Monitoring Heart Functie in larvale Drosophila melanogaster Voor Fysiologische Studies

Samenvatting

We presenten verschillende manieren om de hartfunctie in de larve van Drosophila te monitoren voor het beantwoorden van vragen over de functie van gap junctions, ionkanaalmutaties, modulatie van pacemakeractiviteit en farmacologische studies.

Samenvatting

Wij presenteren verschillende methoden om de hartfunctie in de larve vast te leggenDrosophilaDe benaderingen maken het mogelijk om de hartslag te meten bij zowel ongebonden als gebonden volledige larven. Voor directe controle van de omgeving rond het hart maakt een andere benadering gebruik van gedissekeerde larven en het verwijderen van de interne organen om het hart te baden in gewenste verbindingen. Het blootgelegde hart maakt het daarnaast mogelijk om membraanpotentialen te monitoren, wat inzicht kan geven in de ionische stromen gegenereerd door de myocyten en in de elektrische geleiding langs de hartbuis. Deze benaderingen hebben diverse voordelen en nadelen voor toekomstige experimenten, die verder worden besproken. De larvale hartpreparatie biedt een aanvullend model naast deDrosophilaskeletale NMJ om de rol van intracellulaire calciumregulatie op de cellulaire functie te onderzoeken. Door meer te leren over de onderliggende ionenstromen die de actiepotentialen in myocyten van verschillende soorten vormgeven, kan men hopen inzicht te krijgen in de bekende ionendysfuncties die geassocieerd zijn met specifieke genen die verantwoordelijk zijn voor diverse ziekten bij zoogdieren.

Protocol

INLEIDING

De cellulaire mechanismen in de functie van het hart zijn voor zowel insecten als gewervelden verbazingwekkend vergelijkbaar. Drosophila melanogaster wordt gebruikt voor het onderzoeken van genmutaties die verantwoordelijk zijn voor ziektebeelden bij andere dieren, waaronder mensen (Bier en Bodmer, 2004; Peron et al., 2009). Momenteel worden diverse ziekten geïnduceerd in dit hanteerbare genetische organisme (Dowse et al., 1995; Johnson et al., 1998; Ganetzky, 2000; Bier en Bodmer, 2004; Ocorr et al., 2007a, b) in de hoop dat gentherapie in de toekomst kan worden getest om het herstel van de normale functie te bewerkstelligen. Daarnaast dienen Drosophila als een goed model voor de fysiologische functie op cellulair niveau.

Veel van de eerdere studies naar het hart van Drosophila waren gericht op ontwikkelingsaspecten in het embryo (Azpiazu and Frasch 1993, Bodmer 1993, Bodmer et al. 1990). Een klein aantal studies naar de fysiologische functie vond plaats in de pre-pupale, pupale of volwassen stadia (Ashton et al., 2001; He and Adler, 2001; Molina and Cripps, 2001; Ponzielli et al., 2002; Sláma and Farkaš, 2005; Wessells and Bodmer, 2004). Het pupale stadium is echter een fase van metamorfose en veranderende hormonen, evenals fluctuerende biogene aminen. Bovendien ondergaat het hart een structurele transformatie, wat het beheersen van variabelen bemoeilijkt bij het onderzoeken van de fysiologie van de myocyten (Dulcis et al. 2005; Johnson et al. 2002; Miller, 1997; Papaefthimiou and Theophilidis, 2001). Het hart staat erom bekend myogeen te zijn in het larvale stadium en kan gemakkelijk worden verwijderd of in situ worden gelaten terwijl het wordt gebaand door een gedefinieerde fysiologische zoutoplossing om storende variabelen, zoals circulerende hormonen of peptiden, te beperken (Dowse et al. 1995; Johnson et al. 1997; Dasari and Cooper, 2006; Feng et al. 2004). De myogene aard van het larvale hart is vergelijkbaar met die van het zoogdierhart, in die zin dat er pacemakers zijn die de rest van het hart aanzetten om vloeistof in een richting te pompen die effectief is voor het spoelen van organen. De chronotrope en ionotrope aard van het larvale Drosophila-hart is van belang, aangezien dit kan dienen als een snelle methode om fundamentele principes en pathologische effecten voor de hartfunctie van zoogdieren te testen, evenals een hulp bij het ontwikkelen van een comparatief model voor cellulaire fysiologie, zoals de ionische regulatie van pacemakercellen.

