Methoden voor experimentele manipulaties na Optic Nerve doorsnijding in het zoogdier CZS

Samenvatting

Optic Nerve doorsnijding is een veel gebruikt model van de volwassen CNS verwonding. Dit model is ideaal voor het uitvoeren van een aantal experimentele manipulaties die het netvlies doel wereldwijd of direct de doelstelling van de gewonden neuronale populatie van retinale ganglioncellen.

Samenvatting

Retinale ganglioncellen (RGC) zijn CNS neuronen die uitvoer visuele informatie van het netvlies naar de hersenen, via de oogzenuw. De oogzenuw kan worden benaderd binnen de baan van het oog en volledig doorsneden (axotomized), het snijden van de axonen van de gehele bevolking RGC. Oogzenuw doorsnijding is een reproduceerbaar model van apoptotische neuronale celdood in de volwassen CZS ^1-4. Dit model is vooral aantrekkelijk omdat het glasvocht kamer van het oog werkt als een capsule voor drug delivery aan het netvlies, waardoor experimentele manipulaties via intra-oculaire injectie. De verspreiding van chemische stoffen door het glasvocht vloeistof zorgt ervoor dat ze reageren op de hele RGC bevolking. Virale vectoren, plasmiden of short interfering RNA's (siRNA's) kan ook worden geleverd aan het glasvocht kamer om te infecteren of transfecteren retinale cellen ^5-12. De hoge tropisme van adeno-geassocieerd virus (AAV) vectoren is gunstig te richten RGC, met een infectie van bijna 90% van de cellen in de buurt van de injectieplaats ^{6, 7, 13-15.} Bovendien kan RGC selectief worden getransfecteerd door het toepassen van siRNA's, plasmiden, of virale vectoren om het afgesneden uiteinde van de oogzenuw ^16-19 of injecteren van vectoren in hun doel de superieure colliculus ^10. Dit stelt onderzoekers in staat om apoptotische mechanismen in de benadeelde neuronale populatie bestuderen zonder verstorende effecten op andere omstander neuronen of de omliggende glia. RGC apoptose heeft een karakteristieke tijd-cursus, waarbij celdood wordt vertraagd 3-4 dagen postaxotomy, waarna de cellen snel degenereren. Dit biedt een venster voor experimentele manipulaties gericht tegen routes die betrokken zijn bij apoptose. Manipulaties die direct RGC doel van de doorsneden oogzenuw stomp worden uitgevoerd op het moment van axotomy, onmiddellijk na het snijden van de zenuw. In tegenstelling, wanneer stoffen worden geleverd via een intra-oculaire route, kunnen ze voorafgaand aan de operatie of binnen de eerste 3 dagen na de operatie worden toegediend, voorafgaand aan de initiatie van apoptose in axotomized RGC. In dit artikel tonen we verschillende methoden voor experimentele manipulaties na de oogzenuw doorsnijding.

Protocol

1. Chirurgische techniek

1. Experimenten moeten worden uitgevoerd met aseptische techniek en na het gebruik van dieren protocollen van uw specifieke instelling. Instrumenten en materialen (oplossingen te testen stoffen, tracers, naalden, etc.) in contact komen met levend weefsel moet steriel zijn voor infecties en negatieve effecten te voorkomen dat op het dierenwelzijn en de mogelijke negatieve effecten op de studie.

2. Anesthesie

1. Ratten zullen worden verdoofd met behulp van een veterinair isofluraan vaporizer systeem. Gebruik maken van medische kwaliteit zuurstof met een snelheid van 0,8 L / min aan de isofluraan gas verdampen. Plaats het dier in de bijgevoegde anesthesie box en kies in een isofluraan concentratie van 4% tot de ademhaling is vertraagd en het dier is rustig.
2. Vervolgens schakelt de gastoevoer naar de gasmasker bevestiging voor de stereotaxische frame en plaats het dier in de stereotaxische apparaat. Draai de isofluraan concentratie tot 2% en monitoren anesthesie. Grotere dieren (> 300 g) kunnen een hogere concentratie van isofluraan. Anesthesie moet gevolgd worden tijdens operatie en isofluraan de dosering aangepast. Diepte en de snelheid van de ademhaling moet voortdurend worden geëvalueerd, en teen knijpen evaluatie (om de 5 min) voor de afwezigheid van diepe pijn te worden uitgevoerd.
3. Zodra de operatie is voltooid, schakelt u de isofluraan en laat het dier om te ademen zuurstof gedurende enkele minuten voor verwijdering uit de stereotaxische apparaat. De lichaamstemperatuur moet worden gehandhaafd door het bedekken van het dier met een chirurgische deken en / of met behulp van een regelbare verwarming deken tijdens de operatie.

