Methodenartikel

Monitoring Heart Functie in larvale Drosophila melanogaster Voor Fysiologische Studies

21.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/1596

⸱

16 november 2009

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Kentucky, Lexington

In dit artikel

Samenvatting

We presenten verschillende manieren om de hartfunctie in de larve van Drosophila te monitoren voor het beantwoorden van vragen over de functie van gap junctions, ionkanaalmutaties, modulatie van pacemakeractiviteit en farmacologische studies.

Samenvatting

Wij presenteren verschillende methoden om de hartfunctie in de larve vast te leggenDrosophilaDe benaderingen maken het mogelijk om de hartslag te meten bij zowel ongebonden als gebonden volledige larven. Voor directe controle van de omgeving rond het hart maakt een andere benadering gebruik van gedissekeerde larven en het verwijderen van de interne organen om het hart te baden in gewenste verbindingen. Het blootgelegde hart maakt het daarnaast mogelijk om membraanpotentialen te monitoren, wat inzicht kan geven in de ionische stromen gegenereerd door de myocyten en in de elektrische geleiding langs de hartbuis. Deze benaderingen hebben diverse voordelen en nadelen voor toekomstige experimenten, die verder worden besproken. De larvale hartpreparatie biedt een aanvullend model naast deDrosophilaskeletale NMJ om de rol van intracellulaire calciumregulatie op de cellulaire functie te onderzoeken. Door meer te leren over de onderliggende ionenstromen die de actiepotentialen in myocyten van verschillende soorten vormgeven, kan men hopen inzicht te krijgen in de bekende ionendysfuncties die geassocieerd zijn met specifieke genen die verantwoordelijk zijn voor diverse ziekten bij zoogdieren.

Protocol

INLEIDING

De cellulaire mechanismen in de functie van het hart zijn voor zowel insecten als vertebraten verbazingwekkend vergelijkbaar. Drosophila melanogaster wordt gebruikt voor het onderzoeken van genmutaties die verantwoordelijk zijn voor ziektebeelden bij andere dieren, waaronder mensen (Bier and Bodmer, 2004; Peron et al., 2009). Momenteel worden diverse ziekten geïnduceerd in dit hanteerbare genetische organisme (Dowse et al., 1995; Johnson et al., 1998; Ganetzky, 2000; Bier and Bodmer, 2004; Ocorr et al., 2007a, b), in de hoop dat gentherapie in de toekomst kan worden getest om het herstel van de normale functie te bewerkstelligen. Daarnaast dienen Drosophila als een goed model voor de fysiologische functie op cellulair niveau.

Veel van de eerdere studies naar het hart van Drosophila waren gericht op ontwikkelingsaspecten in het embryo (Azpiazu and Frasch 1993, Bodmer 1993, Bodmer et al. 1990). Er zijn enkele studies naar de fysiologische functie uitgevoerd in de pre-pupale, pupale of volwassen stadia (Ashton et al., 2001; He and Adler, 2001; Molina and Cripps, 2001; Ponzielli et al., 2002; Sláma and Farkaš, 2005; Wessells and Bodmer, 2004). Het pupale stadium is echter een fase van metamorfose en veranderende hormonen, evenals fluctuerende biogene aminen. Bovendien ondergaat het hart een structurele transformatie, wat het controleren van variabelen kan bemoeilijken bij het onderzoeken van de fysiologie van de myocyten (Dulcis et al. 2005; Johnson et al. 2002; Miller, 1997; Papaefthimiou and Theophilidis, 2001). Het hart staat erom bekend myogeen te zijn in het larvale stadium en kan gemakkelijk worden verwijderd of in situ worden gelaten terwijl het wordt gebaad in een gedefinieerde fysiologische zoutoplossing om storende variabelen, zoals circulerende hormonen of peptiden, te beperken (Dowse et al. 1995; Johnson et al. 1997; Dasari and Cooper, 2006; Feng et al. 2004). De myogene aard van het larvale hart is vergelijkbaar met het hart van zoogdieren, in die zin dat er pacemakers zijn die de rest van het hart aanzetten om vloeistof in een richting te pompen die effectief is voor het spoelen van organen. De chronotrope en ionotrope aard van het larvale hart van Drosophila is interessant, omdat het kan dienen als een snelle methode om fundamentele principes en pathologische effecten voor de hartfunctie van zoogdieren te testen, en kan helpen bij de ontwikkeling van een comparatief model voor cellulaire fysiologie, zoals de ionische regulatie van pacemakercellen.

