervan te vergemakkelijken. Ga verder door intermediaire en ventrale delen van het ruggenmerg naar een 2 mm lang holte die volledig is van dorsaal naar ventraal en van middellijn tot de laterale hersenvliezen te creëren.
- Plaats zoutoplossing gedrenkte gel schuim in de spouw te hemostase te bereiken.
- Verwijder het segment van de perifere zenuw uit de Hanks oplossing. Voorzichtig appose schil de epineurium van de proximale 3mm van de zenuw segment en daartoe aan de rostrale wand van de hemisectie laesie holte. Veilig het segment met 10-0 hechtdraad door de epineurium naar de dura mater, dan hechtdraad de dura gesloten over de geïmplanteerde einde van het transplantaat.
- Sandwich het transplantaat tussen de twee stukken van silastic membraan (Biobrane) voor de bescherming en gemakkelijke isolatie op een later tijdstip. Plaats naast de C6, C7 en T1 vertebrale processen. Niet appose het distale zenuw einde aan ruggenmerg of spierweefsel.
- Sluit de spieren in lagen met 4-0 hechtdraad en sluit de huid incisie met gewikkelde clips.
- Plaats dier in kooi op de thermische barrière en terug te keren naar huis kooi als het eenmaal is alert en actief.
Dag 21
- Verdoven van dieren, scheren en reinigen van de beoogde chirurgische veld zoals hierboven beschreven (1.3). Leg het dier op thermische barrière en het beheer van antibiotica en pijnstillers, zoals hierboven (1.4). Dwars door oppervlakkige hechtingen aan silastic membraan rond de zenuwtransplantaat bloot te leggen. Voorzichtig gratis de lengte van de zenuw uit de silastic membraan met behulp van fijn pincet en in het voorjaar schaar en reflecteren van het chirurgische veld.
- Voer een gedeeltelijke laminectomie aan de rechterkant van de C7 wervelkolom proces. Pierce de hersenvliezen als hierboven (4.4) en door aspiratie bereiden een 1 mm 3 dorsale kwadrant laesie holte in de C7 ruggenmerg. Gebruik zout doordrenkte gel schuim om hemostase te bereiken en dan met gel foam doordrenkt met chondroitinase ABC te vervangen. Behandel de laesie site voor 15 minuten, voor verse chondroitinase doordrenkte gel-schuim om de 5 minuten.
- Bedek de externe lengte van de zenuw transplantaat met Silastic membraan. Nauwe oppervlakkige spieren met 4-0 hechtingen en de huid incisie met gewikkelde clips. Plaats dier in kooi op de thermische barrière en terug te keren naar huis kooi als het eenmaal is alert en actief.
Dag 23
- Verdoven van dieren, scheren en reinigen van de beoogde chirurgische veld zoals hierboven beschreven (1.3). Leg het dier op thermische barrière en het beheer van antibiotica en pijnstillers, zoals hierboven (1.4). Dwars door oppervlakkige hechtingen aan silastic membraan rond de zenuwtransplantaat bloot te leggen. Niet verstoren het transplantaat, maar eerder bloot C7 ent site en gebruik een Hamilton spuit met getrokken glas canule aan 1μl van chondroitinase ABC microinject in de rechterkant van het ruggenmerg van ongeveer 1 mm distaal van de aanbrenging van graft het ruggenmerg.
- Haal voorzichtig het epineurium van het distale 2mm van de zenuw segment en appose daartoe aan de C7 laesie holte. Veilig het segment met 10-0 hechtdraad door de epineurium naar de dura mater.
- Nauwe oppervlakkige spieren met 4-0 hechtingen en de huid incisie met gewikkelde clips. Plaats dier in kooi op de thermische barrière en terug te keren naar huis kooi als het eenmaal is alert en actief.