3. Spuit Voorbereiding voor intra-oculaire injectie

1. De eerste, monteren de spuit systeem voor het uitvoeren van de intra-oculaire injectie. Een 10 pi RN Gasdichte 1701 Hamilton spuit wordt gebruikt voor de injectie. Verwijder eventuele naald of RN moer aanwezig is op het einde van de spuit.
2. Plaats de PFA beentje in de PEEK kopje beentje van de compressie fitting. Plaats vervolgens de complete montage in het uiteinde van de spuit en losjes de RN moer schroef over de bovenkant.
3. Steek een uiteinde van de 1 / 16 inch PEEK slangen in de compressie-fitting, door de opening in de RN moer. Zorg ervoor dat de PEEK slang op zijn plaats zit. Draai de RN moer om het beentje te comprimeren, het afdichten van de PEEK slangen.
4. Voer Stap 3.2 aan beide uiteinden van de Dual RN glas koppeling. Bevestig het vrije uiteinde van de PEEK slangen aan het ene uiteinde van de Dual RN glas koppeling door het aandraaien van de RN moer.
5. Een getrokken glas micropipet vormen de naald en vat voor de injectie-systeem. Gebruik 1,5 mm OD dikwandige glazen capillaire slang aan op de glazen pipetten fabriceren, en steek de glazen pipet in het vrije uiteinde van de Dual RN glas koppeling. Draai de RN moer om de pipet vast op zijn plaats.
6. De fijne punt van getrokken glas micropipetten is meestal te klein voor het uitvoeren van intra-oculaire injectie. Om een ​​tip van de juiste diameter te maken, breken de uiteinde van de glazen pipet onder visuele begeleiding, met behulp van een chirurgische microscoop. De matte einde van een glazen exemplaar glijbaan is zeer geschikt voor de pipet te breken. Houd de tube in een hoek en wrijf het uiteinde langs het glas glazuur om een ​​pauze te maken. Idealiter zou de laatste tip enigszins afgeschuind. Het kan een paar pogingen om een ​​goede tip te produceren duren, dus voorafgaand trek meerdere pipetten te gebruiken.
7. De injectie systeem is hydraulisch. Daarom moet de spuit, PEEK slangen linker, Dual RN glas koppeling en het glas micropipet worden gevuld met minerale olie voor gebruik. Met behulp van de Priming kit van Hamilton spuit Co (PRMKIT), vul de priming spuit met minerale olie. Gebruik een grote diameter naald gemakkelijke doorgang van de viskeuze olie mogelijk te maken. Vervang de naald met de Hamilton 90030 naald die past in de loop van de 10 pi Hamilton spuit. Plaats vervolgens een rubber septum op de Hamilton 90030 naald, om een ​​afdichting te bieden, terwijl het injecteren van de minerale olie.
8. Steek de Hamilton 90030 naald van de priming spuit in de achterkant van de loop van de 10 pi Hamilton spuit van het injectiesysteem. Stevig druk op de septum tegen het einde van de spuit om een ​​afdichting te creëren.
9. Langzaam op de zuiger. U ziet de minerale olie door het glas elementen van de injectie-systeem, en ten slotte het vullen van de glazen pipet. Duw alle olie door de injectie systeem om eventuele luchtbellen te verwijderen langs de luchtwegen. Als de vulling spuit bijna leeg is van minerale olie, langzaam terug te trekken van de naald, terwijl voortdurend doseren olie om luchtbellen te voorkomen. Vul de priming spuit en injecteer het opnieuw.
10. Wanneer het hele systeem is gevuld met minerale olie en luchtbel vrij, plaatst u de originele zuiger van de 10 pi Hamilton spuit. Druk de zuiger op tot het einde van de reis om bijkomende minerale olie te verwijderen uit het systeem. Veeg het glas schoon micropipet en het einde van de spuit schoon met 70% ethanol.
11. Withdraw de zuiger van de spuit om de 2 pl markering op het vat. Het einde van het glas micropipet zal vullen met lucht die een bufferzone tussen de minerale olie en de gewenste vloeistof worden geïnjecteerd. De pipet vat kan nu worden opgevuld door het plaatsen van het einde van de micropipet in de gewenste oplossing en intrekking van de zuiger van de spuit Hamilton. Injecteer niet meer dan 4-5 pi van de oplossing tot een volwassen rat oog.

