Inductie en beoordeling van klasse Switch recombinatie in gezuiverd Murine B-cellen

Samenvatting

Na blootstelling aan antigeen, subpopulaties van geactiveerde B-cellen worden onderworpen aan een proces dat bekend staat als klasse switch recombinatie (CSR) van antilichamen isotypen te produceren met verschillende effector functies. Het protocol beschreven in dit rapport legt uit hoe MVO kan worden opgewekt en geanalyseerd In vitro Voor de doeleinden van het bestuderen van B-cel-functie.

Samenvatting

Humorale immuniteit is de tak van het immuunsysteem onderhouden door B-cellen en gemedieerd door de secretie van antilichamen. Bij de B-cel activatie, de immunoglobuline locus ondergaat een reeks van genetische modificaties te veranderen het bindend vermogen en effector functie van de uitgescheiden antilichamen. Dit proces wordt benadrukt door een genomische recombinatie gebeurtenis bekend als klasse switch recombinatie (CSR), waarin de standaard IgM-antilichaam isotype is vervangen door een van de IgG, IgA of IgE. Elke isotype beschikt over verschillende effector functies waardoor MVO cruciaal voor het behoud van de immuniteit.

Diversificatie van de immunoglobuline locus wordt gemedieerd door het enzym activatie-geïnduceerde cytidinedeaminase (AID). Een schematische video beschrijft dit proces in detail is online beschikbaar (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID activiteit en het MVO-pad worden over het algemeen bestudeerd in de beoordeling van de B-cel functie en humorale immuniteit bij muizen. Het protocol beschreven in dit rapport presenteert een methode van B-cel isolatie van murine milt en de daaropvolgende stimulatie met bacteriële lipopolysaccharide (LPS) te bewegen klasse overschakelen naar IgG3 (voor andere antilichaam isotypes zie tabel 1). Daarnaast is de fluorescente kleurstof cel vlekken carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) gebruikt om de celdeling van de gestimuleerde cellen, een proces dat van cruciaal belang om over te stappen ^{1, 2} isotype monitor.

De regulering van de AID en het mechanisme waarmee MVO gebeurt nog steeds onduidelijk en dus in-vitro-klasse switch testen leveren een betrouwbare methode voor het testen van deze processen in verschillende muismodellen. Deze testen zijn eerder gebruikt in de context van gen-deficiëntie gebruik van knock-out muizen ^3. Bovendien kan in vitro schakelen van B-cellen worden voorafgegaan door virale transductie voor het moduleren van genexpressie door RNA knockdown of transgenexpressie ^4-6. De gegevens van dit soort experimenten hebben beïnvloed ons begrip van de AID activiteit, resolutie van de MVO-reactie, en antilichaam-gemedieerde immuniteit in de muis.

Protocol

Stap I: Isolatie van milt B-cellen via magnetische verrijking

1. Experimentele muizen moet worden leeftijd van 8-12 weken op volle rijping van het immuunsysteem te verzekeren.
2. Euthanaseren de muis door cervicale dislocatie en genieten in 70% ethanol. Chirurgisch te verwijderen van de milt door het maken van een incisie door de huid en spieren van de linker hypochondrium van de buik en snijd het in drie grote stukken in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Zorg ervoor dat alle instrumenten en reagentia steriel zijn.
3. Met behulp van de rubber einde van een 1 ml zuiger, de milt zachtjes beslag door een 70 um cel zeef in PBS. Zorg ervoor dat u een duwende beweging in plaats van een vermalen beweging te gebruiken als slijpen kan leiden tot scheuren van grotere (dwz prolifererende) cellen.
4. Spin down de cellen op niet meer dan 350 g gedurende 5 minuten en resuspendeer de pellet in PBS. Tel de geresuspendeerd cellen met behulp van een hemocytometer.
5. Maak een suspensie van 1x10 ⁸ cellen / ml in PBS met 5% normaal serum rat in een steriele 5 mL polystyreen buis met een kap (maximaal volume van 2 ml per buis).
6. Voeg 50 ul van EasySep negatieve selectie Mouse B Cell Enrichment cocktail voor elke mL van cellen. Pipet het mengsel, cap de buizen, en plaats in de koelkast gedurende 15 minuten.
7. Voeg 100 ul EasySep Biotine Selectie Cocktail voor elke mL van cellen. Pipet het mengsel, cap de buizen, en plaats in de koelkast gedurende 15 minuten.
8. Voeg 100 ul van EasySep magnetische nanodeeltjes (zorgen voor nanodeeltjes worden goed gemengd en de oplossing homogeen is) voor elke mL van cellen. Pipet het mengsel, cap de buizen, en plaats in de koelkast gedurende 5 minuten.
9. Top de oplossing voor 2,5 ml met PBS en plaats het in een EasySep magneet voor 5 minuten. Omkeren van de magneet en buis en giet al snel in een nieuwe polystyreen buis. Schud de buis als negatief geselecteerde cellen zullen magnetisch gebonden zijn aan de buis muren.
10. Verder te verhogen de zuiverheid van de celsuspensie, kan de buis worden opnieuw in de magneet voor een extra 5 minuten en gegoten in een nieuwe buis. Dit kan verminderen de totale cel herstel.
11. B-cel zuiverheid kan worden beoordeeld door flowcytometrische analyse van het B-cel oppervlakte markers. Na de verrijking, we voortdurend zien met een zuiverheid van> 95% B220 positieve cellen.

