Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo's
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De zebravis is een ideaal model voor beeldvorming cel gedrag tijdens de ontwikkeling in vivo. Zebravis embryo's worden extern bevrucht en dus gemakkelijk te bereiken in alle stadia van ontwikkeling. Bovendien, hun optische helderheid maakt hoge resolutie imaging van cel-en moleculaire dynamica in de natuurlijke omgeving van de intacte embryo. We maken gebruik van een live-imaging benadering naar cel gedrag te analyseren tijdens de neurale lijst cel migratie en de uitgroei en begeleiding van neuronale axonen.
Live-imaging is vooral nuttig voor het begrijpen van mechanismen die celmotiliteit processen te reguleren. Te visualiseren details van celbeweeglijkheid, zoals stuwend activiteit en moleculaire dynamica, is het voordelig om individuele cellen label. In de zebravis, plasmide DNA injectie levert een voorbijgaande mozaïek expressiepatroon en biedt duidelijke voordelen ten opzichte van andere cel etikettering methoden. Bijvoorbeeld, transgene lijnen vaak label hele cel populaties en kan dus visualisatie van de boete uitsteeksels (of veranderingen in de moleculaire distributie) in een enkele cel onduidelijk. Daarnaast, injectie van DNA in de een-cellig stadium is minder invasief en preciezer dan kleurstof injecties in latere stadia.
Hier beschrijven we een methode voor het labelen van de individuele ontwikkeling van neuronen of neurale cellen en imaging hun gedrag in vivo. We injecteren plasmide DNA in een-cellig stadium embryo's, wat resulteert in mozaïek transgenexpressie. De vectoren bevatten cel-specifieke promotors die rijden expressie van een gen van interesse in een subset van de sensorische neuronen of neurale lijst cellen. Wij bieden voorbeelden van cellen gelabeld met membraan gerichte GFP of met een biosensor sonde die visualisatie van F-actine laat in levende cellen 1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, en Matthew Clay droegen ook voor dit werk.
Protocol
1. Montage van injectie dia's en dia's imaging
Injectie dia's:
- Bereid Sylgard siliconenelastomeer volgens de instructies van de fabrikant.
- Gebruik de Sylgard voor het verlijmen van drie standaard glazen microscoopglaasjes bij elkaar door het stapelen de ene dia op de top van het kruispunt van de andere twee dia's, die side-by-side zijn gerangschikt op de lange zijden. De bovenste dia maakt een haakse hoek of 'muur' tussen de boven-en onderkant dia's.
- Laat Sylgard 's nachts in te stellen. Deze dia's zijn herbruikbaar.
Imaging slide:
- We maken gebruik van roestvrij staa....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De optimale concentratie van geïnjecteerde DNA zal variëren afhankelijk van de grootte en de sterkte van de promotor en de bouw moet empirisch vastgesteld worden. Injectie van te veel DNA kan leiden tot ongezonde embryo's met uitgebreide celdood, terwijl er te weinig zal resulteren in een zeer klein deel van de geïnjecteerde embryo's de uiting van de transgen. De DNA-expressie correleert met de sterkte van het fluorofoor-signaal, dat varieert van cel naar cel. Terwijl het sorteren van embryo's onder epifluor.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NIH R01 NS042228 naar MCH De Olympus FV1000 confocale werd verworven met een gezamenlijke NIH instrumentatie te verlenen S10RR023717 aan de UW Zoölogie Department (PI Bill Bement).
Erica Andersen, Namrata Asuri, en Matthew Clay droegen ook aan deze krant.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoaat methansulfonaat) | Sigma-Aldrich | A5040-250G | |
| Sylgard Siliconen Elastomeer Kit | Dow Corning | 184 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12243 | |
| Agarose met laag smeltpunt | Invitrogen | 15517-014 | |
| Picospritzer | Parker Hannifin Corporation | 051-0302-900 |
Referenties
- Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Meer artikelen verkennen
