Denaturerende ureum polyacrylamidegelelektroforese wordt gebruikt voor het enkelstrengs DNA gescheiden of tot RNA tot een limiet van 500 nucleotiden. Ureum in combinatie met de hitte gedenatureerd monsters en ongestructureerde enkele strengen migreren binnen de gel matrix op basis van hun moleculair gewicht.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Denatureren Ureum polyacrylamide gel elektroforese (Urea PAGE)
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ureum PAGE of denaturering ureum polyacrylamidegelelektroforese maakt gebruik van 6-8 m ureum, waar secundaire DNA of RNA-structuren gedenatureerd en wordt gebruikt voor hun scheiding in een polyacrylamide gel matrix op basis van het molecuulgewicht. Fragmenten van 2 tot 500 basen, met een lengte verschillen zo klein als een single nucleotide, kunnen worden gescheiden met behulp van deze methode 1. De migratie van het monster is afhankelijk van de gekozen acrylamide concentratie. Een hoger percentage van polyacrylamide lost een lager molecuulgewicht fragmenten. De combinatie van ureum en temperaturen van 45-55 ° C in de gel run zorgt voor de scheiding van ongestructureerde DNA of RNA-moleculen.
In het algemeen is deze methode nodig om te analyseren of te zuiveren enkelstrengs DNA of RNA-fragmenten, zoals gesynthetiseerd of gelabelde oligonucleotiden of producten van enzymatische splitsing reacties.
In deze video artikel tonen we hoe voor te bereiden en uit te voeren de denaturering ureum polyacrylamide gels. Technische tips zijn opgenomen, in aanvulling op het oorspronkelijke protocol 1,2.
Protocol
De volledige en gedetailleerde tekst protocol voor dit experimentele procedure is beschikbaar in Current Protocols in Molecular Biology. Gedetailleerde stap-voor-stap instructies voor de montage van de gel-sandwich en voor gel apparatuur is te vinden op de website van BioRad 3.
Benodigde apparatuur:
Glasplaten (binnenste en buitenste)
10 cm cel: 10,1 x 7,3 cm (binnenste plaat), 10,1 x 8,2 cm (buitenste plaat), BioRad
20 cm cel: 20 x 20 cm (binnenste plaat), 20 x 22,3 cm (buitenste plaat), BioRad
0,5-1,5 mm gel kam en spacers
Gel gieten stand
Gel apparaten met deksel en kabels
Hoo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
- De band scherpte hangt af van verschillende factoren. Het volume van het monster geladen voor een scherpe bands moet zo klein mogelijk, dat wil zeggen idealiter tussen 1-5 pl. Echter, tot en met 15 ul worden geladen die nog steeds acceptabele oplossing zorgt. Minder monstervolume resulteert in scherpere bands.
- De band kwaliteit is ook afhankelijk van de dikte van gel. Dunnere gels, zoals 0,75 mm tonen betere resultaten dan 1,5 mm dik gels.
- De vorm van banden kunnen ook worden beïnvloed tijdens het laden van gel, als.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te melden.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Singapore Academic Research Council (ARC) [subsidie nummer 90/07]. Wij danken radiodurans voor de steun.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Referenties
- Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).
- Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Curr ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
