Voorbereiding van oligomere β-amyloïde 1-42 En Inductie van synaptische plasticiteit Waardevermindering op hippocampus Slices

Samenvatting

Een kenmerk van de ziekte van Alzheimer is de hoogte van Aß _1-42 Peptide. Hier hebben we een protocol voor het bereiden van synthetische Aß _1-42 Oligomeren, die hippocampus Long-Term Potentiëring ernstig schaadt, een cellulair correlaat van het geheugen. Deze procedure is handig voor het onderzoeken van de mechanismen van Aß-geïnduceerde pathologie en drug discovery.

Samenvatting

Bijzondere waardevermindering van synaptische verbindingen is waarschijnlijk de subtiele amnesic veranderingen die zich op de vroege stadia van de ziekte van Alzheimer s (AD) ten grondslag liggen. β-amyloïde (Aß), een peptide geproduceerd in grote hoeveelheden in AD, is bekend dat het Long-Term Potentiëring (LTP), een cellulaire correlaat van leren en geheugen te verminderen. Inderdaad, LTP bijzondere waardevermindering wordt veroorzaakt door Aß is een nuttig experimenteel paradigma voor het bestuderen van synaptische disfuncties in AD modellen en voor het screenen van geneesmiddelen die in staat van verzachtende of terugkeer dergelijke synaptische bijzondere waardeverminderingen. Studies hebben aangetoond dat Aß de LTP verstoring bij voorkeur produceert via zijn oligomere vorm. Hier hebben we een gedetailleerd protocol voor afbreuk te doen aan LTP door perfusie van oligomerized synthetische Aβ1-42 peptide op acute hippocampus plakjes. In deze video, schetsen we een stap-voor-stap procedure voor de voorbereiding van oligomere Aß

Protocol

Het mengen β-amyloïde peptide

Voordat u begint zijn klaar:

• Aß _1-42 (gevriesdroogd poeder)
• 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP)
• Low-bindende polypropyleen microcentrifugebuizen (1,5 ml)
• Gasdicht Hamilton spuit met Teflon duiken stop (250 pl)
• Dimethylsulfoxide (DMSO)

1. Laat gelyofiliseerd Aß _1-42 op kamertemperatuur equilibreren gedurende 30 minuten om condensatie te voorkomen bij het ​​openen van het peptide flacon.
2. Onder de zuurkast, opnieuw te schorten Aß _1-42 peptide in ijskoud HFIP om een een mM oplossing en vortex de oplossing voor een paar seconden te verkrijgen.
3. Met behulp van een glazen gasdicht Hamilton injectiespuit met Teflon stekker, snel verdelen de Aß _1-42 / HFIP oplossing even in drie polypropyleen flacons en sluit de flacons.
4. De flesjes worden vervolgens geïncubeerd gedurende 2 uur om zorgen voor Aß monomerization. Open vervolgens de flesjes en de concentratie van de Aß _1-42 / HFIP oplossing onder vacuüm met behulp van een SpeedVac centrifuge (800 g, op kamertemperatuur) tot een duidelijke peptide film wordt waargenomen op de bodem van de flesjes. Controleer zorgvuldig de temperatuur in de SpeedVac centrifuge om peptide degradatie te voorkomen (max 25 ° C).
5. Sluit de flesjes en bewaar de monsters bij -80 ° C. Aß film kan worden opgeslagen voor 6 maanden.
6. Opnieuw te schorsen een film door het toevoegen van DMSO tot een concentratie te verkrijgen tot en met 5 mM Aß _1-42. Ultrasone trillingen in het waterbad gedurende 10 minuten om te zorgen voor een volledige re-ophanging.
7. Aliquot deze 5mM Aß _1-42 oplossing in polypropyleen flacons. Afdichting alle flacons en bewaar ze bij -20 ° C. Monsters mag slechts een keer worden ontdooid. Pas op voor condensatie van waterdamp in de vriezer. Peptiden in oplossing degraderen heel gemakkelijk.

Oligomerisatie

Voordat u begint zijn klaar:

• Aß _1-42 / DMSO (5mm)
• Steriele fosfaatbuffer
• Low-bindende polypropyleen microcentrifugebuizen (1,5 ml)
• Low-bindende polypropyleen centrifugebuis (50 ml)

1. Verdun de verkregen 5mM Aß _1-42 / DMSO aliquot met steriele fosfaatbuffer (tot 100 pi).
2. Vortex gedurende 30 seconden en daarna incubeer gedurende 12 uur bij 4 ° C

Hippocampale slice behandeling

Bij de behandeling van hippocampale slices, is het belangrijk om te voorkomen dat niet-specifieke peptide hechting op bekers, perfusieslang oppervlakken, en de opname kamer. Gebruik bij voorkeur een lage-bindende polypropyleen buizen en containers. Vermijd het gebruik van glaswerk of algemene plastic-ware. Perfusie media moeten serum-of albumine-vrij.

