$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Dag 1:
MexB van Pseudomonas aeruginosa is gecodeerd door pFB101. De MexB gen werd geamplificeerd van P. aeruginosa genomisch DNA en ingebracht in de Ndel en Xhol restrictieplaatsen van de pET30b + vector. Het construct bevat een C-terminale hexahistidine tag.
- Het plasmide wordt gebruikt om E. te transformeren coli stam C43 (DE3) 12, en de transformanten worden uitgeplaat op LB-agar met 30 ug / ml kanamycine.
2. Dag 2: Overnachting Cultures:
- In de avond, zijn 4 x 3 ml LB kweken die 30 ug / ml kanamycine ingeënt uit de verse transformant koloniën. Als alternatief kan de culturen worden geënt vanaf een bevroren permanent.
Deze kleine culturen worden gekweekt op een rol bij 37 ° C gedurende de nacht.
3. Dag 3: Growing 6 Liter Cultures:
- In de ochtend, 's nachts gebruik maken van de culturen tot 150 ml LB met 30 ug / ml kanamycine inoculeren. Groeien de cultuur bij 37 ° C op een schudder.
- In de namiddag, gebruik maken van de kleine cultuur tot 6 x 1L 2XYT media die 30 ug / ml kanamycine in Fernbach kolven inoculeren. (Gebruik 25 ml per cultuur voor een 1:40 verdunning). Groeien de culturen bij 37 ° C tot ze bij een OD 600 van 0.4-0.6, ongeveer 1,5 uur
- Wanneer de culturen van de juiste dichtheid te bereiken, te induceren eiwitexpressie door het toevoegen van 0,5 ml 1M IPTG. Leg alle kolven in de shaker en blijven ze groeien bij 30 ° C gedurende de nacht.
4. Dag 4: Oogsten van cellen en zuiveren van het eiwit:
- Voeg proteaseremmers, DNAse, en lysozym de bufferoplossingen als volgt: tot 50 ml van de cel resuspensie buffer, voeg 10 mg DNaseI (0,1 mg / ml eindconcentratie), een compleet EDTA-free protease remmer tablet, en een snufje van lysozym . Tot 60 ml van membraan resuspensie buffer, voeg een proteaseremmer tablet. Om een andere 50 ml van membraan resuspensie buffer, voeg een proteaseremmer tablet. Houd alle drie oplossingen op ijs.
- Centrifugeer de culturen 30 min 5000 rpm in de grootschalige centrifuge om de cellen te oogsten.
- Resuspendeer de cellen in 100 ml cel resuspensie buffer (50 mM NAP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, een compleet EDTA-free protease-remmer tablet, 0,1 mg / ml DNAse I, snufje van lysozym)
- Twee keer voorbij de cel oplossing door een Franse druk cel op 12.000 psi (762 overdruk). Verzamel de cellysaat in een fles bleef koud op het ijs.
- Breng de cellysaat om SS34 centrifuge en centrifugeer naar cel vuil te verwijderen gedurende 30 minuten bij 10.000 rpm bij 4 ° C in een SS-34 rotor.
- Verwijder voorzichtig het supernatant in Ti647.5 ultracentrifuge buizen. Centrifugeer 50 min bij 40000 rpm bij 4C. Giet het supernatans af.
- Resuspendeer de pellet, die de celmembranen bevat, in ca.. 25 ml membraan resuspensie buffer (50 mM NAP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol, een complete EDTA-free protease remmer tablet).
- Breng de membraan schorsing een schone centrifugebuis en centrifugeer bij 40000 rpm in een Ti647.5 rotor voor 50 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de gewassen membraan pellet in 25 ml membraan resuspensie buffer (50 mM NAP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol, een complete EDTA-free protease remmer tablet).
5. TM Protein Solublization:
- Om de geresuspendeerde membranen (ongeveer 25 ml), voeg 6 mL 10% DDM (laatste detergent concentratie = 2% DDM) Rock het mengsel bij 4 ° C gedurende 2 uur.
- Centrifugeer het mengsel bij 40.000 rpm gedurende 40 min bij 4 ° C in de Ti647.5 rotor om de oplosbare proteïne reinigingsmiddel complexen gescheiden van de onoplosbare eiwitten. Sla de supernatant, die de MexB eiwit detergent complexen bevat.
6. IMAC:
- Meng de supernatant verkregen uit de hoge snelheid draaien met de talon metalen kralen affiniteit geëquilibreerd in resuspensie buffer. Incubeer 1 uur op een rol bij 4 ° C.
- Giet de slurry in een zwaartekracht kolom lichaam en gooi het doorstromen.
- Was de kolom met 20 ml (10 kolomvolumes) van IMAC Binding en Wash Buffer (50 mM NAP, pH 7, 300 mM NaCl, 5% glycerol, 0,2% DDM)
- Elueer het eiwit met IMAC elutiebuffer (50 mM NAP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol, 250 mM imidazool, 0,2% DDM).
- Neem 15 pi monsters van de elutie fracties, meng elk met 15 pl 2X SDS sample buffer voor analyse door middel van polyacrylamidegelelektroforese. Spin 30sec in een microcentrifuge. Analyseer de monsters op een 10% polyacrylamide gel SDS om de hoeveelheid en de zuiverheid van MexB schatten in elke fractie.
- Zwembad de fracties die de MexB eiwit reinigingsmiddel complexen en zich te concentreren ze in een spin concentrator bij 4 ° C. Zorg ervoor dat het eiwit niet neer uit op deze stpe.
7. Gelfiltratie Column:
- Pre-equilibreren een Superose 12 HL 30/10 kolom met 24 ml lopen buffer (50 mM NAP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol, 0,2% beta-octylglucoside), en wacht op een vlakke basislijn.
- Spoel de Akta belasting van het systeem-lus met stromend buffer.
- Filter de eiwit-oplossing met behulp van een injectiespuit filter alvorens het aan de kolom.
- Plaats maximaal 240 pi van het eiwit-oplossing op de kolom, met een eiwit concentratie van maximaal 5 mg / ml.
- Run 1,5 kolomvolumes (36 ml) van de buffer, het verzamelen van 0,25 mL fracties. De MexB eiwit reinigingsmiddel complexen moeten elueren als een piek bij ongeveer 10 - 15 ml van elutie volume.
- Take 5 pi monsters van de piek fracties. Meng elk monster 1:1 met 2X SDS sample buffer. Analyseer de monsters op een 10% polyacrylamide gel om de hoeveelheid en de zuiverheid van MexB schatten in elke fractie
- Zwembad de fracties die pure MexB.
8. Representatieve resultaten:
Figuur 1 bevat een polyacrylamide gel met samengevoegde kolom fracties uit de IMAC kolom en de individuele fracties uit de gel filtratie kolom. Na de gelfiltratie kolom het eiwit lijkt zuiver Coomassie gekleurde polyacrylamide gel. Figuur 2 bevat een spoor uit de gel filtratie kolom waarin de belangrijkste piek van het eiwit reinigingsmiddel complex elueren uit de kolom. De gemiddelde opbrengst van MexB eiwit is ongeveer 2 mg per 6 liter 2XYT cultuur.
Figuur 1. SDS-PAGE gel van zuivering van MexB PDC's. Lane 1, Moleculair gewicht markers. 2, Gepoolde IMAC fracties. 3-7, Gel filtratie kolom fracties.
Figuur 2. Voorbeeld van gelfiltratie Resultaten voor MexB eiwit detergent complexen (PDC).