Het larvale hart is zeer gevoelig voor biogene aminen en peptiden, waarvan de concentratie in de hemolymfe varieert afhankelijk van de voedselbron of de intrinsieke toestand van het dier (Dasari and Cooper, 2006; Johnson et al. 1997, 2000; Nichols et al. 1999; Zornik et al. 1999). Het is van belang om te onderzoeken hoe endogene of exogene verbindingen het hart mechanistisch beïnvloeden. Mogelijk kunnen nieuwe insecticiden met minder effecten op andere organismen worden ontwikkeld als we een beter begrip krijgen van de insectenfysiologie en -farmacologie.

Het cellulaire werkingsmechanisme van neurotransmitters en cardiale modulatoren in larven is tot op heden niet beschreven, aangezien er onvoldoende inzicht was in de ionenstromen en kanaaltypen in het hart van de larve die bijdragen aan en de pacemakeractiviteit reguleren. Voor zover wij weten, zijn er geen verslagen van extracellulaire of intracellulaire registraties van myocyten om ionenstromen te beoordelen en zo de mechanistische effecten van modulatoren in larvale Drosophila te onderzoeken.

In dit verslag presenteren we verschillende methoden om de hartslag en fysiologische eigenschappen van het larvale hart vast te leggen.

METHODEN

Intacte larven:

1. Een goede manier om een intact kloppend larvenhart te visualiseren is direct met een microscoop; de larve moet echter stil genoeg blijven om de contracties te tellen. Wij hebben methoden ontwikkeld om de hartslag te monitoren in zowel vrij bewegende als gefixeerde larven. Afhankelijk van de experimentele vraag kan de ene benadering geschikter zijn dan de andere.
2. Deze benaderingen kunnen worden gebruikt om een individu over langere perioden te volgen, mits er voorzichtig wordt gewerkt om uitdroging te voorkomen. Deze methoden kunnen ook worden gebruikt om farmacologische middelen te beoordelen die via het dieet worden toegediend, of om verschillende tijdstippen in de ontwikkeling in mutatielijnen te onderzoeken, of bij inductie van heat-shock-genen.
3. De eerste onbeperkte methode noemen wij de 'Mierenboerderij'. Deze techniek bestaat uit twee glasplaten die van elkaar worden gescheiden door een dunne laag larvengvoedsel. De larven kunnen hierdoor binnen één scherpstellingsvlak worden gevisualiseerd. Deze techniek werd ook gebruikt om circadiane beweging in larven te monitoren via elektrische activiteit (Cooper and Cooper, 2004). Deze techniek bestaat uit twee glasplaten (microscoopglaasjes; 75 x 25 mm; J. Melvin Freed Brand) die nauw (1 tot 1,5 mm) gescheiden zijn door een dunne laag larvengvoedsel (bijv. vochtig maïsmeel — een aangepaste versie van Lewis, 1960), zodat de larven binnen één scherpstellingsvlak kunnen worden gevisualiseerd. Spacers die gewoonlijk worden gebruikt voor gel-elektroforeseplaten (mini gel Bio-Rad; Life Science Research, Hercules, CA 94547, USA) werken zeer goed, aangezien ze in verschillende diktes verkrijgbaar zijn voor gebruik bij procedures met mierenboerderijen voor 1e, 2e of 3e instars larven. Een andere optie is om een massief stuk plastic van een bepaalde dikte te gebruiken en het gebied uit te snijden dat als kruipruimte moet dienen.
4. Om te voorkomen dat larven langs de randen van de twee glasplaten wegkruipen, wordt plastic van de gewenste dikte gebruikt. Door het platform lichtjes in een hoek van 20 tot 45 graden te kantelen, blijven de larven het grootste deel van de tijd met hun kop naar beneden gericht en hun staart met de stigmata boven het voedsel of binnen een luchtkanaal in de voedingslaag.
5. Deze "Mierenboerderij-techniek" maakt ook video-imaging mogelijk binnen een enkel vlak met voedsel van uniforme dikte. In deze configuratie hebben de larven de neiging niet door het voedsel heen te kruipen, maar in plaats daarvan te eten en geleidelijk te bewegen in het 2D-vlak. Wit licht wordt via een spiegel vanaf de onderkant van de microscooptafel geprojecteerd, zodat dit kan worden verplaatst voor het beste contrast van het hart of de twee tracheae die bewegen terwijl het hart samentrekt. Er wordt een microscoop gebruikt (instelbare zoom 0,67 tot 4,5; World Precision Instrument; Model 501379). Een 2X basisobjectief en een tube-objectief van 0,5X worden gebruikt om voldoende ruimtelijke resolutie en vergroting te verkrijgen om een rechthoek van 1 cm bij 0,5 cm te beslaan. Er wordt een gemonteerde camera via een trinoculaire houder gebruikt (Mintron, MTV; World Precision Instrument). De omgevingstemperatuur wordt gehandhaafd op 20°C.
   
