Monstervoorbereiding voor metabolomics: een methode om celmonsters voor te bereiden op metabolietprofilering

Abstract

Bron: Zhao, Y.C. et. al., Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer. J. Vis. Exp. (2016).

Deze video beschrijft een techniek om borstkankercelmonsters voor te bereiden op metabolietprofilering. Borstkankercellen worden behandeld met estradiol, dat zich bindt aan de oestrogeenreceptor alfa en verandering veroorzaakt in de samenstelling van de metaboliet.

Protocol

1. Metabolomics Assay Monstervoorbereiding

1. Celkweek en -behandeling
   1. Zaai 400.000 MCF7 cellen per 10 cm plaat in groeimedium. Bereid voor elke behandeling drie monsters voor. Gebruik twee platen in elk monster om voldoende cellen te ontvangen voor de detectie. Verwijder op dag 3 het medium en voeg 5 ml vers medium met of zonder 10^-8 M Estradiol of E2 toe aan de cellen. Behandel de cellen gedurende 24 uur (37 °C in bevochtigde 5% CO_{2-atmosfeer).}
2. Voorbeeldverzameling
   1. Voeg 5 ml ijskoud 1x PBS toe aan de plaat, aspireer de PBS na de plaat meerdere keren kort te hebben gekanteld. Herhaal dit twee keer en verwijder zoveel mogelijk PBS na de laatste wasbeurt.
   2. Voeg 750 μl pre-koude aceton toe aan elke plaat en schraap de cellen. Combineer de cellen in aceton van twee platen tot een buisje van 2 ml op ijs.
   3. Celtelling voor normalisatie
      1. Gebruik voor elke behandeling twee extra platen voor celkwantificering. Om de cellen van de plaat te de-bevestigen, voegt u 2 ml HE-buffer (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO₃ en 1 mM EDTA) toe aan elke plaat en incubeert u gedurende 5 minuten.
      2. Verzamel en meng de cellen goed door cellen in de HE-buffer te pipetten. Gebruik in totaal 20 μl celoplossing om het celnummer te tellen met behulp van een hemocytometer.
3. Bewaar de monsters bij -80 °C voordat u ze naar het Metabolomics-centrum stuurt om de metabolieten te identificeren en te kwantificeren met behulp van gaschromatografiemassaspectrometrie (GC-MS) analyse.