Murine Colitis Modeling met dextraansulfaat Natrium (DSS)

Samenvatting

Dextransulfaat natrium (DSS) toegediend in het drinkwater is een gevestigde murine inflammatoire letsel model van acute colitis. Dit protocol beschrijft de methode voor DSS behandeling en de preparatie van de weefsels.

Samenvatting

Colitis kunnen het gevolg zijn van virale of bacteriële infecties, ischemische beledigen of auto-immuunziekten, met name colitis ulcerosa en de dikke variant van de ziekte van Crohn - Crohn Colitis. Acute colitis kunnen presenteren met buikpijn en buik, malabsorptie, diarree, hematochezia en slijm in de ontlasting. We beginnen de complexe interacties tussen milieu, genetica, en de epitheliale barrière dysfunctie bij inflammatory bowel disease en dierlijke modellen van colitis zijn essentieel in het bevorderen van onze kennis van deze ziekte te begrijpen. Een populair model betreft tot aanvulling van het drinkwater van muizen met een laag moleculair gewicht Dextran natriumsulfaat (DSS), wat resulteert in beschadiging van het epitheel en een robuuste ontstekingsreactie in de dikke darm meerdaagse

Protocol

Deel 1: Letsel-Repair Colitis Model

1. Baseline gewicht moet worden verkregen voor elke muis voorafgaand aan het begin DSS de behandeling.
2. Maak een 3% (w / v) dextraansulfaat Natrium zout-oplossing in water en filter met een 0,45 pm cellulose-acetaat filter.
3. Vervang het drinkwater in de muis kooi met de 3%-DSS-oplossing voor vier dagen. De muizen zouden geen toegang tot een andere bron van water (met uitsluiting tips geplaatst op geautomatiseerde irrigatiesystemen).
4. Op dag vier, vervang dan de DSS-oplossing met water voor een extra drie dagen, waardoor een aantal dikke epitheliale herstel. De muizen moeten worden afgewogen op dag vier, om systemische gevolgen van colitis kwantificeren. Gewichtsverlies is vaak met ernstig letsel.
5. Op dag zeven, wegen en opoffering van de muizen. Muizen kunnen worden gedood door inhalatie-overdosis van isofluraan, of een ander institutioneel, IACUC goedgekeurde methoden.

Deel 2: autopsie en oogsten van Colon

1. Expose de ventrale zijde van de muis en veilige benen om onbelemmerde toegang tot de buik te verzekeren. Volledig nat de buik met 70% ethanol.
2. Pak de middellijn van de buik met weefsel pincet en zo naar boven uit te breiden tenten van de huid. Gebruik fijne punt schaar om de buik waardoor het blootstellen van de buikinhoud incise. Uitbreiding van de incisie aan de top van de xyphoid proces op de middenlijn en dan zich langs de inferieure aspect van de ribben marges bilateraal.
3. Identificeer de dunne darm, blindedarm en dikke darm. Zorgvuldig te ontleden / plagen de dikke darm van de omringende mesenterium. Transect de dikke darm diep in het bekken naar het distale colon en het rectum vrij. Transect de dikke darm bij de colonocecal marge naar de proximale dikke darm vrij. Zorg moet worden genomen tijdens dit proces niet aan de dikke darm beschadigen als het reinigen van de dikke darm zal problematisch zijn als perforatie optreedt.
4. Met behulp van een 20G naald voeden en 10 ml spuit, intuberen en spoel de dikke darm met ijskoude PBS, totdat het eluaat volledig vrij van ontlasting.
5. Op dit punt, als macroscopische analyse met een dissectiemicroscoop gewenst is, kan de dubbele punten worden vastgesteld als "worst". Als histologische analyse alleen gewenst is dan verder met deel 4 "Het maken van Zwitserse Rolls voor de histologische analyse van acute colitis".

Deel 3: Verwerking als "worst" voor Macroscopische Analyse van de gehele dikke darm

1. Het is belangrijk om de juiste stand van de dikke darm te behouden, dus houd het distale uiteinde van de dikke darm het dichtst bij de operator. Knip twee stukken van de niet-resorbeerbaar garen (SP116 1,5 metrische gevlochten zijde), een ongeveer 1 cm in lengte, de andere 2 centimeter.
2. Gebruik het 2 inch stukje hechtdraad tot afhechten het distale einde zo dicht mogelijk bij de marge mogelijk met behoud van een goede afdichting.
3. Plaats een 20G naald voeden met 5 ml 10% gebufferde formaline fosfaat in het proximale uiteinde van de dikke darm. Losjes binden de resterende stuk van hechtdraad onmiddellijk proximaal van de lamp van de voeding naald. Pak altijd de dikke darm aan de lamp van de voeding naald en bezielen formaline tot de dikke darm is uitgebreid. Draai de knoop in de hechtdraad als je terug te trekken de voeding naald, waardoor het de toegediende, uitgebreide dikke darm als een "worst".
4. Vul een 15 ml conische buis met 10% gebufferde formaline fosfaat en plaats van de dikke darm in de buis. Fix voor 24 uur.
5. Giet formaline en te vervangen door 70% EtOH voor een extra 24 uur. (Dubbele punten kunnen worden opgeslagen in 70% EtOH voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur.)
6. Verwijder de dikke darm uit de conische buis en snijd de snaren op elk uiteinde met een scalpel, zorg dat u de dikke darm beschadigen. Vergeet niet dat het distale uiteinde van de langste touwtje heeft. Gesneden lengterichting van het distale tot proximale uiteinde van de dikke darm, zodat het vormt een lang vel. Op dit punt kan de dikke darm worden bekeken onder een microscoop dissectie.