Het larvale hart is zeer gevoelig voor biogene amines en peptiden die in de hemolymfe variëren afhankelijk van de voedselbron of de intrinsieke toestand van het dier (Dasari and Cooper, 2006; Johnson et al. 1997, 2000; Nichols et al. 1999; Zornik et al. 1999). Het is van belang om te onderzoeken hoe endogene of exogene verbindingen het hart mechanistisch beïnvloeden. Indien we een beter begrip krijgen van de insectenfysiologie en -farmacologie, kunnen er mogelijk nieuwe insecticiden worden ontwikkeld met minder effecten op andere organismen.

Het cellulaire werkingsmechanisme van de neurotransmitters en cardiale modulatoren in larven is tot nu toe niet beschreven, aangezien er onvoldoende inzicht was in de ionische stromen en kanaaltypen in het hart van de larve die bijdragen aan en de pacemakeractiviteit reguleren. Voor zover wij weten, zijn er geen verslagen waarin extracellulaire of intracellulaire opnames van myocyten worden gedocumenteerd om ionische stromen te beoordelen en zo de mechanistische effecten van modulatoren in larvale Drosophila te onderzoeken.

In dit rapport presenteren wij diverse methoden om de hartslag en fysiologische eigenschappen van het larvale hart vast te leggen.

METHODEN

Intacte larven:

  1. Een goede manier om een intact kloppend larvenhart te visualiseren is direct met een microscoop; de larve moet echter stil genoeg blijven om de contracties te tellen. Wij hebben methoden ontwikkeld om de hartslag te monitoren in zowel vrij bewegende als gefixeerde larven. Afhankelijk van de experimentele vraag kan de ene benadering geschikter zijn dan de andere.
  2. Deze benaderingen kunnen worden gebruikt om een individu over langere perioden te volgen, mits er zorgvuldig wordt voorkomen dat uitdroging optreedt. Deze methoden kunnen ook worden gebruikt om farmacologische middelen die via het dieet worden toegediend te beoordelen, of om verschillende tijdstippen in de ontwikkeling te onderzoeken in mutatie-lijnen of bij inductie van heat shock-genen.
  3. De eerste methode voor onbeperkte beweging noemen wij de 'mierenboerderij'. Deze techniek bestaat uit twee glasplaten die van elkaar worden gescheiden door een dunne laag larvenvoedsel. Hierdoor kunnen de larven binnen één focusvlak worden gevisualiseerd. Deze techniek werd ook gebruikt om de circadiane beweging in larven te monitoren via elektrische activiteit (Cooper and Cooper, 2004). Deze techniek bestaat uit twee glasplaten (objectglazen; 75 x 25 mm; J. Melvin Freed Brand) die nauw gescheiden zijn (1 tot 1,5 mm) door een dunne laag larvenvoedsel (bijv. vochtige maïsmeel - een gemodificeerde versie van Lewis, 1960), zodat de larven binnen één focusvlak kunnen worden gevisualiseerd. Spacers die gewoonlijk worden gebruikt voor gel-elektroforeseplaten (mini gel Bio-Rad; Life Science Research, Hercules, CA 94547, USA) werken zeer goed, aangezien ze in verschillende diktes verkrijgbaar zijn voor gebruik bij procedures voor de mierenboerderij met 1e, 2e of 3e instar larven. Een andere optie is het gebruik van een massief plastic van een bepaalde dikte, waarbij het gebied dat als kruipruimte dient wordt uitgesneden.
  4. Om te voorkomen dat larven langs de randen van de twee glasplaten wegkruipen, wordt plastic van de gewenste dikte gebruikt. Door het platform lichtjes onder een hoek van 20 tot 45 graden te kantelen, blijven de larven de meeste tijd met hun kop naar beneden gericht, terwijl hun staart, die de stiften bevat, boven het voedsel of binnen een luchtpassage in de voedingslaag blijft.
  5. Deze "mierenboerderij-techniek" maakt ook video-imaging mogelijk binnen een enkel vlak met voedsel van uniforme dikte. In deze configuratie neigen de larven er niet toe om door het hele voedsel te kruipen, maar eten ze en bewegen ze geleidelijk rond in het 2D-vlak. Wit licht wordt via een spiegel vanaf de onderkant van de microscooptafel geprojecteerd, zodat dit kan worden verplaatst voor het beste contrast van het hart of de twee tracheae die bewegen terwijl het hart samentrekt. Er wordt een microscoop gebruikt (instelbare zoom 0,67 tot 4,5; World Precision Instrument; Model 501379). Een 2X basisobjectief en een buisobjectief van 0,5X worden gebruikt om voldoende ruimtelijke resolutie en vergroting te verkrijgen om een rechthoek van 1 cm bij 0,5 cm te bestrijken. Er wordt een gemonteerde camera via een trinoculaire houder gebruikt (Mintron, MTV; World Precision Instrument). De omgevingstemperatuur wordt gehandhaafd op 20°C.