Stap II: CFSE cel verkleuring

1. Resuspendeer de geïsoleerde cellen in warme PBS aangevuld met 0,1% bovine serum albumine bij een uiteindelijke concentratie van 1 x 10 ⁶ cellen per ml.
2. Bereid een 5mm voorraad oplossing van CFSE (verdund in steriele dimethylsulfoxide) en voeg 2μL voor elke mL van cellen in de buis. De uiteindelijke concentratie van 10μM is optimaal voor de kleuring van primaire B-cellen.
3. Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten in het donker (let op: CFSE is lichtgevoelig en moet in het donker bewaard indien mogelijk zijn).
4. Quench de vlek door het toevoegen van een gelijk volume van runderen kalfsserum naar uw cellen en incuberen op ijs gedurende 5 minuten.
5. Was de cellen door bijvullen van de buizen met kweekmedium (zie stap III voor recept) en centrifugeren bij 350 g. Merk op dat ten minste 5 keer het volume equivalent van media moet worden toegevoegd om de viscositeit van de runder-kalf serum tegen te gaan en voor de cellen om een ​​pellet te produceren.
6. Was de cellen twee keer meer in cultuur medium. De cellen zijn nu klaar voor stimulatie.

Stap III: cel stimulatie met LPS

1. Bereid uw in-vitro-B celkweekmedium te vullen RPMI 1640 met 10% foetaal kalf serum en 50 uM β-mercapto-ethanol /.
2. Bereid uw stimulatie medium door het toevoegen van LPS op een uiteindelijke concentratie van 50μg/mL. Aliquot 125 pi van de stimulatie medium in elk putje van een vlakke bodem met 96 putjes weefselkweek plaat.
3. Bereid uw CFSE-gekleurde B-cellen in kweekmedium zonder LPS bij een uiteindelijke concentratie van 3,2 x 10 ⁶ cellen / ml. Voeg 125 pi van de celsuspensie aan de wells met uw stimulatie medium en meng door pipetteren voorzichtig.
4. Elk putje bevat nu 4 x 10 ⁵ cellen in een uiteindelijke LPS concentratie van 25 ug / ml. Dit zorgt voor een optimaal niveau van de celproliferatie en klasse schakelen, maar wijzigingen in deze waarden kunnen worden gedaan zoals gewenst.
5. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO ₂ voor 72 tot 96 uur. Na 48 uur zal clusters van grote prolifererende B-cellen zijn duidelijk zichtbaar onder een microscoop.

Stap IV: Flowcytometrische analyse van klasse wisselen

1. Als u klaar bent om naar te kijken class switching, verwijder je cellen uit hun kweekomstandigheden en twee keer was ze in 1 ml vlekken buffer (PBS met 2% boviene kalfsserum).
2. Om niet-specifieke antilichaam kleuring van je cellen, pellet de cellen te voorkomen dat door het draaien van hen neer op 350 g en incute ze in 100μL van verkleuring buffer met 5% normale muis serum en 1μg van FcBlock per106 cellen gedurende 15 minuten op ijs. Cel blokkeren moet worden uitgevoerd op het ijs.
3. Zonder het wassen van je cellen, voeg 1μg per 10 ⁶ cellen van een fluorescent gelabelde anti-muis antilichaam IgG3 en laat de cellen vlek gedurende 30 minuten op ijs.
4. Twee keer wassen van de cellen door centrifugeren en resuspendeer in 200-300 ul vlekken buffer. De cellen zijn nu klaar voor beoordeling door flowcytometrie.
5. CFSE is optimaal enthousiast bij 492 nm (door een argon-ion laser) en stoot op 517 nm. De excitatie-en emissiespectrum van de IgG3 antilichaam is afhankelijk van zijn geconjugeerde fluorescente kleurstof.