Deel 4: Het maken van Zwitserse Rolls voor de histologische analyse van acute colitis

1. Het is belangrijk om de juiste stand van de dikke darm te behouden, dus houd het distale uiteinde van de dikke darm het dichtst bij de operator.
2. Meet de dikke darm lengte. Deze statistiek is een andere indicator van de ernst van letsel. Colitis verhoogt oedeem en verkort de totale lengte dikke darm.
3. Met behulp van fijne punt schaar, lengterichting incise van distaal naar proximaal uiteinde van de dikke darm. Gebruik fijn getipt tang om de randen van de incisie te begrijpen en zijwaarts te openen werkt je weg distaal-> proximaal, waardoor de weergave van de dikke darm als een vlakke plaat.
4. Rollen van de dikke darm is een tang en een twee handen techniek. Pak de randen van het distale marge met een tang. Ga verder naar de dikke darm sequentieel rollen door draaien en loslaten wordt de tang te gaan tot de proximale marge. Dus het genereren van een spiraal met een derde dimensie of "Zwitserse Roll".Voor behoud van de opgerolde vorm, stevig vastpakken de rol met een tang en transect met een 27G1 / 2 naald. Zet de naald door het buigen van de naald als het wordt uitgevoerd de rol.
5. Leg de rol in een passend label weefsel cassette en plaats in een pot van 10% fosfaat gebufferde formaline bij kamertemperatuur gedurende 24 uur tot weefsel fixatie te garanderen.
6. Giet formaline en te vervangen door 70% EtOH voor een extra 24 uur. (Dubbele punten kunnen worden opgeslagen in 70% EtOH voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur.)
7. Nadat het monster is vastgesteld, kan het paraffine ingebedde, gesegmenteerd en gemonteerd op dia's voor histologische analyse.

Deel 5: representatieve resultaten

De DSS-model voor acute colitis kan de onderzoeker te verkrijgen, repareren, en een dubbele punt dat modellen acute colitis te analyseren. Als de Zwitserse rol wordt gesneden en gemonteerd, moet het vormen een representatief deel van de gehele dikke darm als gerold goed (figuur 1). De gemonteerde roll kan worden gekleurd met H & E in om de omvang van de schade vast te stellen in de dikke darm, vanaf het distale (binnen) einde aan de proximale (buiten) uiteinde (figuur 2). Immunohistochemie kan ook worden uitgevoerd op de Zwitserse rol te identificeren en te kwantificeren inflammatoire infiltraten. Als de worst methode correct is uitgevoerd, zal de vaste colon verwijd en de hele mucosale oppervlak kan gemakkelijk worden gemanipuleerd en bekeken onder de microscoop te ontleden (figuur 3).

Figuur 1. De goed uitgevoerde "Zwitserse roll". (A) De dikke darm is gerold van de distaal van proximale uiteinde, doorsneden met een naald en beveiligd door het buigen aan het einde van de naald. Het wordt dan geplaatst in een weefsel cassette voor bevestiging. (B) H & E-lood 5 micrometer doorsnede van een Zwitserse broodje gemaakt van de dikke darm van een muis die behandeld worden met DSS (d = distale colon p = proximale colon).

Figuur 2. DSS behandeld dubbele punten vertonen tekenen van acute colitis. Ontsteking en crypte schade zijn duidelijk zichtbaar in de DSS-behandelde dikke darm in vergelijking met een water-behandelde controle.

Figuur 3. Een voorbeeld van een "worst". De worst doordrenkt met formaline en volledig uitgebreid. Een lichte hoek zal aanwezig zijn ondergeschikt aan de natuurlijke kromming van de dikke darm. De geopende worst moet plat.

Discussie

Dit protocol kan worden aangepast om acuut letsel, letsel-reparatie, of chronische colon letsel te modelleren.

Acuut letsel Wijziging:

DSS behandeling ad lib voor 4-6 dagen gevolgd door onmiddellijke offer

Injury-Repair Modification:

Letsel met 4-6 dagen van DSS-behandeling gevolgd door herstel periode van 3-4 dagen en opoffering (zoals beschreven in bovenstaande protocol).

Chronische C...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dextran Sulfaat Natriumzout	USB Corp., Affymetrix	9011-18-1	mol wt 40.000-50.000
10% Gebufferd Formalinefosfaat	Fisher Scientific	SF100-4
Isofluraan, USP	Phoenix Pharmaceuticals, Inc.	NDC 57319-474-06
TISSUE PATH Macrosette-cassettes	Fisher Scientific	15182706
BD 10 ml Spuit	BD Biosciences	309604
Ethyl Alcohol	Pharmco-AAPER	E190	Verdun tot 70% met gedistilleerd water
20G Rechte Voedingsnaald	VWR international	20068-612
27G1/2 PrecisionGlide Naald	BD Biosciences	305109
Dissectie Schaartjes, Scherpe/Blunte Punt	VWR international	82027-588
Waugh-tang	VWR international	82027-428
Niet-absorbeerbare Naald	LOOK Surgical	SP116
Whatman Blotting Paper	VWR international	28298-020	Snij zoals nodig
Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetaat (SFCA) Filter	Cole-Parmer	EW-06731-2
Digitaal schuifmaat met koolstofvezel composiet	Fisher Scientific	15-007-958