   
   Figuur 1. Dorsaal aanzicht van een intacte 3^e instar larve. De beweging van de tracheae door het trekken aan de aanhechtingen van het hart wordt gebruikt om de hartslag te observeren.
6. Om het vrij bewegende dier te monitoren, kan men een paar druppels van een verdund voedingsmengsel over de kop van de dieren plaatsen. Dit moet in een glazen schaal gebeuren, zodat het transmissielicht door de larven kan gaan om de hartbuis te visualiseren. Dezelfde microscopie-opstelling als hierboven beschreven kan worden gebruikt om de hartslag te observeren en tellingen uit te voeren.
7. Een andere benadering is om de larve op één locatie te fixeren door dubbelzijdige tape op een glazen objectglas te gebruiken en de ventrale zijde van de larve tegen de tape te plaatsen (Baker et al., 1999). Deze aanpak werkt echter niet goed als de tape nat wordt bij het voeren van de larven. Om te voorkomen dat de tape nat wordt, kan men Vaseline gebruiken (ingespoten uit een kleine naald rond de basis van de larven en rond de rand van de tape). Hierdoor kunnen larven in de loop van de tijd gevoerd worden zonder dat men de larven in het scherpstellingsvlak hoeft te jagen of terwijl ze op een schaal bewegen. Als men de larven wil bevrijden, kan de tape worden bevochtigd, waardoor het zijn hechting aan het dier verliest.

Indien men niet geïnteresseerd is in het vrijlaten van de larven voor experimenten, kan de permanente methode van fixatie worden gebruikt door het dier op een glasplaatje te lijmen. Bij gebruik van de methode met secondelijm kan het dier eten en zelfs worden bedekt met een vochtige oplossing, terwijl het aan het glazen dekglas blijft kleven. De procedures zijn als volgt:

1. Neem een schoon objectglas en plaats een dekglas aan één uiteinde ervan.
2. Breng een kleine hoeveelheid secondelijm aan op één hoek van het dekglas.
3. Zoek de Drosophila-larve en haal deze uit de reageerbuis.
4. Plaats de larve in een Petrischaal en spoel deze af met een kleine hoeveelheid water om overtollig voedsel te verwijderen.
5. Absorbeer het resterende voedsel met de hoek van een klein zakdoekje of keukenpapier.
6. Pak de larve voorzichtig op met een pincet en plaats deze op het objectglas, aan het uiteinde tegenover het dekglas.
7. Plaats het objectglas onder de microscoop en stel de lenzen af op de larve. De larve moet op zijn buik liggen met de rug naar boven gericht. U kunt de twee zijden van de larve onderscheiden omdat de rug twee 'racestrepen' heeft, wat de trachea zijn. De buik heeft vage horizontale groeven die erlangs lopen met zeer fijne zwarte haartjes.
8. Als de larve de verkeerde kant op ligt, draai deze dan simpelweg de juiste kant op door hem voorzichtig met het pincet om te keren.
9. Neem met een nieuwe set pincetten, die specifiek voor de lijm worden gebruikt, een kleine hoeveelheid van de druppel aan het uiteinde van het dekglas en breng dit aan op de hoek van het tegenovergestelde uiteinde. U moet een zeer kleine hoeveelheid lijm gebruiken; net genoeg om de punt van het pincet te bedekken. Zorg er ook voor dat u de uiteinden van uw pincet afveegt, zodat deze niet aan elkaar vastgelijmd raken.
10. Controleer onder de microscoop nogmaals of de larve nog steeds in de juiste positie ligt. Als deze is omgedraaid, zie dan stap acht.
11. Pak nu met de pincet die gebruikt wordt voor de larven de larve op en plaats deze voorzichtig op de verse lijmplek. Zorg ervoor dat de zwarte mondhaken zich nabij of op de rand van het dekglas bevinden en dat noch zij, noch de bruine spiracula in contact komen met de lijm.
12. Druk voorzichtig op de larve om deze plat te maken.
13. Nu de larve op zijn plaats ligt, kunt u de stoffen toedienen die u wilt testen.
14. Dit kan het beste worden gedaan door een spuit te gebruiken om de stof op te zuigen en deze in kleine doses bij de kop van de larve te plaatsen zodat deze kan worden ingenomen.
15. Ten slotte kan de hartslag worden waargenomen door het aantal pulsaties van de spiracula in één minuut te tellen.