Representatieve resultaten

Na de magnetische verrijking, moet de celsuspensie eruit als een homogene populatie van niet te onderscheiden kleine ronde cellen (Figuur 1A). Na 48-72 uur van de stimulatie, zal geïsoleerde clusters van vergrote prolifererende cellen zijn duidelijk zichtbaar (figuur 1B). Een groot deel van de niet-prolifererende cellen zal verschijnen klein en korrelig als ze ondergaan apoptose.

MVO kan normaal gesproken worden gedetecteerd op het hoogste niveau tussen de 72 en 96 uur na stimulatie voor het grootste deel van de cellen beginnen te sterven ^7. In dit stadium, moeten de cellen hebben ondergaan een aantal celdelingen met geschakelde cellen die in de latere dochter celpopulatie. Een vertegenwoordiger flowcytometrische perceel van CFSE verdunning en oppervlakte-expressie van IgG3 na 96 uur van LPS stimulatie is te zien in figuur 2.

Tabel 1. Isotype schakelen cocktails. Let op: Stimulant concentraties zijn slechts aanbevelingen. Titraties kan nodig zijn.

Gewenste Isotype	Stimulatie Cocktail
IgG1and IgE	LPS (25μg/mL) en IL-4 (10 ng / mL)
IgG1and IgE	Anti-CD40 (10μg/mL) en IL-4 (10 ng / mL)
IgG2a	LPS (25μg/mL) en IFN-γ (10 ng / mL)
IgG2b en IgG3	LPS (25μg/mL)
IgA	LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng / ml) en IL-5 (1.5 ng / mL)

Figuur 1. Isolatie en LPS stimulatie van milt B-cellen. (A) Magnetisch verrijkt milt B-cellen voor de LPS stimulatie. (B) 48 uur na stimulatie met 25 ug / ml LPS. Woekerende cellen worden gezien als clusters in een achtergrond van straal-en apoptotische cellen.

Figuur 2. Proliferatie en klasse switch recombinatie na 96 uur. (A) CFSE verwatering voor LPS gestimuleerde cellen na 96 uur in cultuur. Iedere onafhankelijke piek vertegenwoordigt een verwatering van de CFSE fluorescentie die overeenkomt met een onafhankelijke celdeling. (B) IgG3 uitdrukking met de opkomst van een IgG3 positieve populatie na verscheidene rondes van celdeling.

Discussie

Het protocol hierboven geschetste biedt een standaard test om AID expressie en functie analyseert tijdens de les schakelen van de primaire muizen B-cellen. Dit protocol maakt gebruik van bacteriële LPS te induceren schakelen van IgM naar IgG3, maar aanpassingen aan de stimulatie media kan worden gemaakt om te bewegen te schakelen naar andere isotypen (samengevat in Tabel 1 ^{8, 9).}

We hebben opgemerkt dat, voor nog onbekende redenen, foetaal kalf serum kan het niveau van de klasse t...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fosfaatgebufferde zoutoplossing	GIBCO, by Life Technologies	14190
EasySep Mouse B Cell Enrichment Kit	Stem Cell Technologies	19754
Polystyreenbuisjes	BD Biosciences	352058
Bovien serumalbumine	Sigma-Aldrich	A7030
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Invitrogen	C34554
Kalfsserum	Hyclone	SH30072.03
RPMI 1640 cultuursmedium	GIBCO, by Life Technologies	11875
Lipopolysachariden uit Escherichia coli	Sigma-Aldrich	L6529
β-mercapt–ethanol	GIBCO, by Life Technologies	21985
Fetaal runderserum	Hyclone	SH30396.03
Normaal muizenserum	Jackson ImmunoResearch	011-000
Gezuiverde rat anti-muis CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141
Rat anti-muis IgG3	BD Biosciences	553401