    Histologisch preparaat diagram, waarop zenuwweefsel wordt getoond met annotaties voor trachea en wervelkolom.
    Figuur 1. Dorsaal aanzicht van een intacte 3de instar larve. De beweging van de trachea door het trekken van de aanhechtingen aan het hart wordt gebruikt om de hartslag te observeren.
  6. Om het vrij bewegende dier te monitoren, kan men enkele druppels van een verdund voedselmengsel over de kop van de dieren plaatsen. Dit moet in een glazen schaal gebeuren, zodat het doorgelaten licht door de larven kan gaan om de hartbuis te visualiseren. Dezelfde microscopie-opstelling als hierboven beschreven kan worden gebruikt om de hartslag te observeren en tellingen te verkrijgen.
  7. Een andere benadering is om de larve op één locatie te fixeren door dubbelzijdige tape op een objectglas te gebruiken en de ventrale zijde van de larve tegen de tape te plaatsen (Baker et al., 1999). Deze benadering werkt echter niet goed als de tape nat wordt bij het voeren van de larven. Om te voorkomen dat de tape nat wordt, kan men Vaseline gebruiken (ingespoten met een kleine naald rond de basis van de larven en rond de tape-rand). Zo kan men de larven in de loop van de tijd voeren zonder de larven in het focusvlak te moeten jagen of terwijl ze op een schaal bewegen. Indien men de larven wil bevrijden, kan de tape worden bevochtigd, waardoor deze zijn hechting aan het dier verliest.

Indien men de larven niet voor experimenten wil vrijlaten, kan men de permanente methode van fixatie gebruiken door het dier op een glazen objectglas te lijmen. Bij gebruik van de superlijkmethode kan het dier blijven eten en zelfs worden bedekt met een vochtige oplossing terwijl het aan het glazen dekglas gehecht blijft. De procedures zijn als volgt:

  1. Neem een schone objectglas en plaats een dekglas aan één uiteinde ervan.
  2. Breng een kleine druppel secondelijm aan op een hoek van het dekglas.
  3. Lokaliseer de Drosophila-larve en haal deze uit de reageerbuis.
  4. Plaats de larve in een petrischaal en spoel deze af met een kleine hoeveelheid water om eventueel overtollig voedsel te verwijderen.
  5. Absorbeer het resterende voedsel met de hoek van een klein stukje tissue of keukenpapier.
  6. Pak de larve voorzichtig op met een pincet en plaats deze op het objectglas, aan het uiteinde tegenover het dekglas.
  7. Plaats het objectglas onder de microscoop en stel de lenzen af op de larve. De larve moet op zijn buik liggen met de rug naar boven gericht. De twee zijden van de larve kunnen worden onderscheiden doordat de rug twee 'racestrepen' vertoont, wat de trachea zijn. De buik heeft vage horizontale groeven die eroverheen lopen met zeer fijne zwarte haren.
  8. Als de larve de verkeerde kant op ligt, draai deze dan simpelweg de juiste kant op door hem voorzichtig met het pincet om te keren.
  9. Neem met een nieuwe set pincetten, specifiek voor de lijm, een kleine hoeveelheid van de druppel aan het uiteinde van het dekglas en breng dit aan op de hoek van het tegenoverliggende uiteinde. Gebruik slechts een fractie van de lijm; net genoeg om de punt van de pincet te bedekken. Zorg er ook voor dat u de uiteinden van de pincetten afveegt, zodat deze niet aan elkaar vastgeplakt raken.
  10. Controleer onder de microscoop dubbel of de larve nog steeds in de juiste positie ligt. Als deze is omgedraaid, zie dan stap acht.
  11. Pak de larve nu op met de pincet die gebruikt wordt voor de larven en plaats deze voorzichtig op de verse lijmplek. Zorg ervoor dat de zwarte mondhaken zich nabij of aan de rand van het dekglas bevinden en dat noch zij, noch de bruine stigmata in contact komen met de lijm.
  12. Druk voorzichtig op de larve om deze plat te drukken.
  13. Nu de larve op zijn plaats ligt, kunt u de stoffen toedienen die u wilt testen.
  14. Dit kan het beste worden gedaan door een spuit te gebruiken om de stof op te zuigen en deze in kleine doses bij de kop van de larve te plaatsen zodat deze kan worden ingenomen.
  15. Ten slotte kan de hartslag worden waargenomen door het aantal pulsaties van de stigmata in één minuut te tellen.

In situ: Dissectie en tellen van de hartslag:

De preparaten worden langs de mid-ventrale longitudinale as ingesneden en platgepinned. De preparatieschaal bestond uit een objectglas (VWR) met magnetische tape (Best Buys retail out-let) aan één zijde bevestigd. Een gat in het midden van de magnetische strip maakt het mogelijk om het preparaat met doorgelaten licht te bekijken. Ontleedingspinnen (Fine Scientific Tools, WA) worden gebogen en aan paperclips gelijmd. De paperclips kunnen eenvoudig over de magnetische tape worden gemanoeuvreerd om het gefileerde preparaat op zijn plaats te houden. Dit type registratieschaal is eerder beschreven voor het pinnen van ganglia geïsoleerd uit het ventrale zenuwstreng van de bloedzuiger (Muller et al., 1981).

  1. Plaats een intact larve in het 3e stadium op een dissectieplaat. Draai de larve op zijn ventrale zijde tot de trachea niet meer zichtbaar zijn door de cuticula.
  2. Plaats vier spelden in de intacte larve. Twee spelden worden aan weerszijden van de mondhaken geplaatst en twee spelden aan weerszijden van de stigmata.
  3. Voeg zoutoplossing toe en maak een horizontale incisie op een kleine afstand van de spelden bij de kop, waarna een horizontale incisie over de gehele lengte van de longitudinale as wordt voortgezet.
  4. Stop met snijden net voor het echte hart. Snijd rondom het echte hart en langs de stigmata.
  5. Til één dorsale speld op en haak deze onder de cuticula. Gebruik de speld om de lichaamsholte te openen en uit te spreiden. Herhaal dit met de overige spelden.
  6. Verwijder de darmen, waarbij u er zorg voor draagt dat noch de trachea noch het hart worden beschadigd. Let op dat sommige structuren aan het hart vastzitten en dit kunnen beschadigen bij verwijdering. Hiertoe behoren verschillende vetlichamen en de hersenen. Indien u ziet dat het hart wordt uitgerekt tijdens het verwijderen van de darmen, stop dan onmiddellijk met het proberen te verwijderen van die structuur.