In situ: Dissectie en tellen van de hartslag:

De preparaten worden langs de midden-ventrale longitudinale as ingesneden en platgepind. De preparatieschaal bestond uit een glazen objectglas (VWR) met aan één zijde bevestigd magnetisch plakband (Best Buys retail outlet). Een gat in het midden van de magnetische strip maakt het mogelijk om het preparaat met doorgelaten licht te bekijken. Dissectiepinnen (Fine Scientific Tools, WA) zijn gebogen en gelijmd aan paperclips. De paperclips kunnen eenvoudig over het magnetische plakband worden verschoven om het gefileerde preparaat op zijn plaats te houden. Dit type registratieschaal is eerder beschreven voor het vastpinnen van ganglia die zijn geïsoleerd uit het ventrale zenuwstreng van de bloedzuiger (Muller et al., 1981).

1. Plaats een intact larve in het 3e instadium op een dissectieplaat. Draai de larve op zijn ventrale zijde tot de trachea niet langer zichtbaar zijn door de cuticula.
2. Plaats vier spelden in de intacte larve. Plaats twee spelden aan weerszijden van de mondhaken en twee spelden aan weerszijden van de spiracula.
3. Voeg zoutoplossing toe en maak een horizontale incisie op een kleine afstand van de spelden bij de kop, en maak vervolgens een horizontale incisie over de gehele lengte van de longitudinale as.
4. Stop met snijden op een korte afstand van het echte hart. Snijd rondom het echte hart en langs de zijden van de spiracula.
5. Til een dorsale speld op en haak deze onder de cuticula. Gebruik de speld om de lichaamsholte te openen en uit te spreiden. Herhaal dit met de overige spelden.
6. Verwijder de darmen, waarbij u er zorgvuldig op toeziet dat neither de trachea noch het hart worden beschadigd. Let erop dat sommige structuren aan het hart zijn bevestigd en dit kunnen beschadigen als ze worden verwijderd. Deze omvatten verschillende vetlichamen en het brein. Als u ziet dat het hart wordt uitgerekt tijdens het verwijderen van de darmen, stop dan onmiddellijk met het verwijderen van die specifieke structuur.

Het hart ligt nu bloot en is klaar voor blootstelling aan de experimentele condities.

Figuur 2. Ventrale dissectie van een 3^de instarstadium om het hart direct te kunnen bekijken. Het vastpinnen van het dier op zijn rug na dissectie wordt gebruikt om de verbindingen direct op het hart aan te brengen, met of zonder intact centraal zenuwstelsel (CZS). De kleine pijl geeft aan waar het hart en de aorta worden gescheiden voor studies met een doorgesneden dorsaal vat (zie hieronder). Tr, Trachee; Sp, Stigmata; H, Hart; AO, Aorta.

Deze dissectietechniek is gebruikt om farmacologische middelen direct te testen op het hart van Drosophila-larven (Gu and Singh, 1995). De dissectietijd bedraagt 3-6 min. Na de dissectie krijgt het preparaat 3-5 min de tijd om te ontspannen terwijl het is ondergedompeld in HL3-saline.

