Photoconversion van gezuiverde fluorescerende eiwitten en dual-probe optische markering in levende cellen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een algemene aanpak voor photoconversion van fluorescerende eiwitten te voeren op een confocale laser scanning microscoop. We beschrijven de procedures voor de photoconversion van puried eiwit monsters, evenals voor dual-probe optische markeren in levende cellen met mOrange2 en Dronpa.

Samenvatting

Photoconvertible fluorescerende eiwitten (pc-KP's) zijn een klasse van fluorescerende eiwitten met "optische highlighter"-mogelijkheid, wat betekent dat de kleur van de fluorescentie kan worden veranderd door blootstelling aan licht van een specifieke golflengte. Optische highlighting maakt niet-invasieve markering van een subpopulatie van fluorescerende moleculen, en is daarom ideaal voor het opsporen van enkele cellen of organellen.

Kritische parameters voor een efficiënte photoconversion zijn de intensiteit en de belichtingstijd van de photoconversion licht. Als de intensiteit te laag is, zal photoconversion worden langzaam of niet optreden op alle. Aan de andere kant kan te veel intensiteit of te lange blootstelling photobleach het eiwit en daardoor verminderen de efficiëntie van de photoconversion.

Dit protocol beschrijft een algemene aanpak van het opzetten van een confocale laser scanning microscoop voor pc-FP photoconversion toepassingen. Eerst beschrijven we een procedure voor het bereiden van gezuiverde eiwit druppel monsters. Dit monster formaat is erg handig voor het bestuderen van de fotofysische gedrag van fluorescerende eiwitten onder de microscoop. Ten tweede, zullen we gebruik maken van de eiwit druppel monster te laten zien hoe de microscoop voor photoconversion configureren. En tot slot, laten we zien hoe de optische markering uit te voeren in levende cellen, inclusief dual-probe optische markeren met mOrange2 en Dronpa.

Protocol

1. De voorbereiding van fluorescerend eiwit druppel monsters

Een fluorescerend eiwit druppel monster bestaat uit een 1-octanol/water emulsie met de fluorescerende proteïne die woonachtig zijn in de waterfase. Deze emulsie is ingeklemd tussen een microscoop glijbaan en een 22 mm vierkant deksel glas voor microscopie toepassingen.

1. Alvorens fluorescerend eiwit druppel monsters de microscoop dia's en dekglaasjes moeten worden schoongemaakt en bedekt met een hydrofobe agent.
2. Schoon glaswerk door wassen 5 minuten met aceton en laten drogen door de lucht. (Optioneel, na het reinigen van het glaswerk kan worden behandeld gedurende 30 seconden in een plasma cleaner om optimale resultaten te verkrijgen coating).
3. Bereid een 2% methyltrimethoxy oplossing in aceton en de vacht van de glazen tijdens een twee minuten incubatie in deze oplossing. Na het coaten Verwijder het glaswerk uit de oplossing en laat het drogen door de lucht. Spoel het daarna met 70% ethanol uit een spray fles en laat het weer droog. (Optioneel, op dit punt het glaswerk kan worden gebakken gedurende 1 uur bij 80 ° C om covalent de coating link naar het glaswerk). Gecoate glaswerk kan worden opgeslagen voor ten minste een maand.
4. Fluorescerende eiwitten worden gezuiverd als Zijn _6-gelabeld eiwit van E. Coli ^1. Meet de absorptie spectrum van het gezuiverde eiwit en een voorraad verdunning met een optische dichtheid van ~ 0,1 in STE buffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA) voor te bereiden, met 0,1% bovine serum albumine (BSA) . Daarnaast bereiden 10 ml van een 1:1 mengsel van 1-octanol en STE buffer in een 15 ml conische buis en meng krachtig. Na het mengen laten tot de fasescheiding is voltooid. De bovenste fase is de 1-octanol. (Let op: Omdat de 1-octanol heeft een sterke geur is het belangrijk om een ​​gesloten afvalcontainer te gebruiken voor alles dat in contact komt met 1-octanol.)
5. Om de emulsie pipet 45 ul 1-octanol en 5 ul fluorescerend eiwit in een microfugebuis. Tik op de buis een paar keer met je vinger om de vorming van de emulsie op Start en vervolgens de buis ultrasone trillingen gedurende 30 seconden in een ultrasoonapparaat bad. In de tussentijd krijgen een gecoate microscoop glijbaan en dekglas klaar. Na sonicatie de emulsie moet volledig troebel. Direct na het sonicatie pipet 4 ul emulsie uit het midden van de buis op een gecoate objectglaasje en dek af met een deksel gecoat glas.
6. Als de procedure correct wordt uitgevoerd de emulsie gelijkmatig verdeeld tussen de microscoop glijbaan en het object glas. Binnen enkele minuten het monster moet stabiel zijn, bestaande uit ~ 10 urn dikke TL-druppeltjes met verschillende diameter. De grootste druppels zijn dicht bij het centrum van het monster en de kleinere verder gelegen naar de randen.