Het hart is nu blootgesteld en klaar voor blootstelling aan de experimentele condities.

Dissectieschema dat het arteriële systeem toont; gelabeld aorta (Ao), trachea (Tr), milt (Sp).
Figuur 2. Ventrale dissectie van een 3de instar om het hart direct te kunnen zien. Het vastpinnen van het dier op zijn rug na dissectie wordt gebruikt om de verbindingen direct op het hart aan te brengen, met of zonder intact centraal zenuwstelsel. De kleine pijl geeft aan waar het hart en de aorta gescheiden zijn voor studies naar het doorgesneden dorsale vat (zie hieronder). Tr, Trachea; Sp, Spirakels; H, Hart; AO, Aorta.

Deze dissectietechniek is gebruikt om farmacologische middelen direct te testen op het hart van Drosophila-larven (Gu en Singh, 1995). De dissectietijd bedraagt 3-6 min. Na de dissectie krijgt het preparaat 3-5 min de tijd om te ontspannen terwijl het ondergedompeld is in HL3-zoutoplossing.

De HL3-zoutoplossing werd zorgvuldig gecontroleerd om op pH 7,2 te blijven, aangezien de hartslagfrequentie vertraagt bij een hoge pH en versnelt bij een lagere pH (Badre et al., 2005). Gu en Singh (1995) gebruikten pH 7,0 voor de farmacologische analyse van het hart en toonden aan dat de levensvatbaarheid behouden bleef. Tijdens deze proeven bleef de zoutoplossing belucht door de oplossing te agiteren door herhaaldelijk zoutoplossing via een naald van 21 gauge in een bekerglas te injecteren.

Om de hartslag (HR) te kwantificeren kunnen ofwel directe observaties worden gebruikt, of de beelden kunnen worden opgenomen op VHS-banden of met een digitale camera voor weergave op een scherm. Een fotodiodemethode is eerder beschreven (Dasari and Cooper, 2006).

Blootstelling aan hittestress:

  1. Disseceer de larve.
  2. Plaats het gedisseceerde preparaat op een dekglas.
  3. Verwarm het waterbad.
  4. Controleer de temperatuur in het bad door een temperatuurprobe op een dekglas te laten drijven.
  5. Wanneer de temperatuur optimaal is, worden het preparaat en het dekglas in het bad geplaatst.
  6. Laat het preparaat gedurende de gewenste tijd in het bad en verwijder het zodra dit voltooid is.

Men kan bepalen welke hittepuls en temperatuur vereist zijn voor hun experimenten.

Stimuleer het hart elektrisch om het tempo te bepalen:

  1. Vul een focuselektrode (ongeveer 20 micron in diameter) door een spuit in het open uiteinde in te brengen en af te dichten, en de op kamertemperatuur (21° C) zijnde vliegenzoutoplossing (HL3) in de elektrode te trekken. Monteer de elektrode in de manipulator en controleer of de draad zich in de zoutoplossing binnen de elektrode bevindt en of de stimulator is uitgeschakeld.
  2. Plaats een gedissecteerde preparatie van het hart van een Drosophila-larve in het derde larvale stadium onder de dissectiemicroscoop en zet deze vast. Plaats de aardingsdraad in de zoutoplossing van het preparaat, waarbij u voorzichtig bent om contact met de pinnen en de zijkanten van het preparaat te vermijden.
  3. Gebruik de manipulator om de punt van de elektrode bovenop het hart te positioneren, waarbij u de focus van de microscoop naar behoefte aanpast. De beste manier om dit te bereiken is door op de elektrode te focussen terwijl u de punt naar beneden beweegt.
  4. Wanneer de punt in positie lijkt te zijn, moet de stimulator (model S9 Grass Instruments, Quincy, Massachusetts, USA) worden ingeschakeld met een frequentie van 2 Hz, een duur van 0,5 tot 1 ms en de spanning op de laagste stand. De vertragingsinstelling moet tussen 12 en 14 liggen.
  5. Terwijl het ritme van het hart wordt geobserveerd, moet de frequentie worden ingesteld op ongeveer 3 Hz en de spanning langzaam worden verhoogd totdat het waargenomen hartritme overeenkomt met het door de stimulator geproduceerde ritme. Normaal gesproken slaat het gedissecteerde vliegenhart met een frequentie van ongeveer 2 Hz; wanneer het gestimuleerde ritme dus hoger is dan de intrinsieke frequentie, zal het hart sneller slaan dan normaal. De spanning mag ongeveer 20 V niet overschrijden, aangezien er bij hoge spanningen celbeschadiging kan optreden, waardoor het preparaat onbruikbaar wordt. Doorgaans kan het hart worden gestimuleerd tussen 2 en 8 V, afhankelijk van de afstand en de afsluiting die op het hart is gecreëerd.
  6. Als de maximale spanning is bereikt en er geen effect zichtbaar is, kan de polariteit worden omgekeerd. Als dit ook niet werkt, moet de probe worden verplaatst om een betere verbinding met het hart te maken.
  7. Zodra een door stimulatie gedreven ritme is vastgesteld, kan dit ritme worden gemanipuleerd door de frequentie- en duurinstellingen te variëren. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat frequenties boven de 4 Hz het hart in tetanie kunnen brengen. Diverse alcoholen en farmacologische middelen kunnen worden toegevoegd, waarna hun effect op gap junctions kan worden geobserveerd zodra het gewenste ritme is vastgesteld. Geblokkeerde gap junctions geleiden geen stroom en het voortgeplante ritme zal stoppen.
    Optische microscopie-opstelling voor monsteranalyse; microscoop, lenzen, gefocuste verlichting, visualisatie.

    Vliegendissectie met pin, elektrode nabij hartbuis; opstelling voor elektrofysiologisch experiment. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Meet veldpotentialen:

  1. Glaselektroden worden gemaakt van Kimax-glas (buitendiameter: 1,5 mm). De glazen buis wordt uitgetrokken en vuurgepolijst om patch-tips te produceren met binnendiameters variërend van 10 tot 20 μm.
  2. Het lumen van de elektrode wordt gevuld met het badmedium. De versterker en de registratie via een computer zijn gelijk aan die welke hieronder worden gebruikt voor de intracellulaire registraties.
  3. Het lumen van een 'macro-patch' registratie-elektrode (Stühmer et al.,1983) wordt direct over een gebied van het hart geplaatst. De spontane pacing van de spiervezels produceert een veldpotentiaal die met de focale elektrode kan worden gemonitord.
  4. Er moet voorzichtig te werk worden gegaan door het lumen langzaam te laten zakken en weer op te tillen boven elk gebied van het hart dat gemonitord moet worden. De potentialen worden geregistreerd via een macro-patch elektrode.

Het is mogelijk om de hartslag direct te tellen en elektrische gebeurtenissen te monitoren. Het is daarnaast haalbaar om het badmedium tijdens het registreren van deze potentialen te wijzigen om de effecten op de veldpotentialen te beoordelen.

Meet de intracellulaire potentialen:

Om de transmembraanpotentialen van de myocyten te monitoren, wordt een deel van het hart doorboord met een scherpe intracellulaire elektrode (weerstand van 20 tot 30 mOhm) gevuld met 3 M KCl. Een standaard headstage en versterker voor intracellulaire registratie kan worden gebruikt; wij hebben echter gebruikgemaakt van een Axonclamp 2B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) versterker en een 1 X LU headstage. Het blijkt dat het caudale uiteinde van het hart rigider is en dat dit de plek is waar de pacemakercellen zich bevinden, aangezien de contractie in de meeste gevallen in deze regio begint (Badre et al., 2005; Dasari and Cooper 2006; Dasari et al., 2007).