Aß perfusie

Voordat u begint zijn klaar:

• Oligomerized Aß _1-42
• Opname buffer (in mm: 124 NaCl, KCl 4,4, een Na ₂ HPO _4, 25 NaHCO _3, 2 CaCl _{2, 2} MgCl _2, en 10 glucose)
• Elektrofysiologische opname set-up met interface kamer
• Dwars hippocampale plakken geïncubeerd in zuurstof opname buffer voor ten minste 90 minuten na dissectie (T = 29 ° C; constante perfusie snelheid = 2 ml / minuut)

1. Onmiddellijk voorafgaand aan het experiment, verdunnen de oligomerized Aß _1-42 hoeveelheid op de juiste werking concentratie (200 nM of hoger) in een polypropyleen buisje met pre-zuurstof opname buffer.
2. Perfuseren de Aß _1-42 oplossing gedurende 20 minuten tot de plakjes voor de inductie van synaptische plasticiteit.

Inductie van plasticiteit en follow-up

1. Typisch, het meest gebruikte model van synaptische plasticiteit is het LTP. Het kan worden opgewekt door middel van tetanische stimulatie van een bepaalde synaps in de hippocampus. We nemen veld reacties van de synapsen tussen zekerheid van de Shaffer's projecties en CA1 pyramidale neuronen in het stratum radiatum. Onze tetanische stimulatie bestaat uit een theta burst stimulatie die drie treinen van elkaar gescheiden door intervallen van 15 seconden opgenomen. Elke trein bestaat uit 10 barst op 5 Hz, waar elke burst 5 pulsen met zich meebrengt bij 100 Hz. Breng de tetanische stimulatie onmiddellijk na de perfusie van oligomerized Aß is afgerond.
2. Direct na de tetanische stimulatie terug te schakelen naar perfusie met normale opname buffer. Een constante perfusie snelheid, het opnemen van kamertemperatuur en een goede oxygenatie tijdens de gehele duur van het experiment.

Representatieve resultaten en mogelijke problemen

De Aß oligomerized volgens de klassieke protocol van Stine et coll. ^1, genereert Aß monomeren en een verscheidenheid van oligomeren van verschillende groottes (dimeer, trimeer, enz.) De perfusie van oligomerized Aß _1-42 leidt tot een verminderde LTP in Aß-behandelde schijfjes vergeleken met de controlegroep plakken. Onder onze experimentele omstandigheden, waar de 3-5 maanden oud C57BL/6J mannelijke muizen worden gebruikt, LTP in 200 nM Aß behandelde plakken is gemiddeld 150% van de uitgangswaarden op twee uur na de tetanische stimulatie, terwijl het in control plakjes LTP waarden zijn gemiddeld 200 tot 250% van de baseline2. In sommige gevallen kan behandeling met Aß niet aan de hippocampus LTP te verminderen. Een aantal kritieke fouten die kunnen optreden zijn onder overmatige film drogen tijdens Aß concentratie en onvolledige oligomerisatie. Aß perfusie in de hippocampus plakken zou een andere bron van zorg als gevolg van de fysisch-chemische eigenschappen van de Aß peptide in oplossing, die gevoelig is voor niet-specifieke hechting aan kunststoffen worden. Het oplossen van deze problemen wordt hieronder besproken.

Discussie

Zoals hierboven beschreven, kunnen verschillende problemen bij de voorbereiding van oligomere Aß resulteren in onverkort van LTP. Een manier om te beoordelen of Aß degradatie of het ontbreken van Aß oligomerization kan hebben plaatsgevonden is het evalueren van de Aß voorbereiding met behulp van TRIS-Tricine PAGE / Western blotting analyse en analytische ultracentrifuge (niet beschreven in dit protocol). Wanneer Westerse Blotting monsters worden bereid onder non-denaturing/non-reducing voorwaarden kan het een succesvoll...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Aβ 1-42 (gevriesdroogd)	American Peptide	62-0-80
1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP)	Fluka	52517
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Biotium, Inc.	90082
50mL polypropyleen centrifugebuizen	Corning	05-538-67
1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery	Axygen Scientific	MCT-150-L-C
Fosfaatgebufferde zoutoplossing pH 7.4	Invitrogen	10010-023
GASTIGHT spuiten 250 μL	Hamilton Co	1725
Badsonicator	Branson	3510
Savant SpeedVac concentratiesysteem	Verschillend	SC 110A