2. Het opzetten van een experiment photoconversion

De volgende procedure is een algemene strategie voor het opzetten van een fluorescerend eiwit photoconversion experiment. Deze procedure kan worden toegepast voor de gezuiverde eiwitten als voor levende cellen.

1. De volgende parameters geven een algemeen uitgangspunt voor het instellen van uw photoconversion experiment:
   40x 1.3NA olie-immersie objectief
   Image size = 512 x 512 pixels
   Scan zoom = 4
   
   Pixelverblijftijd = 6 μsec.
   Z-resolutie (pinhole size) = 3 micrometer
2. Configureren twee detectie-kanalen van de eerste en photoconverted fluorescentie, evenals een "photoconversion kanaal". In dit voorbeeld gebruiken we gezuiverd mOrange2 eiwit, dat is een oranje-to-rood photoconvertible fluorescerend eiwit. De oranje soort is vastgesteld met behulp van 561 nm excitatie en de fluorescentie is verzameld tussen 570 nm en 630 nm. De photoconverted rode soort is vastgesteld met behulp van 633 nm excitatie en de fluorescentie is verzameld tussen 640 nm en 700 nm. Voor de "photoconversion channel" te selecteren 488 nm excitatie en het verzamelen van fluorescentie tussen 490 nm en 540 nm. (Let op:. Beeldvorming van de photoconversion kanaal is niet strikt noodzakelijk)
3. Gebruik het kanaal voor de beeldvorming van de eerste fluorescentie met continue scannen naar het laservermogen en de detector te krijgen voor een optimale beeldkwaliteit aan te passen.
4. Activeer de photoconversion kanaal en selecteer een lage laservermogen. Start imaging een time lapse serie en geleidelijk te verhogen van de photoconversion laser tot een significante bleken van de eerste fluorescentie wordt waargenomen. Gaan met scannen totdat de eerste fluorescentie is ongeveer 75% gebleekt.
5. Deactiveer de photoconversion kanaal en activeer de detectie-kanaal voor de photoconverted fluorescentie. Begin imaging met een hoge detector te krijgen en een laag laservermogen en geleidelijk verhogen het laservermogen tot de photoconverted fluorescentie wordt gedetecteerd. Zodra u detecteert de photoconverted fluorescentie kun je laservermogen en detector te krijgen voor een optimale beeldkwaliteit aan te passen.
6. Ten slotte is het laservermogen wordt gebruiktfor photoconversion evenals de duur van de photoconversion moeten worden geoptimaliseerd. Het verhogen van de photoconversion laservermogen zal versnellen het tempo van de photoconversion, echter te veel laser macht zal het eiwit photobleach.
7. Zodra de optimale photoconversion laservermogen en duur zijn bepaald, kunnen deze parameters worden gebruikt om een ​​standaard photobleaching of FRAP module en de "photoconversion channel" is niet meer nodig te configureren.

3. Dual-probe optische markeren met mOrange2 en Dronpa

Omwille van de rood-verschoven spectrale eigenschappen, kan mOrange2 worden gebruikt in combinatie met het groen fluorescerend eiwit photoswitchable Dronpa voor dual-probe optische markering om selectief benadrukken van de vier individuele cel (organel) populaties mogelijk te maken.

