Primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila Poppen

Samenvatting

Deze video toont de bereiding van primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila poppen. Standpunten van levende culturen tonen neurietuitgroei en beeldvorming van calcium niveaus met behulp van Fura-2.

Samenvatting

In deze video, tonen we de voorbereiding van de primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila poppen. De procedure begint met het verwijderen van hersenen van dieren op 70-78 uur na puparium vorming. De geïsoleerde hersenen worden weergegeven na een korte incubatie in papaïne gevolgd door verschillende wasbeurten in serum-vrij groeimedium. Het proces van mechanische dissociatie van elk brein in een 5 ul druppel van media op een dekglaasje wordt geïllustreerd. De axonen en dendrieten van de post-mitotische neuronen zijn sheered uit de buurt van de soma tijdens dissociatie, maar de neuronen beginnen te regenereren processen binnen een paar uur in de platen. Beelden tonen levende culturen op 2 dagen. Neuronen blijven om processen te werken tijdens de eerste week in de cultuur. Specifieke neuronale populaties kunnen worden geïdentificeerd met behulp van cultuur GAL4 lijnen om weefselspecifieke expressie van fluorescente merkers zoals GFP of RFP rijden. Hele cel opnames hebben aangetoond dat de gekweekte neuronen vorm functionele, spontaan actief cholinerge en GABA-erge synapsen. Een korte video-segment illustreert calcium dynamiek in de gekweekte neuronen met behulp van Fura-2 als een calcium indicator kleurstof tot spontane calcium transiënten en nicotine opgewekt calcium reacties in een schotel van gekweekte neuronen te controleren. Deze pop-hersenen culturen zijn een bruikbaar model systeem waarin genetische en farmacologische middelen kunnen worden gebruikt om intrinsieke en extrinsieke factoren die de vorming en de functie van centrale synapsen beïnvloeden te identificeren.

Protocol

Voorbereidingen voor de dag van het kweken:

1. Maak steriele ontleden oplossing.
2. Maak steriel DMEM en te houden in 10 ml bij 4 ° C gedurende 2 weken.
3. Maak steriel DDM2 supplementen en vries in 50 of 100 ul porties voor 1 maand.
4. Maak ConA / laminine.
5. Vacht dekglaasjes.
   Optioneel: Maak steriele CNBM en op te slaan ingevroren voor maximaal 4 maanden.

Op de dag van het kweken van

I. Bereid Enzyme Solution (ES) in laminaire flow hood

1. Doe 5 ml ontleden oplossing (DS) in een 15 ml centrifugebuis.
2. Weeg 0,8 mg van L-cysteïne in een 0,6 ml Ep....

Discussie

Neuronen geoogst uit de hersenen van het embryo / de postnatale knaagdieren kunnen worden gekweekt in de primaire cel cultuur waar ze uit te breiden neurieten en vormen functionele synaptische verbindingen. Methoden voor de voorbereiding van deze culturen zijn goed ingeburgerd en studies in knaagdieren neuronale culturen hebben een cruciale rol gespeeld bij het identificeren van genen en omgevingsfactoren betrokken zijn bij de regulering van synapsvorming en functie (Banker en Goslin, 1991). Terwijl insect neuronen uit een verscheidenheid v.......

Materialen

Coating Dekglaasjes: Zet geautoclaveerd dekglaasjes in een 60 mm petrischaal. Pipetteer 5 ul van Con A / Laminine mix op midden van elk dekglaasje aan. Plaats in 37 C incubator gedurende 2 uur. Spoel 3x coverslips met 100 ul van geautoclaveerd water per stuk. Gebruik stofzuiger bevestigd aan een steriele Pasteur pipet. Tijdens de laatste spoeling, pak het dekglaasje met een tang en droog beide kanten. Breng het dekglaasje met een 35mm petrischaal. Bewaren bij kamertemperatuur tot maximaal een maand.