De HL3-zoutoplossing werd zorgvuldig gecontroleerd op pH 7,2, aangezien de hartslagfrequentie (HR) afneemt bij een hoge pH en toeneemt bij een lagere pH (Badre et al., 2005). Gu en Singh (1995) gebruikten pH 7,0 voor de farmacologische analyse van het hart en toonden eveneens behouden levensvatbaarheid aan. Tijdens deze proeven bleef de zoutoplossing belucht door de oplossing te agiteren door middel van herhaaldelijke injectie van de zoutoplossing, via een naald van 21-gauge, in een bekerglas.

Om de HR te kwantificeren kan men gebruikmaken van directe observaties of kunnen de beelden worden opgenomen op VHS-banden of met een digitale camera voor weergave op een scherm. Een fotodiodemethode is eerder beschreven (Dasari and Cooper, 2006).

Blootstelling aan hittestress:

1. Dissekeer de larve.
2. Plaats het gedissekeerde preparaat op een dekglas.
3. Verwarm het waterbad.
4. Controleer de temperatuur in het bad door een temperatuurprobe op een dekglas te laten drijven.
5. Wanneer de temperatuur correct is, plaats het preparaat en het dekglas in het bad.
6. Laat het preparaat gedurende de gewenste tijd in het bad en haal het eruit wanneer dit voltooid is.

Men kan zelf bepalen welke hittepuls en temperatuur vereist zijn voor de experimenten.

Stimuleer het hart elektrisch om het tempo te reguleren:

1. Vul een focale elektrode (ongeveer 20 microns in diameter) door een spuit in het open uiteinde te plaatsen en af te sluiten, en de op kamertemperatuur (21° C) gebrachte vliegenzoutoplossing (HL3) in de elektrode op te zuigen. Monteer de elektrode in de manipulator en controleer of de draad zich in de zoutoplossing binnen de elektrode bevindt en of de stimulator is uitgeschakeld.
2. Plaats een gedissecteerde preparatie van het hart van een Drosophila-larve in het derde instar-stadium onder de dissectiemicroscoop en zet deze vast. Plaats de aardingsdraad in de zoutoplossing van het preparaat, waarbij u er zorgvuldig op let dat er geen contact is met de pinnen en zijkanten van het preparaat.
3. Gebruik de manipulator om de punt van de elektrode op de bovenzijde van het hart te positioneren, waarbij de focus van de microscoop indien nodig wordt aangepast. De beste manier om dit te bereiken is door op de elektrode te focussen terwijl de punt naar beneden wordt bewogen.
4. Wanneer de punt in positie lijkt te zijn, moet de stimulator (model S9 Grass Instruments, Quincy, Massachusetts, USA) worden ingeschakeld met een frequentie van 2 Hz, een duur van 0,5 tot 1 ms en de spanning op de laagste stand. De vertragingsinstelling moet tussen de 12 en 14 liggen.
5. Tijdens het observeren van het hartritme moet de frequentie worden ingesteld op ongeveer 3 Hz en de spanning langzaam worden verhoogd totdat het waargenomen hartritme overeenkomomt met het door de stimulator geproduceerde ritme. Normaal gesproken slaagt het gedissecteerde vliegenhart met een frequentie van ongeveer 2 Hz; wanneer het gestimuleerde ritme dus hoger is dan de intrinsieke frequentie, zal het hart sneller slaan dan normaal. De spanning mag ongeveer 20 V niet overschrijden, aangezien bij hoge spanningen celbeschadiging kan optreden, waardoor het preparaat onbruikbaar wordt. Gewoonlijk kan het hart worden gestimuleerd tussen 2 en 8 V, afhankelijk van de afstand en de afsluiting die op het hart is gecreëerd.
6. Als de maximale spanning is bereikt en er geen effect zichtbaar is, kan de polariteit worden omgekeerd. Als dit ook niet werkt, moet de probe worden verplaatst om een betere verbinding met het hart tot stand te brengen.
7. Zodra er een door stimulatie gestuurd ritme is vastgesteld, kan dit ritme worden gemanipuleerd door de instellingen voor frequentie en duur te variëren. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat frequenties boven de 4 Hz het hart in tetanie kunnen brengen. Diverse alcoholen en farmacologische agentia kunnen worden toegevoegd, waarna hun effect op gap junctions kan worden geobserveerd zodra het gewenste ritme is vastgesteld. Geblokkeerde gap junctions geleiden geen stroom, waardoor het voortgeplante ritme zal stoppen.
   
