Twee-foton-Based Fotoactivatie in de Live zebravis embryo's

Samenvatting

Multifoton microscopie maakt de controle van een lage energetische fotonen met diepe penetratie optische en minder fototoxiciteit. We beschrijven het gebruik van deze technologie voor live cell etikettering in zebravis embryo's. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor foto-inductie van diverse licht-responsieve moleculen.

Samenvatting

Fotoactivatie van target verbindingen in een levend organisme heeft bewezen een waardevolle benadering van de verschillende biologische processen, zoals de embryonale ontwikkeling, cellulaire signalering en volwassen fysiologie te onderzoeken. In dit opzicht is het gebruik van multi-foton microscopie mogelijk kwantitatieve fotoactivering van een bepaalde licht reagerende agent in diepe weefsels op een enkele cel resolutie. Omdat zebravis embryo's worden optisch transparant, kan hun ontwikkeling worden gevolgd in vivo. Deze eigenschappen maken de zebravis een perfecte modelorganisme voor het regelen van de activiteit van een groot aantal chemische stoffen en de eiwitten door gericht licht. Hier beschrijven we het gebruik van twee-foton microscopie om de activering van chemisch gekooide fluoresceïne, die op zijn beurt laat ons toe om het lot van cellen te volgen in live zebravis embryo's induceren. We maken gebruik van embryo's uiten van een live-genetische mijlpaal (GFP), te lokaliseren en precies te richten alle cellen van belang. Deze procedure kan eveneens worden gebruikt voor exacte licht geïnduceerde activatie van eiwitten, hormonen, kleine moleculen en andere gekooide verbindingen.

Protocol

Beschrijven we een protocol van de cel etikettering gebruik van gekooide fluoresceïne, maar ook andere foto-activeerbare kleurstoffen en eiwitten op dezelfde manier worden gebruikt.

1. Injectie van Gekooide Fluoresceïne

1. Bereid 5% stockoplossing (5mg gekooid-fluoresceïne / 100 pi 0,2 M KCl) van dextran-geconjugeerde 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) gekooide fluoresceïne (10.000 MW dextran, anionische, Invitrogen, moleculaire probes, Carlsbad, Californië , cat. nee. D-3310). Aliquot en op te slaan in -20 ° C. Merk op dat DMNB-kooi fluoresceïne is gevoelig voor licht en moet worden bewaard in het donker.
2. Bereid een injectie via gemaakt van 1% agarose (Sigma, St. Louis, MO, cat. Nee. A9539), zoals beschreven in "De zebravis boek" ^1.
3. Bereid 2 liter E3 medium door verdunning van een 100 x E3 stamoplossing.
4. Op de avond voor injectie, voor te bereiden paring kooien scheiden van het mannetje (s) van de vrouwelijke (s) van het gewenste transgene lijn te drukken een zichtbare fluorescerende mijlpaal (GFP, RFP enz.) die worden gebruikt voor het lokaliseren van de doelcellen voor fotoactivatie.
5. Bereid capillaire injectienaalden (Thin Wall glazen capillairen met gloeidraad, World precisie-instrumenten, Sarasota, FL, cat. Nee. TW100F-6) met behulp van een micropipet trekker (Sutter Instrument, Novato, CA, P-97).
6. Dooi een hoeveelheid van 5% kooi fluoresceïne op ijs.
7. Verdun de 5% gekooide fluoresceïne stockoplossing in 0,2 M KCl tot een uiteindelijke concentratie van 1%, en blijf op ijs. Vermijd blootstelling aan licht.
8. Setup paring kruizen bereid in stap 4.
9. Het verzamelen van de bevruchte eicellen zodra ze worden gelegd. Orient een-cellig stadium embryo's in de agarose spuitgietmatrijs bedekt met ^een E3.
10. Met behulp van een microloader tip (Eppendorf, Hamburg, Duitsland, cat. Nee. 5.242 956.003) backfill een injectienaald met ~ 1 pl van 1% gekooide fluoresceïne-oplossing.
11. Plaats geladen naald in een micromanipulator aangesloten op een gas-powered microinjector (pneumatisch picopump, World precisie-instrumenten, Sarasota, FL, PV820).
12. Pas de injectie volume op 2-3nl en direct te injecteren de gekooide-fluoresceïne in het cytoplasma van de cel. Injecteer een minimum van 50 embryo's per experiment.
13. Incubeer embryo's in het donker bij 28,5 ° C in E3 om de gewenste ontwikkelingsstadium. Als embryo's die ouder zijn dan 24 uur na de bevruchting worden geanalyseerd, voeg 0,1% phenylthiourea (PTU, Sigma, St. Louis, MO, cat. Nee. 22290-9) naar pigmentatie remmen.