5) Elektrofysiologische opname van actiepotentiaal in transplantaatoverleving en distale ruggenmerg
- Om te bepalen of elektrische activiteit wordt overgedragen via axonen die geregenereerd in de PNG moeten we eerst bloot te leggen en te isoleren van de graft. Speciale aandacht moet worden genomen tijdens deze procedure om te voorkomen dat fysiek schade aan de graft en dit is waar het gebruik van Silastic membraan na plaatsing van het transplantaat belangrijk is. Verdoven van dieren, scheren en reinigen van de beoogde chirurgische veld zoals hierboven beschreven (1.3). Plaats stee dier op thermische barrière.
- Na het openen van de huid en scheiden oppervlakkige spieren, zijn Silastic membraan strips geïdentificeerd en zorgvuldig ontleed vrij van het transplantaat.
- Met behulp van rongeurs verwijder de rugwervels proces onmiddellijk rostraal en caudaal van de PNG-ruggenmerg appositie sites. Zorg ervoor dat u het transplantaat te veel storen tijdens deze aanpak. Maak een gleuf in de dura mater op beide niveaus.
- Ongeveer 1 cm rostraal van de C5 graft-ruggenmerg appositie website plaatst u een enkele draad (platina-iridium mix) het stimuleren van elektrode in het ruggenmerg ipsilaterale aan de laesie, tot een diepte van ongeveer 1 mm. Til het middelste gedeelte van het transplantaat op een bipolaire verslaafd elektrode. Zorg voor een stimulerende impulsen van 10μA met 100μsec duur en bepalen of er actie potentialen reis door axons die geregenereerd in het transplantaat.
- Schakel de aansluitingen en de positie van draden, zodat de aangesloten elektrode wordt de stimulerende elektrode en de enkele draad is ingebracht in het ruggenmerg distaal van de aanbrenging van PNG aan het ruggenmerg en de poging om actiepotentialen record in het ruggenmerg.
- Aan het eind van het experiment een trein van 1mA stimuli voor 100μsec duur op 50Hz, voor een totaal van 1 uur. Later euthanaseren dieren 1 uur, perfuseren met 4% paraformaldehyde en proces ruggenmerg weefsel voor de immunocytochemische detectie van CFO's in neuronen die werden geactiveerd door geregenereerd axonen in de PNG.
6) Retrograde de etikettering van neuronen die regenereren axonen in de PNG-en anterograde de etikettering van axonen die terug te regenereren in het ruggenmerg
- Voor dieren die niet getest door elektrofysiologische maatregelen is het mogelijk om de bron van de axonen die groeien in het transplantaat en het verloop van de beëindiging in het ruggenmerg. Verdoven van dieren, scheren en reinigen van de beoogde chirurgische veld zoals hierboven beschreven (1.3). Leg het dier op thermische barrière en bloot de PNG, zoals beschreven in 6.1 hierboven.
- Gebruik micro schaar om door het transplantaat cut op zijn mid-point en terug strook van de epineurium van de uiteinden van het transplantaat. Reflect de uiteinden uit elkaar en leg elk op een apart vel Parafilm.
- Plaats een tampon van gel foam doordrenkt met True Blue op het proximale afgesneden uiteinde een label neuronen die een axon bijgedragen aan de PNG. Plaats een tampon gel schuim gedrenkt in gebiotinyleerd dextran amine (BDA) op het distale afgesneden uiteinde een label axonen die zich uitstrekken van het transplantaat terug in het ruggenmerg.
- Euthanaseren dieren 3-4d later, perfuseren met 4% paraformaldehyde en proces hersenen en het ruggenmerg weefsel voor TL-microscopie voor True Blue label neuronen of voor de BDA histochemie voor het label axonen.
7) borstkas volledige doorsnijding letsel en transplantatie
Dit biedt een alternatieve benadering van de cervicale hemisectie letsel model hierboven. Hier een meer ernstige, bilaterale letsel wordt geproduceerd en segmenten van de perifere zenuwen zijn geplaatst in de laesie holte overspanning en rostrale en caudale stompen van de geblesseerde ruggenmerg.
Dag 1
- Verdoven van dieren, scheren en reinigen van de beoogde chirurgische veld zoals hierboven beschreven (1.3). Leg het dier op thermische barrière. Dien antibiotica en pijnstillers, zoals hierboven (1.4).
