Voorbereiding en Cultuur van Rat Lens Epitheliale Explantaten voor het bestuderen van terminale differentiatie

Samenvatting

Explantaten van de centrale regio van de rat lens epitheel synchroon te onderscheiden wanneer gekweekt in de aanwezigheid van FGF-2. Immunofluorescentie microscopie van dergelijke culturen kan verschaft nieuwe informatie over de genexpressie en signalering afspraken verbonden aan terminale differentiatie.

Samenvatting

De voorste oppervlak van de ooglens is bedekt met een monolaag van epitheliale cellen, die prolifereren in een ringvormige zone ten grondslag liggen aan het corpus ciliare. Volgende indeling, deze cellen migreren naar achteren, waar FGF verspreiden van het netvlies leidt hen om te differentiëren in een achterste reeks van langwerpige lens vezels cellen, die het grootste deel van de lens samen te stellen. Differentiatie van lens epitheel cellen die in de lens van vezels kan worden geïnduceerd in vitro door het kweken van explantaten van de centrale regio van de voorste epitheel in de aanwezigheid van FGF-2. Explantaten zijn bereid uit lenzen van de neonatale ratten door het verwijderen van de lens van het oog en grijpen de lenskapsel aan de achterzijde met het ontleden van een pincet. De achterste kapsel is dan voorzichtig opengereten en drukte beneden in de plastic bodem van een weefselkweek schotel. De perifere regio's van de explantatie worden verwijderd met een scalpel en het centrale gebied wordt vervolgens gekweekt in de aanwezigheid van 100ng/ml FGF-2 voor zo lang als 2-3 weken, afhankelijk van de te onderzoeken parameters. Sinds epitheliale cellen in gekweekte explantaten onderscheiden bij benadering synchroon gedurende een periode van dagen tot weken, kan het tijdsverloop van signalering en genexpressie worden bepaald met behulp van moleculaire, biochemische en farmacologische technieken. Immunofluorescentie microscopie is een krachtige aanvulling op deze methoden aangezien het aantoont de subcellulaire lokalisatie van eiwitten van belang en kan onthullen de fysiologische gevolgen van de experimentele manipulaties van signaalwegen.

Protocol

Deel 1: Het verwijderen van lenzen

Materialen en reagentia:

1. Micro-ontleden schaar, gebogen, stompe uiteinden, (zoals as.RS-5983, Roboz Surgical Instrument Co, Inc, Gaithersburg, MD), micro-pincet ontleden, gebogen tip (zoals Roboz # RS5137).
2. Vering medium: Medium 199 met 0,1% bovine serum albumine, 100 eenheden / ml penicilline, streptomycine 100μg/ml, 2,5 ug / ml amfotericine B. Reagentia zijn verkrijgbaar bij Invitrogen, Carlsbad, CA.

Procedure:

1. Euthanaseren pasgeboren ratten (leeftijd 2-4 dagen) in overeenstemming met de richtlijnen die door de National Institutes of Health, Bethesda, MD.
2. Verwijder de oogleden met chirurgische schaar. Druk zachtjes met gebogen pincet aan weerszijden van de oogkas aan het oog naar buiten kracht bobbel. Maak een kleine incisie aan de achterzijde van het oog met de schaar. Door te drukken met een pincet tegen de zijkant van het oog tegenover de incisie, kan de lens en een kleine hoeveelheid aangesloten glasachtig lichaam dan gedwongen worden uit door de breuk, waardoor de lens te worden opgehaald met gebogen pincet. Zorg ervoor dat u niet aan de lenskapsel te breken.
3. Gebruik de gebogen pincet om de lenzen te dragen aan een 60mm plastic weefselkweek schotel met 5 ml warm, steriele suspensie medium.

Deel 2: Microdissection van explanten

Materialen en reagentia:

1. Micro ontleden pincet, 0,1 mm tips, (zoals Roboz RS-4976). We maken gebruik van Dumostar legering vanwege de flexibiliteit van de tip, maar ook andere staal legeringen zijn ook aanvaardbaar. Pincet met tips dunner dan 0,1 mm worden niet aanbevolen, omdat ze de neiging te breken of buigen tijdens deze procedure.
2. Vering medium (zie deel 1)
3. Unsupplemented Ham's F12 medium of Medium 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA)

Procedure:

1. De volgende stappen dienen te worden uitgevoerd in een schone, tochtvrije omgeving met steriele ontleden tools en steriel medium.
2. Met behulp van een stereo-dissectiemicroscoop, het reinigen van de lenzen van een hechtende weefsel met de 0,1 mm tip pincet en overbrengen naar een tweede 60mm cultuur schotel met 5 ml steriele suspensie medium (deze stap helpt om de verontreiniging te verminderen). Met de pincet, de overdracht het gewenste aantal lenzen met een 35mm cultuur schotel met 5 ml steriel, unsupplemented medium. (We maken vaak gebruik van Ham's F12 (Invitrogen) voor deze stap, omdat de lagere kleurstof concentratie maakt dissectie makkelijker, maar Medium 199 is ook aanvaardbaar geen antibiotica of andere toevoegingen zijn nodig tijdens deze stap..) Maar liefst 12 explanten kan worden gemaakt in het midden van een schotel deze omvang. Er moet echter een 35 mm schaal worden gebruikt, zelfs als er minder explanten moeten worden gemaakt, omdat het ontleden tools kunnen niet gemakkelijk worden gemanipuleerd in een kleinere schaal. Breng het gerecht met de rest van lenzen voor een weefselkweek incubator bij 37 ° C tot ze nodig zijn.
3. Identificeer de achterzijde van de lens. Er zijn vele manieren om dit te herkennen: 1) De achterste is ronder dan de voorste, die enigszins is afgevlakt, 2) De pasgeboren rat lenzen vorm koud staar als ze afkoelen tot kamertemperatuur gedurende de dissectie. Als de koude cataract is niet volledig gevuld de lens, de achterste is de kant die het verst van de ondoorzichtige regio. Als de dekking is de lens gevuld, opwarming van de schotel naar 37 ° C voor een paar minuten zal keren. De achterzijde kan worden geïdentificeerd als de cataract hervormingen bij afkoeling. 3) Sporen van de tunica vasculosa lentis kan zichtbaar zijn op de achterzijde. 4) De achterste hechting kan zichtbaar zijn op de achterzijde. Het identificeren van de achterzijde juist essentieel is, omdat dit is waar de capsule zal worden geopend. Het openen van de lens op de voorste zijde zal scheuren het epitheel.
4. Zodra de achterzijde is geïdentificeerd, omhoog draaien en pak de lens in de linker pincet (voor een rechtshandige werknemer). Dan knijpen de achterste kapsel met de juiste pincet om een ​​kleine vouw te produceren.
5. Terwijl u de achterste kapsel met de juiste pincet, pak de plooi van de linker-capsule met pincet en trek de twee paren van een pincet in tegengestelde richtingen om een ​​kleine scheur in de capsule te maken.
6. Pak de rand van het intrekken capsule met het pincet, trek hem naar beneden, eerst aan de ene kant, dan aan de andere kant en druk het in het plastic van de schaal met de pincet. Herhaal dit een paar keer, het verplaatsen van alle rond de evenaar van de lens, totdat de capsule is stevig aan de plaat op vele punten. Houd de capsule op zijn plaats met de linker pincet, schud de vezel massa met het recht pincet om de hechting tussen de vezels cellen en epitheelcellen in de lens evenaar te breken. Vervolgens weg te duwen van de vezel massa, te rollen uit de capsule / epitheel, die nog steeds aan de onderkant van deschotel. Herhaal dit proces met alle lenzen in de schotel. Verwijder de vezel massa's (of sla ze op bevroren als een bron van lens eiwitten voor andere studies).

Deel 3: Microdissection en de cultuur van de centrale explanten

Materialen en reagentia:

1. Steriele scalpel, # 15 blade, (Cincinnati chirurgische Co Cincinnati, OH)
2. Steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing met calcium en magnesium (Invitrogen, Carlsbad, CA)
3. Kweekmedium: Schorsing medium met 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc St Louis, MO).

Procedure:

1. Met behulp van een steriel scalpel, trim weg van de perifere epitheel (PE), die cellen bevat in de vroege stadia van differentiatie (figuur 1A), waardoor er een centraal plein van ongeveer 2,0 mm op een zijkant, die bestaat uit de centrale epitheliale cellen alleen (CE) (figuur 1B).
2. Overdracht het schaaltje met de centrale explantaten om een ​​bioveiligheid kast. Was drie keer met steriele PBS dat calcium en magnesium en een keer met 1 ml van de verse, in evenwicht gebracht (37 ° C, 5% CO ₂₎ ophanging medium. Deze wast sterk verminderen de kans op besmetting.
3. Voeg 2 ml van de cultuur medium tot differentiatie ¹ induceren, en de explantaten in een vochtige, weefselkweek incubator plaats bij 37 ° C, 5% CO _2. Cultuur periodes kan zo kort als een paar uur of uit te breiden zo lang als twee tot drie weken, afhankelijk van de parameter die wordt bestudeerd. Medium moet worden gewijzigd om de twee tot drie dagen.

Deel 4: Het oogsten van explantaten voor de analyse van incidenten die verband hielden met de differentiatie

1. Oogsten explantaten voor de analyse van eiwit-of RNA

Materialen:

1. Microdissecting pincet
2. SDS Lysis Buffer of RNA-later

Procedure:

1. Aan het einde van de incubatieperiode, verwijder het kweekmedium.
2. Met behulp van de stereo-microscoop ontleden, voorzichtig los van de randen van elke explantatie.
3. Til elk explant met de pincet en overbrengen naar een buis die over 100μl SDS lysis buffer (voor eiwit analyse) of RNA-later (voor RNA-analyse). Schud het uiteinde van het pincet in de oplossing om ervoor te zorgen dat de explantatie niet houden aan de pincet.