2. Embryo Montage

1. Bereid verse E2-oplossing (zie oplossingen voor een deel, kan worden opgeslagen bij 4 ° C voor een week).
2. Coat 60 mm petrischalen met een dun laagje van 1% agarose opgelost in E2 medium.
3. Bereid 2% laag smeltpunt agarose (Ultra Pure LMP agarose, Invitrogen, Carlsbad, CA, cat geen 16520100..) Voor het inbedden van: los de agarose in steriel dubbel gedistilleerd water verwarmen in de magnetron aan de kook. Houd de buis kap te openen tijdens het opwarmen. Aliquot 1 mL in microcentrifugebuizen en te houden in een verwarmings-blok bij 72 ° C.
4. Verwijder de chorions van de embryo's door zachtjes te trekken van de chorion apart met een scherp pincet (nr. 5). Houden embryo's in E2 oplossing op een agar-gecoate schaal (zie stap 2). Dechorionated embryo's moeten worden behandeld met vuur-gepolijst glas Pasteur pipet omdat ze kunnen blijven plakken aan polypropyleen pipetten. Niet bloot te stellen de dechorionized embryo aan de lucht als deze embryo's zouden kunnen worden beschadigd door de vloeistof oppervlaktespanning.
5. Verzamel de geselecteerde embryo in een klein volume van E2 met behulp van een brand-gepolijst glas Pasteur pipet, en plaats het embryo op 60 mm petrischaaltje. Monteer een druppel (~ 150 pi) van 2% agarose (stap 3) naast de embryo. Snel meng de twee druppels op een homogene finale ~ 1% agarose mengsel te verkrijgen en het gebruik van een dissectiemicroscoop oriënteren het embryo met de dorsale zijde van de objectief lens.
6. Wacht tot de agarose is gestold en voeg E2 medium totdat de embedded embryo is ondergedompeld in vloeistof. Het verdient de voorkeur om een ​​enkel embryo per schotel te krijgen als het kan worden vrijgesteld van de agarose na het fotoactivatie proces.

