In deze video, tonen we de procedure van de CD40-activatie en expansie van B-cellen van muizen splenocyten van C57BL / 6 muizen, die gebruikt kan worden als een model antigeen-presenterende cel (APC), de inductie van immuniteit bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Muizenmodel van CD40-activatie van B-cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Onderzoek naar de B-cellen heeft aangetoond dat CD40 activatie van hun antigeen presentatie vermogen verbetert. Wanneer gestimuleerd met interleukine-4 en CD40 ligand (CD40L), kunnen menselijke B-cellen worden uitgebreid zonder de moeilijkheden van kleine hoeveelheden van perifeer bloed binnen 14 dagen de tijd om zeer grote hoeveelheden van zeer zuivere CD40-B-cellen (> 10
Protocol
Het protocol voor het genereren van muizen CD40-geactiveerde B-cellen (mCD40B) van splenocyten is verdeeld in twee delen: deel A toont de bereiding van de muizen-CD40 ligand (CD40L) uitdrukken HeLa cellen (tmuCD40L HeLa), die zal worden gebruikt als plaat- gebonden feeder cellen. Deel B beschrijft de actuele muis CD40-B cultuur.
A. Bereiding van feeder-cellen (tmuCD40L HeLa)
De tmuCD40L HeLa is een aanhanger menselijke epitheel cellijn, die nooit zou moeten worden volledig confluent. De cellen zijn dan ook twee keer gesplitst per week. Het kweken van meer dan 6 weken wordt niet aanbevolen.
- Verwijder....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Wijzigingen van dit protocol zijn mogelijk, vooral wat betreft de oorsprong van CD40-stimulus en het type muizenstam gebruikt, ook in waardoor een efficiënte generatie muizen CD40-geactiveerde B-cellen. Ahmadi et al.. hebben gelijkwaardige resultaten getoond voor muizen fibroblasten getransfecteerd met murine CD40-ligand. In deze context presentatie van xeno-antigeen kan met zekerheid worden uitgesloten, maar intensieve studies met betrekking tot de veiligheid en toxiciteit in vivo gaf geen tekenen van ontsteki.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de nationale en Europese richtlijnen voor het houden van proefdieren. Verwijzing van de Duitse dierenwelzijnswet de dieren werden regelmatig gecontroleerd door de juiste instanties.
Dankbetuigingen
Wij danken dr. Clemens Wendtner voor het aanbieden van tmuCD40-Ligand-HeLa cellijn.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
A. Bereiding van Media:
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Feeder cel wild-type medium | Feeder celselectie medium | ||
| Reagens | Concentratie | Reagens | Concentratie |
| RPMI 1640 | RPMI 1640 | ||
| L-Glutamine | 300 ug / ml | L-Glutamine | 300 ug / ml |
| FBS | 10% | FBS | 10% |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycine | 15 ug / ml | Gentamycine | 15 ug / ml |
| Hygromycine B | 0,2 mg / ml |
| mCD40-B wassen medium | mCD40-B kweekmedium | ||
|---|---|---|---|
| Reagens | Concentratie | Reagens | Concentratie |
| D-MEM | D-MEM | ||
| L-Glutamine | 580 ug / ml | L-Glutamine | 580 ug / ml |
| Glucose | 4,5 mg / ml | Glucose | 4,5 mg / ml |
| HEPES | 10 mM | HEPES | 10 mM |
| Gentamycine | 15 ug / ml | Gentamycine | 15 ug / ml |
| MEM | 0,1 mm (1x) | ||
| FBS | 10% |
B. Diverse Reagentia:
| Reagens | Vennootschap | Volgnummer |
| RPMI 1640 | Invitrogen Gibco | REF 21875 |
| D-MEM | Invitrogen Gibco | REF 41965 |
| Dulbeccos PBS (10x) | PAA | Geen kat H15-011 |
| Gencin | Delta Select | Art No 7395800 |
| FBS | Lonza | Geen kat DE14-802C |
| HEPES Buffer | PAA | Geen kat S11-001 |
| MEM NEAA | Invitrogen Gibco | REF 11140 |
| Hygromycine B | PAA | Geen kat P02-015 |
| Recombinant muizen Interleukine-4 | Immunotools | Geen kat 12340045 |
| Cyclosporine A | Novartis | Geen kat NDC 0078-0109-01 |
| Trypsine / EDTA (10x) | Invitrogen Gibco | REF 15400-054 |
C. diverse benodigdheden:
| Reagens | Vennootschap | Volgnummer |
|---|---|---|
| Steriele pipet tips | Sarstedt | |
| 6-well plaat | NUNC | Geen kat 140675 |
| 50ml conische buis | BD Falcon ™ | Geen kat 352070 |
| Weefselkweek fles | Sarstedt | Geen kat 83.1813.002 |
Referenties
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).
- Wiesner, M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
