Wij bieden een gedetailleerd protocol voor het bereiden van primaire cellen los van Drosophil Een embryo's. De mogelijkheid om het uitvoeren van de effectieve RNAi verstoring, samen met andere moleculaire, biochemische en cell imaging methoden zal een aantal vragen die moeten worden aangepakt Drosophila Primaire cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Primaire celculturen van Drosophila Gastrula Embryo's
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hier beschrijven we een methode voor het bereiden en het kweken van primaire cellen los te zien van Drosophila gastrula embryo's. Kortom, een grote hoeveelheid geënsceneerde embryo's van jonge en gezonde vliegen zijn verzameld, gesteriliseerd en vervolgens fysiek gescheiden in een enkele celsuspensie met een glazen homogenisator. Na te zijn uitgeplaat op kweekplaten of kamer dia's op een passende dichtheid in een kweekmedium, kunnen deze cellen verder te differentiëren in verschillende morfologisch-verschillende soorten cellen, die kunnen worden geïdentificeerd door hun specifieke cel-markers. Daarnaast presenteren we de voorwaarden voor de behandeling van deze cellen met dubbelstrengs (ds) RNA's tot gen knockdown te lokken. Efficiënte RNAi in Drosophila primaire cellen wordt bereikt door simpelweg het wassen van de cellen in dsRNA-bevattende kweekmedium. De mogelijkheid om uitvoering van een doeltreffend RNAi verstoringen, samen met andere moleculaire, biochemische, cell imaging analyses, zal een groot aantal vragen worden beantwoord in Drosophila primaire cellen, in het bijzonder die met betrekking tot gedifferentieerde spier-en neuronale cellen.
Protocol
1. Voorbereiding van de fly kooien
- Grow Drosophila (wild-type stammen, zoals Oregon-R of een genotype) in handige verpakkingen zoals een 32-oz insect cups.
- Overdracht nieuw eclosed vliegt naar grote embryo-collectie kooien of vliegen de bevolking kooien.
- Verplaats de kooien in een kamer met een temperatuur van ~ 25 ° C en de luchtvochtigheid ~ 65% in een lichte 12-h en een donkere 12-h-cyclus met het verzamelen van synchrone embryo's te vergemakkelijken.
- Houden de vliegen in de kooien door ze gedood gist plakken strepen op melasse platen. Wijzig de melasse platen (met gist gedood pasta) eenmaal per dag voor 2-3 d.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De ontwikkeling patroon van primaire culturen van Drosophila-cellen kan sterk variëren, mogelijk als gevolg van de verschillende variabelen tijdens de primaire cel voorbereidingsproces. Allereerst vliegen gebruikt voor eieren leggen moet worden jonge (binnen een week oud) en gezond (vrij van virale of bacteriële infectie). Onbevruchte of geïnfecteerde embryo's moet worden vermeden, want ze zijn nutteloos en cellen afkomstig van die embryo's niet kan onderscheiden en zal alleen overleven voor 1-2 dagen. .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
JB werd gesteund door de Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship DRG-1716-1702. JZ werd ondersteund door NIH / NIGMS Fellowship F32 GM082174-02. NP is een onderzoeker van de Howard Hughes Medical Institute.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Shields and Sang M3 medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Fetaal runderserum | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insuline uit runderpancreas | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Grote kooien voor embryoverzameling | Genesee Scientific | 59-101 | |
| #25 US standaard testzeef | VWR international | 57334-454 | |
| #45 US standaard testzeef | VWR international | 57334-462 | |
| #120 US standaard testzeef | VWR international | 57334-474 | |
| Dounce weefselmaler, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Dounce weefselmaler, Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Dounce weefselmaler, Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar, 384-well plaat | VWR international | 29444-078 | |
| Lab-Tek II Chambered dekglas | Fisher Scientific | 171080 |
Referenties
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elong....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