3. Fotoactivatie

1. We maken gebruik van een Zeiss LSM 510 META NLO twee-foton microscoop uitgerust met een breedband instelbare (700-1020nm) Mai Tai-HP-femtoseconde laser uit Spectraphysics.
2. Plaats de gemonteerde embryo op een bord de houder onder de microscoop. De fluorescerende mijlpaal in het embryo wordt gevisualiseerd met behulp van 40x/0.8W Achroplan water ondergedompeld doelstelling. Voor de volgende stappen die we niet descanned detector (NDD) te gebruiken met een band pass filter (BP) van 500-550nm.
3. Als voorwaarde voor het fotoactivatie proces, het verkrijgen van ruimtelijke fluorescerende informatie van de regio van belang door de overname van foto-serie van de meest ventrale aan dorsale deel van de gedetecteerde fluorescerende signaal met twee-foton laser golflengte van 860nm (voor GFP detectie). Te dien einde kan voldoende resolutie worden verkregen met een spanwijdte van 6μm tussen ieder verworven focal plane.
4. Selecteer het doelz-vlak voor fotoactivatie en breng deze regio in beeld. Afhankelijk van het doel van het experiment, kan de regio van belang kan zijn binnen of buiten de GFP zichtbaar landmark. Neem een ​​enkel beeld in deze z-vlak. Sla de afbeelding en bewaar deze te openen in een apart venster.
5. Stel de twee-foton laser golflengte 720nm en wanneer de laser is in mode-slot open de 'Edit bleekmiddel' menu. Definiëren de regio van belang (ROI) voor fotoactivatie volgens de afbeelding die op 860nm (stap 4) met behulp van de 'Define regio' menu. Het is cruciaal om de ROI op deze afbeelding te selecteren na het verschuiven van de laser golflengte 720nm als de laatste handeling verandert de x, y posities van de waargenomen veld.
6. Pas de volgende parameters voor fotoactivatie in het menu 'Bewerken bleekmiddel' (zie stap 9): a) de relatieve laservermogen; b) het aantal iteraties, c) scansnelheid.
7. Druk op 'Bleach' in het venster 'Bewerken bleekmiddel' en wacht tot de laser stopt.
8. Schakel terug naar 860nm, het verwerven van een enkel vlak afbeelding om de intensiteit van het resulterende gefotoactiveerd materiaal en een tweede reeks van het beeld overname van de Z-span (dikte) van de geactiveerde domeinnaam te evalueren evalueren.
9. Beschouw de volgende parameters voor fotoactivatie:
   1. Men moet empirisch vast te stellen de optimale omstandigheden voor fotoactivatie door het variëren van twee parameters: laser intensiteit en duur van fotoactivatie. De relatieve laservermogen kan worden gecontroleerd door de akoestisch-optische modulator (AOM) transmissie. De duur van fotoactivatie is een functie van het aantal iteraties en de scansnelheid.
   2. Bepaal het lineaire bereik van de fluorescentie-intensiteit, om verzadiging van het Uncaged fluorescentie te vermijden.
   3. Er is een lineaire correlatie bestaat tussen de verkregen fluorescentie-intensiteit van de Uncaged moleculen en de z-as spanwijdte van de gefotoactiveerd kloon ^2.

4. Detectie van de Uncaged Fluoresceïne

1. Na fotoactivatie, verhogen de embryo's in het donker bij 28,5 ° C in E2 medium met 0,1% PTU om het uiterlijk van de pigmentatie van de huid te voorkomen.
2. Op het gewenste ontwikkelingsstadium, verwijder het embryo uit de agarose onder een dissectie microscoop. Met behulp van een puntig scalpel, dus maak een "V"-vormige incisie in de agarose de buurt van de embryo dat de "V" wijst naar het hoofd van de embryo's. Plaats een gesloten tang op het punt van de "V" bij het hoofd van het embryo en duw opent de tang het scheiden van de agarose langs de lengte van het embryo en het vrijgeven van het embryo in het medium.
3. Verzamel de embryo's met een vuur-gepolijste Pasteur pipet en bevestig met paraformaldehyde (PFA, 4% in 1 x PBS, pH 7,2) voor een van beide 3 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
4. Verwijder de fixeer-oplossing en spoel 2-3 keer in PBST voor minstens 5 minuten bij kamertemperatuur.
5. Was de embryo's met 100% methanol gedurende 10 minuten, te vullen met verse methanol en incubeer bij -20 ° C gedurende ten minste twee uur.
6. Hydrateren embryo's van opeenvolgende incubaties (5 min elk) in een reeks van verdunde methanol in PBSTr: 80%, 60%, 40% en 20%. Was 2 x 10 minuten in PBSTr.
7. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in 500 pi van Blocking oplossing.
8. Voeg een anti-fluoresceïne-alkalische fosfatase (AP) Fab fragmenten (Roche, Palo Alto, CA, cat. Nee. 11426338910), verdund 1:500 in het blokkeren oplossing en incubeer overnacht bij 4 ° C (plaats microcentrifugebuizen op hun kant) .
9. Was 5 x 15 minuten in PBST.
10. Was 5 minuten in 0,2 M NaCl in TNT.
11. Was 5 minuten in 0,4 M NaCl in TNT.
12. Equilibreren 3 x 5 minuten in vers bereide Prestain oplossing.
13. Los een Fast Red tablet (Roche, Palo Alto, CA, cat. Nee. 11496549001) in 2 ml Prestain oplossing. Het wordt aanbevolen om de oplossing om met Whatman nr. 2 papier om niet-opgeloste deeltjes weg te laten filteren. Als alternatief, spin down oplossing en gebruik van de heldere bovenstaande vloeistof af.
14. Voeg 500 ul Fast Red oplossing aan elke buis, incubeer in het donker bij kamertemperatuur, en de monitor kleur ontwikkeling tot het gewenste signaal-achtergrond verhouding is bereikt (20 minuten tot enkele uren). Als achtergrond ontwikkelt, transfer naar 4 ° C. Na een uur incubatie, te vullen met een nieuwe Fast Red kleuroplossing.
15. Stop de kleuring reactie van 3 x 5 minuten wassen in PBST.
16. Fix voor 20 minuten in 4% PFA bij kamertemperatuur.
17. Was 2 x 5 minuten in PBST.
18. Duidelijk embryo's door middel van een serie van 25%, 50% en 75% glycerol in PBS tot embryo's worden afgerekend op de bodem van de buis. Embryo's kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor een paar dagen.