- Identificeer T12 wervel niveau op het punt van het inbrengen van rib. Maak de huid incisie vanaf dit punt rostraal dan wervel processen T11, T10 en T9. Knip oppervlakkige fascia door supraspinale spieren gehecht aan deze drie processen.
- Voer volledige laminectomie van de T10 wervel proces (bovenliggende T12 ruggenmerg segment). Gebruik een micro-scalpel of een 30 gauge naald te doorboren de dura mater en de uitbreiding van de incisie over de T12 ruggenmerg. Maak een kleine incisie in de onderliggende subarachnoïdale en pia mater.
- Met een getrokken glas micro-canule beginnen met de T12 ruggenmerg bilateraal aspireren, met behulp van zachte druk en micro-tang om het weefsel scheiden en de verwijdering ervan te vergemakkelijken. Ga verder door intermediaire en ventrale delen van het ruggenmerg naar een 3 mm lang holte die is compleet dorsaal van ventrale en tussen de laterale hersenvliezen te creëren.
- Gebruik zout doordrenkte gel schuim om hemostase te bereiken en dan met gel foam doordrenkt met chondroitinase ABC te vervangen. Behandel de laesie site voor 15 minuten, voor verse chondroitinase doordrenkte gel-schuim om de 5 minuten.
- Verwijder het segment van de perifere zenuw uit de oplossing van de Hank s. Voorzichtig weerspiegelen de epineurium van de proximale 4mm van de zenuw segment en snijd een lengte van het elastische passen tussen de rostrale en caudale stompen van de ene kant van het ruggenmerg. Plaats een tweede segment naast de eerste geënt segment, apposed naar de andere kant van het ruggenmerg. Suture de dura gesloten over de geïmplanteerde implantaten en bedek dura met een kleinestuk van silastic membraan.
- Sluit de spieren in lagen met 4-0 hechtdraad en sluit de huid incisie met gewikkelde clips.
- Plaats dier in kooi op de thermische barrière en terug te keren naar huis kooi als het eenmaal is alert en actief.
Dag 3
- Verdoven van dieren, scheren en reinigen van de beoogde chirurgische veld zoals hierboven beschreven (1.3). Leg het dier op thermische barrière en het beheer van antibiotica en pijnstillers, zoals hierboven (1.4). Dwars door oppervlakkige hechtingen aan silastic membraan bovenliggende het transplantaat website bloot te leggen. Niet verstoren het transplantaat, maar eerder bloot het ruggenmerg caudaal van het transplantaat en het gebruik van een Hamilton spuit met getrokken glas canule aan 1μl van chondroitinase ABC microinject in elke kant van het ruggenmerg van ongeveer 1 mm distaal van de aanbrenging van graft het ruggenmerg.
- Nauwe oppervlakkige spieren met 4-0 hechtingen en de huid incisie met gewikkelde clips. Plaats dier in kooi op de thermische barrière en terug te keren naar huis kooi als het eenmaal is alert en actief. Voer elektrofysiologische stimulatie en opname-en tracer de etikettering, zoals beschreven in 5) en 6) hierboven.
8) representatieve resultaten
Wanneer deze procedure is geoptimaliseerd de perifere zenuw segment zal nauw te integreren met de gastheer ruggenmerg. Stijgende en dalende ruggenmerg axonen zal in het transplantaat, groeien in een relatief rechte lijn parallel aan de lengte van het transplantaat en uit te breiden tot het distale einde van het transplantaat met een snelheid van ongeveer 1 mm per dag. Bij het bereiken van het distale uiteinde, zal axonen dringen de aangrenzende ruggenmerg als chondroitinase is gebruikt om de remmende proteoglycanen te verwijderen uit de omliggende littekenweefsel. Functionele connectiviteit zal worden bepaald door elektrofysiologische en immunocytochemische detectie van een reactie van het ruggenmerg neuronen bij prikkeling van de axonen in het transplantaat. Anatomische correlatie voor functioneel herstel zal worden beoordeeld door het opsporen van het aantal en de lengte van de axonen die hebben uitgebreid terug voorbij de zenuwtransplantaat in het ruggenmerg.