Dankbetuigingen

Financiering verstrekt door de G. Ribble Fellowships van de afdeling Biologie, de Kentucky Young Researchers en het Undergraduate Education-eUreKa! Office (Univ. of KY).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
  1. Dissectie-instrumenten: Fijne #5 pincetten en fijne scharen (allemaal verkregen van Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139)
  2. Dissectiemicroscoop met zoomfunctie voor dissectie en het tellen van de hartslag. Deze is ook nodig voor focale stimulatie van het hart.
  3. Voor extracellulaire en intracellulaire registraties wordt een samengestelde microscoop met rechtopstaande objectieven (4 x en 20X) gebruikt.
    Standaard intracellulaire versterker en A/D-bord voor online registratie naar een computer. Elektrische signalen worden online geregistreerd op een PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australië). We gebruiken standaard software van ADInstruments genaamd Chart of Scope.
  4. Chemicaliën: Alle zoutoplossingschemicaliën zijn verkregen van het chemische bedrijf Sigma (St. Louis, MO).
  5. Voor intracellulaire registraties gebruiken we glazen capillaire buisjes (catalogus # 30-31-0 van FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) en voor focale macropatch-registratie en stimulerende elektroden gebruiken we Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, lengte 100mm. De intracellulaire elektrode moet een weerstand hebben van 20 tot 30 mOhm. De macropatch-elektrode wordt vervaardigd door de punt van het glas af te breken nadat er met een elektroden-puller een fijne punt is gemaakt. De afgebroken punt moet een schone loodrechte breuk hebben van ongeveer 20μM in diameter. De punt wordt vervolgens hittegepolijst tot een binnendiameter van ongeveer 10μM voor de focale extracellulaire registratie. Voor de stimulerende elektrode om het hart aan te sturen gebruiken we een uiteindelijke punt van ongeveer 20-50 μM in diameter. De schacht van de elektrode wordt over een heating element geleid om deze ongeveer 45 graden geleidelijk te buigen. Dit resulteert in een vlakke of loodrechte elektrode-opening over de hartbuis, aangezien de hoek met de micromanipulator ongeveer nog eens 45 graden ten opzichte van het preparaat zal bedragen.