5. Fluorescerende Visualisatie van de Uncaged omgeving

1. Bereid een microscoop glijbaan voor montage: het gebruik van een 1 ml injectiespuit toe te passen vier plaatsen van duidelijke siliconenvet op de dia, geplaatst op een afstand van ~ 15 mm van elkaar. Monteer het embryo in de center in ~ 200 pi van 75% glycerol en plaats een dekglaasje (nr. 0; 18x18mm) aan de bovenkant en zachtjes tegen de silicone tot de glycerol oplossing beslaat het oppervlak tussen de dia's te duwen.
2. Plaats de gemonteerde embryo op het podium en breng het in beeld met behulp van een 40x objectief. Schaf een confocale Z-serie van afbeeldingen met behulp van 488nm en 543nm Argon HeNe lasers als de excitatie bron.
3. De z-as spanwijdte van de photoactivatated domein kan worden geanalyseerd met behulp van 3D-reconstructie van de Uncaged embryo met behulp van een beeldanalyse-software.

6. Oplossingen

100 x E3	174mM NaCl, KCl 21mm, 12mm MgSO 4, 18mm Ca (NO3), 15mm HEPES, pH = 7,4. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 ° C
20 x E2	0,3 M NaCl, 10 mM KCl, 20mm CaCl 2 * 2HOH, 20mm MgSO 4 * 7HOH, 3mm KH 2 PO 4, 0,8 mm Na 2 HPO 4 * 2HOH, filtraat en bewaar bij kamertemperatuur
1 x E2	Verdun 20 x E2 in dubbel gedistilleerd water en voeg vers gemaakte NaHCO 3 (aan de uiteindelijke concentratie van 0,7 mm), penicilline en streptomycine (verdun pen STREP oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 1 x 100 E, die van penicilline en streptomycine 100mg per ml (Invitrogen bevat , Carlsbad, CA, cat. nee. 15140-122))
PBST	0,1% Tween-20 in PBS
PBSTr	0,3% Triton in PBS
Blockingbuffer	10% BSA, 0,3% Triton, een% DMSO in PBS
TNT	100mm Tris-HCl pH-7.5, 150mm NaCl, 0,5% Tween-20 in dubbel gedistilleerd water
Prestain oplossing	100mm Tris-HCl pH-8.2, 0,4 miljoen NaCl, 0,1% Tween-20 in dubbel gedistilleerd water

7. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van het gebruik van twee-foton microscopie aan agenten photoactivate in een levend zebravis embryo wordt gepresenteerd. Met behulp van een soortgelijke aanpak die we eerder volgde de lijn van de gefotoactiveerd gelabeld neurale voorlopercellen in de zebravis hersenen ^2,3. Figuur 1 toont fotoactivering van een gekooide fluoresceïne geconjugeerd tracer kleurstof in voorste neurale plaat van de zebravis embryo's met een neurog1:: GFP reporter transgene, die diende als een live-intrinsieke mijlpaal.

