Snelle en gevoelige colloïdaal Coomassie G-250 Kleuring voor Eiwitten in polyacrylamidegels

Samenvatting

Deze video zal populariseren een colloïdale Coomassie G-250 kleuringsprotocol volgens Kang Et al.. Voor de detectie van gemiddeld 4 ng eiwit in gels. De kleuring is binnen twee uur en zonder enige inspanning. We routinematig gebruik van Kang's protocol voor analytische doeleinden in gel op basis van proteomics.

Samenvatting

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is een kleurstof gebruikt voor de visualisatie van eiwitten gescheiden door SDS-PAGE, het aanbieden van een eenvoudige procedure kleuren en een hoge kwantificatie. Bovendien is het volledig compatibel met massaspectrometrische eiwit identificatie. Maar ondanks deze voordelen, is het CBB beschouwd worden minder gevoelig dan zilver of fluorescentie kleuringen en dus zelden gebruikt voor de detectie van proteïnen in de analytische gel op basis van proteomics benadering.

Diverse verbeteringen van de oorspronkelijke Coomassie protocol ¹ zijn gedaan om de gevoeligheid van de CBB te verhogen. Twee belangrijke wijzigingen werden ingevoerd om de detectie van lage-overvloedige eiwitten te verbeteren door het omzetten van de kleurstof moleculen in colloïdale deeltjes: In 1988, Neuhoff en collega's toegepast 20% methanol en hogere concentraties van ammonium sulfaat in het CBB G 250-gebaseerde kleuroplossing ^2, en in 2004 Candiano et al.. opgericht Blue Silver met behulp van CBB G-250 met fosforzuur in de aanwezigheid van ammoniumsulfaat en methanol ^3. Toch zijn al deze aanpassingen maar laat een detectie van ongeveer 10 ng eiwit. Een breed fameless protocol voor het colloïdale Coomassie kleuring werd gepubliceerd door Kang et al.. In 2002, waar ze aangepaste colloïdaal CBB Neuhoff's kleuringsprotocol ten aanzien van de complexvormers stoffen. In plaats van ammoniumsulfaat ze gebruikt aluminiumsulfaat en methanol werd vervangen door de minder toxische ethanol ^4. De nieuwe aluminium-gebaseerde vlekken in de studie van Kang's toonde superieure gevoeligheid die detecteert zo laag als 1 ng / band (fosforylase b) met weinig gevoeligheid variëren afhankelijk van eiwitten.

Hier tonen we de toepassing van het protocol Kang's voor een snelle en gevoelige colloïdale Coomassie kleuring van eiwitten in analytische doeleinden. We illustreren de snelle en gemakkelijke protocol met behulp van twee-dimensionale gels routinematig uitgevoerd in onze werkgroep.

Protocol

Deel 1: Twee-dimensionale (2-D) gelelektroforese met cup-loading

1. IPG-strip rehydratie en iso-elektrische focussering (IEF)
   • Hydrateren Immobiline DryStrip gels, pH 6-11 (7 cm) in 125 ul rehydration solution [7 M ureum, 2 M thio, 4% CHAPS, 50 mM hydroxyethyldisulfide en 2% IPG Buffer pH 6-11] met behulp van Immobiline DryStrip Reswelling Lade voor ten minste 10 uur.
   • Los neergeslagen eiwitmonster in IEF monsterbuffer [7 M ureum, 2 M thio, 2% CHAPS, 2% ASB-14, 50 mM hydroxyethyldisulfide en 2% IPG Buffer pH 6-11] die overeenkomt met 60-100 ug eiwit per 100 ul .
   • Na solubilisatie (ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur), van toepassing eiwitmonster via anodische cup-laden met sample cups. Het volume van de beker is 100 pi (Manifold bekers laten tot 150 pi).
     Opmerking: u kunt laden grotere steekproef in aanmerking nemen indien u een laagspannings-stap aan het begin van de focus protocol en vul de beker, terwijl er nog een vloeistof film in de beker!
   • Voer iso-elektrische focussering voor 11,1 KVH in de gradiënt-modus in de Multiphor II Electrophoresis Unit.
2. Evenwicht en SDS-PAGE
   • Na het IEF, werden de IPG-strips onderworpen aan reductie en alkylering, elke keer 15 minuten op een shaker, met behulp van 1% en 2,5% dithiothreitol joodacetamide respectievelijk equilibratie oplossing [50 mM Tris-HCl/pH 8,8, 6 M ureum, 30% glycerol en 2% SDS].
   • Spoel de geëquilibreerd strips met H ₂ O en blot ze op Whatman papier om overtollig equilibratiebuffer te verwijderen. Daarna duik de strips in SDS-running buffer (1x).
   • Tweede dimensie is uitgevoerd door SDS-PAGE op een verticale elektroforese systemen met een totale acrylamide concentratie van 12%. Het evenwicht IPG-strips werden geplaatst op de top van de scheidende gels en vastgezet met hete agarose oplossing [0,5% agarose in rijklare buffer met broomfenolblauw].
   • Eiwitten zijn gescheiden voor 2,5 uur, te beginnen bij 80 V gedurende 15 minuten gevolgd door 120 V tot de kleurstof front bereikt de onderkant van de gel cassette.