4. Intra-oculaire injectie Procedure: Gericht op de Retina Wereldwijd

1. Met het dier verdoofd en vastgezet in de stereotaxisch frame (zoals beschreven in paragraaf 2), gebruik Alcaine oogdruppels om plaatselijk verdoven het hoornvlies. Open de oogleden met je vingers en leg een druppel van de anesthesie-oplossing op het oppervlak van het hoornvlies.
2. Injectie vereist twee personen: een om de glazen pipet in te voegen in het glasvocht kamer en onderhouden pipet positie, en een andere om druk dan de zuiger op de spuit die de gewenste oplossing biedt.
3. Onder een chirurgische microscoop, greep het glas micropipet en dual RN glas koppeling met uw vingers. Spreid de oogleden met de vingers van uw vrije hand, de vorming van een "V"-vorm tegenover de plaats van injectie. Door het toepassen van tractie aan de oogleden, de ogen worden verheven uit de baan, waardoor de achterste oppervlak achter de limbus. Door het creëren van een "V"-vorm met de vingers tegenover de plaats van injectie, is een bakermat vormde voor het oog het verstrekken van de stabiliteit bij het injecteren.
4. Steek het uiteinde van de glazen micropipet via de conjunctiva, in een gebied zonder bloedvaten, en door de sclera, onder een neerwaartse hoek. Je moet het gevoel een kleine "pop" wanneer de pipet doordringt de sclera. Het inbrengen van de pipet in een iets neerwaartse hoek verkleint de kans op het raken van de lens als het inbrengen van de naald.
5. De persoon die de spuit moet de 4 pi van de oplossing nu injecteren door het indrukken van de zuiger om de 2 pl markering op de spuit. De injectie duurt ongeveer een tot twee seconden in totaal. Injecteren tegen een zeer lage snelheid> 3 seconden vermindert de eerste verspreiding van de oplossing door het glasvocht kamer. Je zult in staat zijn om de geïnjecteerde oplossing spoelen door het glasvocht kamer onder de microscoop te zien, waardoor de verificatie van de succes van de procedure.
6. Houd de micropipet gestage ongeveer 5 seconden en dan terug te trekken, in dezelfde richting als de naald werd ingebracht. Het bindvlies zal achterflap over de kleine opening, waardoor de sclerale punctie afdichting.
7. Bedek het oppervlak van het hoornvlies met oogheelkundige oogzalf (Tears Naturale PM) om het hoornvlies uitdrogen te voorkomen tijdens het herstel, en het dier naar een herstel kooi terug te keren.
8. Postoperatieve analgetica moet toegediend worden volgens de richtlijnen van uw dier zorg autoriteiten, en de dieren moeten zorgvuldig gecontroleerd te worden na de operatie.

5. Selectief Targeting retinale ganglioncellen van de Optic Nerve Stump

1. Het toepassen van tracers, drugs, plasmiden, siRNA's of virale vectoren om oogzenuw stomp, na axotomy, rechtstreeks gericht is retinale ganglioncellen via retrograde transport. Dit wordt bereikt door eerst het uitvoeren van een oogzenuw doorsnijding volgens de 'Optic Nerve doorsnijding Protocol ^"22.
2. Er zijn twee manieren om deze procedure te bereiken: met behulp van gelfoam, of directe injectie in de oogzenuw.
3. De gelfoam methode is vergelijkbaar met retrograde tracing, maar bij het afleveren van experimentele behandelingen in de oogzenuw is het wenselijk om pre-label van de retinale ganglioncellen door het injecteren van retrograde tracers in de superieure colliculus 1 week voorafgaand aan de axotomy. Dit is belangrijk voor de cel tracing, want in sommige gevallen neuronale tracers kunnen interfereren met de retrograde transport van experimentele stoffen of vice versa.
4. Onmiddellijk nadat de oogzenuw wordt gesneden, is een klein stukje van gelfoam gedrenkt in de experimentele oplossing geplaatst over de doorsneden oogzenuw stomp. De orbitale inhoud wordt dan terug naar hun vorige locatie. Wanneer het oog wordt teruggestuurd naar een neutrale positie is het noodzakelijk om een ​​tang te gebruiken om het stuk van gelfoam duw naar beneden in de baan, zodat het blijft over het uiteinde van de oogzenuw.
5. De injectie-techniek is meer effectief voor de levering van stoffen die de toegang tot het cytoplasma van de axon moet krijgen om retrogradely worden vervoerd door de axonale flow. Dit geldt ook voor siRNA's en plasmiden, en in sommige gevallen virale vectoren. 5-10 pi Hamilton spuit wordt gebruikt om de gewenste oplossing te injecteren in de doorsneden oogzenuw.
6. Greep de rand van de oogzenuw met fijne tip Dumont tang. Steek het uiteinde van de naald in de oogzenuw, parallel met de zenuw, tot de schuine kant is niet meer zichtbaar. De ingevoegde naald wordt aan alle kanten omsloten door de zenuw. Een naald met een korte haakse is wenselijk.
7. Zodra de needle wordt ingevoegd in de zenuw, zachtjes knijp de zijkanten van de zenuw met de fijne tip pincet en injecteer een kwart van de oplossing, terwijl het draaien van de spuit een kwart draai met de klok mee of tegen de klok.
8. Blijven herhalen Stap 5.7 tot je een volledige rotatie van de naald en geïnjecteerd de gehele inhoud van de spuit. Voor het beste resultaat te injecteren een totaal van 10 pi van de oplossing met behulp van een gasdichte 10 pi Hamilton spuit.
9. Verwijder het uiteinde van de spuit uit de zenuw. Laat de overtollige vloeistof ingespoten die gerefluxed van de zenuw in de baan, omdat dit zal een bijkomende pool voor opname door de uiteinden van de axonen te vormen.
10. Zet de orbitale inhoud van hun oorspronkelijke positie, sluit de wond, en laat het dier te herstellen.
11. Postoperatieve analgetica moet toegediend worden volgens de richtlijnen van uw dier zorg autoriteiten, en de dieren moeten zorgvuldig gecontroleerd te worden na de operatie.