Embryo's werden geïnjecteerd met gekooide fluoresceïne aan de ene cel podium en ingebed in agarose in knopstadium. Bij 3 - 5-somiet stadium de ruimtelijke coördinaten werden gemeten in de neurog1:: GFP transgene embryo naar de regio van belang (ROI) te bepalen voor uncaging (Figuur 1A, A '). We Uncaged het fluoresceïne afstamming tracer in een specifiek domein van de neurale plaat (Figuur 1B, B '). Vervolgens was het lot van dit gegeven gelabeld neurale progenitor subdomein vastgesteld op prim5 (24 uur na bevruchting) fase door immunokleuring van de Uncaged fluoresceïne (figuur 1C, C ').

De omvang van twee-foton laser uncaging, dat wil zeggen de intensiteit van de Uncaged fluorescentie en de dikte van de gefotoactiveerd domein (z-span), kunnen worden aangestuurd door het aanpassen van twee parameters: laser intensiteit en duur. Dit laatste kan worden gecontroleerd door aanpassing van de iteratie aantal en de scansnelheid (zie deel 3, stap 9; Russek-Blum, 2009). In het voorbeeld in figuur 1, gebruikten we de relatieve laservermogen van 12% AOM transmissie, 20 iteraties en scansnelheid van 25,6 μsec / pixel. Met behulp van deze instellingen hebben we het label een ROI met 90 tot 10 cellen en een gefotoactiveerd z-spanwijdte van 30μm (~ 1-2 cel rijen).

Figuur 1. Een vertegenwoordiger resultaat van fotoactivering van gekooide fluoresceïne in levende zebravis embryo met behulp van twee-foton microscopie.

Schematische afbeelding (AC) en representatieve beelden (A'-C ') van de fotoactivatie proces. Live-zebravis embryo (A, A ') tot uitdrukking GFP onder de controle van neurogenin-1 promotor (neurog1:: GFP), dat was met gekooide fluoresceïne kleurstof ingespoten tracer op de 1 cellig stadium. Bij de 3-5 - somiet podium, was een discrete deel van de voorhersenen primordium (diencephalon) gefotoactiveerd en de Uncaged fluoresceïne kleurstof tracer kon worden gedetecteerd (B, B '). Na de fotoactivatie procedure, was het embryo geïncubeerd bij 28,5 ° C en de hersenen cellen met de Uncaged fluoresceïne werden opgespoord door anti-fluoresceïne immunokleuring 24 uur na de bevruchting (HPF, C, C '). Dien, diencephalon,. Tel, telencephalon..

Discussie

Foto-activeerbare verbindingen zijn moleculen waarvan de functie wordt gemaskeerd totdat ze worden verlicht met een specifieke golflengte (meestal UV), het induceren van een fotochemische reactie die de moleculen omgezet in een biologisch of chemisch actieve toestand. Deze probes geven een zeer krachtige tools in de celbiologie onderzoek, omdat de activering kan nauwkeurig worden tijdelijk en ruimtelijk gecontroleerd door beperking van hun blootstelling aan licht.

Het grote voordeel van mult...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dextran-geconjugeerde 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) gekooide fluoresceïne (10.000 MW dextran, anionisch)	Invitrogen	D-3310	moleculaire probes
Agarose voor injectiegoot en gecoate platen	Sigma-Aldrich	A9539
Dunwandige glazen capillairen met filament	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-6
Micropipet-puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Microloader-tip	Eppendorf	5242 956.003
Pneumatische picopomp	World Precision Instruments, Inc.	PV820
Fenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	22290-9
Agarose met laag smeltpunt voor montage van embryo's	Ultra Pure LMP agarose	16520100
Anti-fluoresceïne-alkalische fosfatase (AP) Fab-fragmenten	Roche Group	11426338910
Fast Red	Roche Group	11496549001