2. Oogsten explantaten voor immunofluorescentie

Materialen en reagentia:

1. Fosfaat gebufferde zoutoplossing met calcium en magnesium (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. Fosfaat gebufferde zoutoplossing (zonder calcium en magnesium) (Invitrogen, Carlsbad, CA)
3. 4% paraformaldehyde (Boston Bioproducts, Worcester, MA)
4. Microdissecting pincet
5. Hydrofobe markering pen
6. Glazen objectglaasjes
7. 0,25% Triton X-100 in fosfaat gebufferde zoutoplossing.

Procedure:

1. Spoel kort explantaten in PBS met calcium en magnesium.
2. Fix weefsels door het toevoegen van 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
3. Verwijder het fixatief en te vervangen door fosfaat gebufferde zoutoplossing. Vaste explantaten geworden wat stijf, waardoor ze worden opgeheven en overgebracht naar glazen dia's voor immunokleuring.
4. Plaats een kleine druppel PBS (zonder calcium en magnesium) op de dia om de positie van de weefsels helpen voorkomen en curling. Met behulp van microdissecting pincet, til de explantatie en plaats deze in de druppel op de dia. Zonder het explantatie, verwijder voorzichtig de vloeistof met een papieren lont aan de explantatie op het glas plat en laat het weefsel drogen in lucht bij kamertemperatuur gedurende 3 tot 5 minuten.

Figuur 1 A. De perifere epitheel tot uitdrukking differentiatie-specifieke eiwitten. De getoonde explant was immunostained voor N-cadherine onmiddellijk na microdissectie. Expressie wordt gezien in een band van cellen in het perifere epitheel, wat aangeeft dat de cellen in deze regio zijn begonnen met elkaar te onderscheiden. B. De perifere epitheel weg kan worden bijgesneden om cellen te verwijderen die uitdrukken N-cadherine en andere differentiatie-specifieke eiwitten. De rode ring staat voor de locatie van de cellen die uitdrukken N-cadherine, terwijl de kleine vierkante beschreven in het grijs het kwadrant van het epitheel getoond in paneel 1A vertegenwoordigt. De perifere epitheel kan worden verwijderd door vier scalpel snijdt, waardoor er een centraal plein dat alleen cellen die nog niet zijn begonnen om onderscheid te maken bevat.

Discussie

De rat lens explantatie systeem is met succes gebruikt door een aantal laboratoria om terminale differentiatie van lens epitheel cellen te bestuderen om lensvezels ^21,3,4,5. Wanneer ze worden blootgesteld aan FGF-2 op 100ng/ml de explantaten zal beginnen op veranderingen in de signalering binnen enkele minuten ⁶ laten zien, met veranderingen in morfologie en genexpressie verschijnen opeenvolgend over meerdere dagen ^3,4,5. De culturen blijven haalbaar is voor 2-3 weken als zorg is genomen om besmetting te voorkomen.

De centrale explantaten beschreven in dit protocol zijn vooral handig voor het bestuderen van de volgorde van de gebeurtenissen verbonden aan differentiatie, want ze bevatten weinig of geen cellen die differentiatie markers voor de FGF-2 te drukken is toegevoegd ^1,5. De cellen vervolgens synchroon differentiëren, als een cohort, die het mogelijk maakt om het tijdsverloop van de signalering en transcriptionele afspraken verbonden aan differentiatie te volgen. Het kweken van explantaten voor verschillende lengtes van de tijd geeft dus nauwkeurige temporele informatie over de reeks gebeurtenissen. Specifieke remmers kunnen worden toegevoegd aan het kweekmedium om relevante signaalwegen te identificeren. Explanten kan worden gebruikt om eiwitexpressie analyseren door SDS-gel elektroforese en immunoblotting of expressie van specifieke mRNA's door RT-PCR te analyseren. Eiwit levert range 20 tot 50 ug / Explantatie-en RNA-opbrengst ligt op ongeveer 200 tot 600 ng / explantatie, afhankelijk van de lengte van de cultuur periode. Wij vinden dat over het algemeen 5-6 explantaten per gerecht voldoende eiwitten of RNA te bieden voor verschillende assays. RNA van explanten kan ook gebruikt worden om cDNA voor te bereiden op het beoordelen van genexpressie door middel van microarray analyse, die kan identificeren nieuwe genen die cruciaal belang kan zijn voor differentiatie. Explanten kan ook worden getransfecteerd. Hoewel de transfectie-efficiëntie is over het algemeen laag is, is het voldoende voor het testen van reportergenen ^{4, 7, 8.} Immunofluorescentie microscopie van de explantaten biedt een nuttige aanvulling op biochemische methoden door het bepalen van de subcellulaire locatie van eiwitten van belang. Zo, de voorbereiding en de cultuur van de rat lens explanten biedt een krachtig systeem voor het bestuderen van terminale lens differentiatie in zoogdieren, die kunnen aanvullen in vivo technieken, zoals het genereren van transgene en knock-out muizen.