Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Samenvatting

Selectie, micro-injectie, en de beeldvorming van fluorescent-gelabeld F-actine via fluorescentie microscopie spikkel (FSM).

Samenvatting

In dit protocol beschrijven we het gebruik van TL-Speckle Microscopy (FSM) om hoge-resolutie afbeeldingen van actine dynamiek vast te leggen in PtK1 cellen. Een uniek voordeel van FSM is de mogelijkheid om de beweging en de omzet kinetiek (montage / demontage) van de F-actine-netwerk vast te leggen in levende cellen. Deze techniek is vooral handig bij de afleiding van kwantitatieve metingen van F-actine dynamiek wanneer gecombineerd met computer vision software (qFSM). We beschrijven de selectie, micro-injectie en visualisatie van fluorescerende probes actine in levende cellen. Belangrijk is dat soortgelijke procedures zijn van toepassing op het visualiseren van andere macomolecular assemblages. FSM is aangetoond voor microtubuli, intermediaire filamenten, en hechting complexen.

Protocol

Deel 1: Het verkrijgen van uw fluorescent gelabelde actine voor FSM

Materialen die nodig zijn: gezuiverd actine, fluorofoor (Alexa, X-rhodamine aanbevolen). G-buffer, ultracentrifuge

1. Een belangrijk onderdeel voor het verwerven van een goede FSM films is de juiste etikettering van actine (of andere cytoskeleteiwitten) met de fluorofoor van uw keuze.
   Wij raden u aan fluoroforen van Alexa (488, 568 golflengten) en X-rhodamine succinimidylester derivaten die lysineresiduen richten blootgesteld op het oppervlak van actine.
2. Bij de keuze van uw fluorofoor en de juiste golflengte, zorgen ervoor dat uw microscoop instel....

Discussie

Een aantal belangrijke factoren van cruciaal belang zijn voor het succesvol behalen van spikkel beelden, hoe goed spikkels beginnen en eindigen met de kwaliteit van uw fluorescent gelabelde actine. Een hoge verhouding tussen de etikettering van kleurstof tot actine monomeren, die rond 0,4 tot 0,7 zal ervoor zorgen dat spikkels zal verschijnen helder en discreet, terwijl de gelabelde eiwit zelf moet oplosbaar en vrij van aggregaten. Even belangrijk is de micro-injectie procedure. Om ervoor te zorgen normale cel homeostas.......

Materialen

Injectie buffer (IB)
50 mM kalium glutamaat
0,5 M MgCl2 (bijlage 2A)
Sla tot 2 jaar bij -20 ° C

 

G-buffer
2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8.0 (bijlage 2A)
0,2 mM CaCl2 (bijlage 2A)
Voeg vlak voor gebruik:
0,2 mM ATP (zie recept voor 100 mM)
0,5 mM 2-mercaptoethanol

Sla tot 1 dag bij 4 ° C