   
   Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.

Meet veldpotentialen:

1. Glaselektroden worden vervaardigd uit Kimax-glas (buitendiameter: 1,5 mm). De glazen buis wordt uitgetrokken en vuurgepolijst om patch-tips te produceren met binnendiameters variërend van 10 tot 20 μm.
2. Het lumen van de elektrode wordt gevuld met het badmedium. De versterker en de registratie via een online verbinding met een computer zijn gelijk aan die welke hieronder worden gebruikt voor de intracellulaire registraties.
3. Het lumen van een 'macro-patch' registratie-elektrode (Stühmer et al.,1983) wordt direct boven een gebied van het hart geplaatst. De spontane pacing van de spiervezels produceert een veldpotentiaal die met de focale elektrode kan worden gemonitord.
4. Er dient voorzichtig te worden gewerkt door het lumen behoedzaam te laten zakken en weer op te tillen boven elk gebied van het hart dat gemonitord moet worden. De potentialen worden geregistreerd via een macro-patch elektrode.

Het is mogelijk om de hartslag direct te tellen en elektrische gebeurtenissen te monitoren. Het is daarnaast haalbaar om het badmedium te wijzigen tijdens het registreren van deze potentialen om de effecten op de veldpotentialen te beoordelen.

Meet de intracellulaire potentialen:

Om de transmembraanpotentialen van de myocyten te monitoren, wordt een deel van het hart doorboord met een scherpe intracellulaire elektrode (weerstand van 20 tot 30 mOhm) gevuld met 3 M KCl. Een standaard head stage en versterker voor intracellulaire registratie kan worden gebruikt; wij hebben echter gebruikgemaakt van een model Axonclamp 2B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) versterker en een 1 X LU head stage. Het blijkt dat het caudale uiteinde van het hart stijver is en dat dit de plek is waar de pacemakercellen zich bevinden, aangezien de contractie in de meeste gevallen in deze regio begint (Badre et al., 2005; Dasari and Cooper 2006; Dasari et al., 2007).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dissectie-instrumenten: Fijne #5 pincetten en fijne scharen (allemaal verkregen van Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Dissectiemicroscoop met zoomfunctie voor dissectie en het tellen van de hartslag. Deze is ook nodig voor focale stimulatie van het hart. Voor extracellulaire en intracellulaire registraties wordt een samengestelde microscoop met rechtopstaande objectieven (4 x en 20X) gebruikt. Standaard intracellulaire versterker en A/D-bord voor online registratie naar een computer. Elektrische signalen worden online geregistreerd op een PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australië). We gebruiken standaard software van ADInstruments genaamd Chart of Scope. Chemicaliën: Alle zoutoplossingschemicaliën zijn verkregen van het chemische bedrijf Sigma (St. Louis, MO). Voor intracellulaire registraties gebruiken we glazen capillaire buisjes (catalogus # 30-31-0 van FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) en voor focale macropatch-registratie en stimulerende elektroden gebruiken we Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, lengte 100mm. De intracellulaire elektrode moet een weerstand hebben van 20 tot 30 mOhm. De macropatch-elektrode wordt vervaardigd door de punt van het glas af te breken nadat er met een elektroden-puller een fijne punt is gemaakt. De afgebroken punt moet een schone loodrechte breuk hebben van ongeveer 20μM in diameter. De punt wordt vervolgens hittegepolijst tot een binnendiameter van ongeveer 10μM voor de focale extracellulaire registratie. Voor de stimulerende elektrode om het hart aan te sturen gebruiken we een uiteindelijke punt van ongeveer 20-50 μM in diameter. De schacht van de elektrode wordt over een heating element geleid om deze ongeveer 45 graden geleidelijk te buigen. Dit resulteert in een vlakke of loodrechte elektrode-opening over de hartbuis, aangezien de hoek met de micromanipulator ongeveer nog eens 45 graden ten opzichte van het preparaat zal bedragen.