Deel 2: Colloidal Coomassie kleuring met CBB G-250

1. Kleuroplossingen
Let op: voor de voorbereiding van de kleuring oplossingen, chemicaliën te gebruiken met een hoge kwaliteit, zoals pa (pa) en water van hoge zuiverheid als je van Millipore systemen (Milli-Q water).

Coomassie oplossing:		ad 2000 ml H 2 O
0,02% (w / v)	CBB G-250	0,4 g
5% (w / v)	aluminiumsulfaat-(14-18)-hydraat	100 g
10% (v / v)	ethanol (96%)	200 ml
2% (v / v)	fosforzuur (85%)	47 ml

Let op: voor de voorbereiding van de kleuroplossing, de sequentiële toevoeging van de componenten in de volgende volgorde moet worden gehandhaafd:

1. eerst opgelost aluminiumsulfaat in Milli-Q water
2. daarna toe te voegen ethanol, homogeniseren, en mix CBB G-250 aan de oplossing
3. zoals onlangs als de oplossing volledig is opgelost, voeg fosforzuur (de opname van het zuur aan de alcoholische media laat de Coomassie moleculen aggregaat in hun colloïdale toestand)
4. eindelijk vullen met Milli-Q water

Let op: de uiteindelijke kleuroplossing heeft een donkere groen-blauwachtige uitstraling en is vol van deeltjes zwemmen rond:

• Niet filtraat deze oplossing!
• Als u de volgorde van voorbereiding, zou je een meer violet-blauw oplossing die minder gevoelig is.

Ontkleuroplossing:		ad 2000 ml H 2 O
10% (v / v)	ethanol (96%)	200 ml
2% (v / v)	fosforzuur (85%)	47 ml

2. Kleuringsprocedure

• Na de tweede dimensie scheiding, verwijder voorzichtig de gels uit de glasplaten en breng ze in een kleuring schaal gevuld met Milli-Q water.
• Was de gels drie keer met Milli-Q water gedurende 10 minuten op een horizontale shaker (onvoldoende wassen veroorzaakt een slechte gevoeligheid omdat de resterende SDS op de gels verstoort het selectiekader van de kleurstof aan het eiwit).
• Schud de Coomassie-oplossing voor gebruik gelijkmatig verspreiden van de colloïdale deeltjes.
• Incubeer de gels goed bedekt met de Coomassie oplossing door roeren op een shaker voor 2-12 uur. Deze vlekken genereert marginale achtergrond, zodat u kunt zien de vlekken vooruitgang in tussen.
  Let op: na 10 minuten zie je eerste eiwit plekken verschijnen, binnen 2 uur incubatie ongeveer 80% vlekken tes maximale niveau is voltooid. Voor bijna 100% kleuring, wordt een nacht incubatie aanbevolen. In sommige gevallen, wanneer de hoeveelheid eiwit te worden gemerkt enorm is en de oplossing verandert in een helder blauw, een refresh van de kleuring oplossing nodig is.
• Na de kleuringsprocedure verwijder de Coomassie-oplossing en spoel twee keer de gels met Milli-Q water.
  Opmerking: u kunt de kleuroplossing hergebruik, zolang deeltjes zijn nog steeds blijven, anders gooi hem (in gedachten houden dat uw laboratorium kan speciale regelgeving voor afvalverwijdering hebben).
• Verwijder plakken kleurstof deeltjes uit de kleuring schotel met een niet-pluizende papieren handdoek en destain voor 10 - 60 minuten.
  Opmerking: U kunt ook de gels wassen alleen met Milli-Q water, maar we raden alleen voor preparatieve gels omdat er een onregelmatige, zwakke Coomassie film laatst op de gels die zullen ontstaan ​​tijdens het scannen procedure.
• Tenslotte twee keer spoelen de gels met Milli-Q water: de gels hun oorspronkelijke dikte te bereiken (de alcohol-zuur media maakt de gels krimpen) en neutralisatie in het water bovendien verbetert Coomassie de kleur van intensiteit.