1. Cellen worden gekweekt in glazen bodem MatTek schotels en getransfecteerd 24 uur voorafgaand aan de beeldvorming met behulp van standaard Lipofectamine2000 transfectie ^1.
2. Stel de microscoop voor mOrange2 photoconversion zoals beschreven in paragraaf 2.
3. Configureer de microscoop voor Dronpa photoswitching. Dronpa fluorescentie kan worden afgebeeld met behulp van de mOrange2 "photoconversion kanaal" (zie stap 2.2). (Opmerking: Minimaliseer het laservermogen gebruikt voor beeldvorming Dronpa, omdat er te veel laservermogen zal inactivatie van Dronpa veroorzaken.) Voeg een kanaal voor Dronpa fotoactivatie. We maken gebruik van 800 nm twee-foton excitatie voor fotoactivatie, maar als alternatief dit kan worden bereikt met behulp van 405 nm excitatie. Bepaal de laser vermogen dat nodig is voor de beeldvorming, fotoactivatie en photoinactivation van Dronpa fluorescentie.
4. Let op: Photoconversion van mOrange2 en inactivatie van Dronpa komen beide bij 488 nm excitatie. Vanwege het hoge laser vermogen dat nodig is voor mOrange2 photoconversion zal dit ook inactiveren Dronpa fluorescentie. Aan de andere kant, Dronpa inactivatie gebeurt al bij veel lagere laservermogen en kan worden uitgevoerd zonder noemenswaardige mOrange2 photoconversion.
5. Wanneer de parameters voor mOrange2 photoconversion en Dronpa photoswitching zijn ingesteld, is dual probe optisch benadrukt bereikt door de volgende stappen. De eerste, inactiveren Dronpa fluorescentie in het hele gezichtsveld met een laag vermogen 488 nm excitatie. Ten tweede, selecteer een regio van belang en photoconvert mOrange2 met een hoog vermogen 488 nm excitatie. Tot slot, selecteer een regio van belang is voor Dronpa fluorescentie te activeren.

4. Representatieve resultaten

Figuur 1. Droplet monstervoorbereiding. A) de juiste wijze voorbehandeld druppel monster. B) Voorbeeld bereid zonder coating de microscoop glijbaan en dekglas. C) Sample bereid zonder toevoeging van 0,1% BSA.

Figuur 2. Effect van photoconversion laservermogen en de duur op mOrange2 photoconversion. Single druppeltjes met mOrange2 eiwit werden continu photoconverted met behulp van verschillende hoeveelheden van 488 nm laservermogen. Relatieve laservermogen gebruikt voor photoconversion was 10% (vast), 25% (stippellijn), en 100% (stippellijn). A) oranje fluo soorten. B) Photoconverted rood fluorescerende soorten.

Figuur 3. Dual-probe optische markeren met mOrange2 en Dronpa. A) cel die mOrange2-histon H2B en Dronpa-Mito voor photoconversion, waaruit oranje fluorescentie in de kern en groene fluorescentie in de mitochondriën. B) Dronpa fluorescentie werd uitgeschakeld met een laag stroomverbruik 488 nm excitatie, waardoor een minimale photoconversion van mOrange2. C) mOrange2 was photoconverted in rood met een hoog vermogen 488 nm excitatie. D) Dronpa fluorescentie werd weer ingeschakeld met behulp van 800 nm twee-foton excitatie. De panelen zijn overlays van de fluorescentie beelden samen met het differentieel interferentie contrast beeld.

Discussie

Het gezuiverde fluorescerend eiwit druppel monster is een zeer handige sample-indeling voor de fotofysische karakterisering van fluorescerende eiwitten, bijvoorbeeld om te studeren fotobleken kinetiek en photoconversion kinetiek. De extreem kleine druppels volume (~ 20 picoliter) faciliteert fotobleken en photoconversion experimenten, die kan moeilijk zijn uit te voeren in de cuvette gebaseerde systemen. Daarnaast, zoals hier de druppel monster is bij uitstek geschikt voor het opzetten van een confocale microscoop voor ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Objectglazen	VWR international	48312-003
22 mm dekglas	Corning	2940-245
1-octanol	Sigma-Aldrich	O4500
methyltrimethoxysilaan	Sigma-Aldrich	M6420
MatTek schaaltjes	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-019