6. Representatieve resultaten:

Intra-oculaire injectie richten op alle cellen in het netvlies wereldwijd, en het werk goed voor de levering stoffen gewond RGC, omdat ganglioncellen bevinden zich in de binnenste neuronale laag van het netvlies, grenzend aan het glasvocht kamer. RGC kunnen ook direct worden gericht op het leveren van stoffen aan de doorsneden oogzenuw stomp. Fluorogold retrogradely gelabeld RGC kan worden gericht met behulp van peptiden, drugs, vectoren, plasmiden, of siRNA's van de zenuw stomp zoals geïllustreerd in figuur 1. Figuur 1A-C toont de lokalisatie van een Cy3 gelabeld peptide in de somata van RGC die pre-gelabeld door het injecteren van Fluorogold in de superieure colliculus. Cy3 gelabelde peptiden werden geïnjecteerd in de oogzenuw onmiddellijk na axotomy, en het netvlies werd in beeld gebracht in leven om de peptiden te voorkomen dat uitloging van het weefsel tijdens de fixatie. Figuur 1D-F toont de lokalisatie van Cy3 gelabeld siRNA's en de retrograde tracer Fluorogold in axotomized RGC. Cy3 gemerkt siRNA's werden geïnjecteerd in de oogzenuw stomp onmiddellijk na axotomy, en het netvlies werd in beeld gebracht in leven.

Figuur 1. Epifluorescentie microfoto van het RGC in flatmounted netvlies op 1 dag na axotomy en de injectie van een van beide gelabelde peptiden of siRNA's in de oogzenuw stomp. (A) Fluorogold retrograde etikettering in axotomized RGC op een dag postaxotomy (B) Cy3 fluorescentie in RGC volgende retrograde transport van gelabelde peptiden, 1 dag na axotomy en peptide injectie in de oogzenuw. (C) Overlay van (A) en (B) het aantonen van de selectieve lokalisatie van Cy3 gelabelde peptiden in Fluorogold label RGC. (DF) De cellichamen van Fluorogold gelabeld RGC (D) zijn ook gevuld met Cy3 gemerkt siRNA's (E) geïnjecteerd in de oogzenuw stomp 24 uur eerder, zoals getoond in de overlay (F). Schaal bar in AC is 50 micrometer. Schaal bar in DF is 20 micrometer.

Discussie

Oogzenuw doorsnijding is een zeer reproduceerbare model van de volwassen CZS neuron apoptose. De experimentele manipulaties gedemonstreerd in dit handschrift staan ​​de studie van de mechanismen van RGC apoptose na letsel.

Intra-oculaire injectie zijn nuttig voor de wereldwijde targeting van het netvlies. Deze procedure vergt enige oefening, want het is van levensbelang, niet voor de lens verwonden met de punt van de glazen pipet. Lens schade is aangetoond dat de afgifte van groeifactoren ve...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.
Rat Gas Mask	Stoelting Co.
Anesthesia System	VetEquip	901806
Isoflurane (PrAErrane)	Baxter Internationl Inc.	DIN 02225875
Surgical Microscope	WPI, Zeiss, Leica
Alcaine Eye Drops	Alcon
Tears Naturale P.M.	Alcon
Fine tip Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-00
10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2)	Hamilton Co	80030
1/16 inch Compression Fittings	Hamilton Co	55751-01
1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing	Supelco, Sigma-Aldrich	Z226661
Dual RN Glass Coupler	Hamilton Co	55752-01
Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa	Hamilton Co	PRMKIT