Referenties

  1. Ashton, K., Wagoner, A. P., Carrillo, R., Gibson, G. Quantitative trait loci for the monoamine-related traits heart rate and headless behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 157, 283-294 (2001).
  2. Azpiazu, N., Frasch, M. Tinman and Bagpipe: Two homeo box genes that determine cell fates in the dorsal mesoderm of Drosophila. Genes & Development. 7, 1325-1340 (1993).
  3. Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 140, 363-376 (2005).
  4. Baker, J. D., McNabb, S. L., Truman, J. W. The hormonal coordination of behavior and physiology at adult ecdysis in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 202, 3037-3048 (1999).
  5. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
  6. Bodmer, R. The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development. 118, 719-729 (1993).
  7. Bodmer, R., Jan, L. Y., Jan, Y. N. A new homeobox-containing gene, msh-2, is transiently expressed early during mesoderm formation of Drosophila. Development. 110, 661-669 (1990).
  8. Cooper, A. S., Cooper, R. L. Monitoring activity of Drosophila larvae: Impedance & video microscopy measures. Drosophila Information Service. 87, 85-87 (2004).
  9. Dasari, S., Cooper, R. L. Direct influence of serotonin on the larval heart of Drosophila melanogaster. J. Comp. Physiol. B. 176, 349-357 (2006).
  10. Dasari, S., Viele, K., Turner, A. C., Cooper, R. L. Influence of p-CPA and MDMA on physiology, development and behavior in Drosophila melanogaster. European J. Neurosci. 26, 424-438 (2007).
  11. Dowse, H., Ringo, J., Power, J., Johnson, E., Kinney, K., White, L. A congenital heart defect in Drosophila caused by an action-potential mutation. J. Neurogenetics. 10, 153-168 (1995).
  12. Dulcis, D., Levine, R. B. Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 25, 271-280 (2005).
  13. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J. Neurogenetics. 18, 377-402 (2004).
  14. Ganetzky, B. Genetic analysis of ion channel dysfunction in Drosophila. Kidney International. 3, 766-771 (2000).
  15. GG, G. u Pharmacological analysis of heartbeat in. Drosophila. J. Neurobiol. 28, 269-280 (1995).
  16. He, B., Adler, P. N. Cellular mechanisms in the development of the Drosophila arista. Mechanisms of Development. 104, 69-78 (2001).
  17. Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. Modulation of Drosophila heartbeat by neurotransmitters. J. Comp. Physiol. B. 167, 89-97 (1997).
  18. Johnson, E., Ringo, J., Bray, N., Dowse, H. Genetic and pharmacological identification of ion channels central to the Drosophila cardiac pacemaker. J. Neurogenetics. 12, 1-24 (1998).
  19. Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. Native and heterologous neuropeptides are cardioactive in Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 1, 1229-1236 (2000).
  20. Johnson, E., Sherry, T., Ringo, J., Dowse, H. Modulation of the cardiac pacemaker of Drosophila: cellular mechanisms. J. Comp. Physiol. B, Biochem., Systemic, Environmental Physiol. 172, 227-236 (2002).
  21. Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosophila Inform. Serv. 34, 117-117 (1960).
  22. Miller, T. A. Control of circulation in insects. General Pharmacol. 29, 23-38 (1997).
  23. Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mechanisms of Development. 118, 51-59 (2001).
  24. Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. Neurobiology of the Leech. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. 254-254 (1981).
  25. Nichols, R., Kaminski, S., Walling, E., Zornik, E. Regulating the activity of a cardioacceleratory peptide. Peptides. 20, 1153-1158 (1999).
  26. Ocorr, K., Akasaka, T., Bodmer, R. Age-related cardiac disease model of Drosophila. Mechanisms of Ageing and Development. 128, 112-116 (2007a).
  27. Ocorr, K. A., Crawley, T., Gibson, G., Bodmer, R. Genetic variation for cardiac dysfunction in Drosophila. PLoS ONE. 2, e601-e601 (2007).
  28. Papaefthmiou, C., Theophilidis, G. An in vitro method for recording the electrical activity of the isolated heart of the adult Drosophila melanogaster. In Vitro Cellular & Developmental Biol. Animal. 37, 445-449 (2001).
  29. Peron, S., Zordan, M. A., Magnabosco, A., Reggiani, C., Megighian, A. From action potential to contraction: Neural control and excitation-contraction coupling in larval muscles of Drosophila. Comp. Biochem.Physiol. A: Molecular & Integrative Physiol. 154, 173-183 (2009).
  30. Ponzielli, R., Astier, M., Chartier, A., Gallet, A., Therond, P., Semeriva, M. Heart tube patterning in Drosophila requires integration of axial and segmental information provided by the Bithorax Complex genes and hedgehog signaling. Develop. 129, 4509-4521 (2002).
  31. Sl ma, K., Farkas, R. Heartbeat patterns during the postembryonic development of Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 51, 489-503 (2005).
  32. St hmer, W., Roberts, W. S., Almers, W. Single channel recordings. Sakmann, B., Neher, E. The loose patch clamp, Plenum Press. New York. 123-132 (1983).
  33. Wessells, R. J., Bodmer, R. Screening assays for heart function mutants in Drosophila. Biotechniques. 37, 58-66 (2004).
  34. Zornik, E., Paisley, K., Nichols, R. Neural transmitters and a peptide modulate Drosophila heart rate. Peptides. 20, 45-51 (1999).

Herprints en machtigingen

Tags

Drosophila larvenhartslagbewakingpreparatie van gedissekeerde larvenintracellulaire registratiesveldpotentiaalregistratieselektrische pacingfarmacologische manipulatieionkanaalfunctieanalyse van de hartfunctielarvale hartpreparatie
Monitoring Heart Functie in larvale Drosophila melanogaster Voor Fysiologische Studies
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.