Deel 3: Representatieve resultaten

Als u de beschreven protocol hiervoor krijgt u op uw 2-D gel onderscheidende oplossing en goed gekleurd donkerblauw eiwit vlekken. Zelfs in vergelijking met een 2-D gel gekleurd met zilver volgens Shevchenko et al.. ^Vijf, een protocol beweert goede gevoeligheid en compatibiliteit met massaspectrometrie, bereiken we gelijk kleuringen.

Figuur 1: uiteindelijke resultaat van het experiment zoals hierboven beschreven. Kang's Coomassie protocol (A) voert sterk als de zilverkleuring volgens Shevchenko et al.. (B) bij het ​​opsporen van eiwitten na 2-D gel elektroforese.

Deel 4: Tips en trucs

• Doe een aantal testen kleuringen voor het verwerken van uw eigen monsters. Om onverklaarbare redenen meldden we wel eens dat een eiwit van belang niet met succes zou kunnen worden ontdekt, zelfs wanneer milligram werden toegepast. In dit geval raden wij u aan een aantal verdunningsreeks voor te bereiden om de gevoeligheid te testen.
• Als u een lage in-gel detectie van eiwit (s) in het algemeen, mislukte transfer van het stapelen van de scheiding van gel tijdens de SDS-PAGE zal mogelijk de reden. U kunt controleren voor dergelijke plakkerige eiwitten door het kleuren van de volledige gel met inbegrip van het stapelen gebied.
• Voor een snelle controle van uw iso-elektrische focussering resultaten, kunt u direct vlekken op de IPG-strips, zonder enige verdere tweede dimensie scheiding.
• Af en toe draai de gels tijdens de kleuringsprocedure, zodat ze gelijkmatig in lood van beide kanten (als je de gels onbewogen, de kleurstof maar bindt zich aan een kant van de gel).
• We ervaren dat de opslag van de kleuring oplossing in een donkere fles verhoogt de levensduur van de (in doorzichtige flessen tot 4 maanden).
• Na kleuring en documenteren kunt u de gels te houden in de koelkast gedurende enkele jaren (als u toevoegt zure oplossing die u voorkomen dat besmettingen door schimmels).
• Ontkleuroplossing gel pluggen voor een tryptische digest kan worden versneld door opwarming in een blok verwarming.

Discussie

Innovatieve of gewoon een andere Coomassie protocol?

Op dit moment bestaan ​​er verschillende protocollen voor kleuringen met Coomassie Brilliant Blue. De meesten van hen het gevolg zijn van kleine of grote wijzigingen van een van de meest gebruikte protocollen door Neuhoff en collega's ^2. Ook Kang's protocol op basis van formule Neuhoff's. Maar is het echt een alternatief Coomassie kleuring methode voor proteomics onderzoek? We zullen foto twee belangrijke kwesties, d...

Materialen

Naam van het product	Vennootschap	Catalogus Nee.	Reacties
Voor IEF en SDS-PAGE:
Immobiline DryStrip gels	GE Healthcare	17-6001-94	Kan zelfs gebruikt worden 2 jaar na vervaldatum.
Immobiline DryStrip Reswelling Tray	GE Healthcare	80-6371-84	Niet schoon met organische oplosmiddelen. Ontworpen voor 7-18 cm IPG-strips.
Immobiline DryStrip Kit	GE Healthcare	18-1004-30	Inclusief een lade, lastang, anode en kathode elektroden, aligner en sample cup bar en proef de cups.
EPS 3501 XL Power Supply	GE Healthcare	18-1130-05	Levert spanning tot 3500 V.
Multiphor II elektroforeseapparaat	GE Healthcare	18-1018-06	Beweegbare elektroden kan IEF in IPG stroken van alle lengte (7-24 cm IPG-strips)
PerfectBlue gel systeem Twin S	Peqlab	45-1010-C	SDS-PAGE in 10x10 cm mini-gel-formaat. Gel kamer is voorzien van een koelsysteem.
Voor colloïdaal Coomassie G-250 kleuring:
vlekken gerechten met deksels	VWR	216-3412	Past voor mini-gels. Stapelbaar op de shaker.
aluminiumsulfaat-18-hydraat	Merck	1.01102.5000	We hebben de beste ervaring met Merck. Alleen beschikbaar in 5 kg pakket.
orthofosforzuur	Prolabo	20 624.295	Verkocht in glazen flessen.