Methodenartikel

Monitoring immuuncellen Trafficking TL-Prion Rods uur na intraperitoneale infectie

11.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/2349

⸱

19 november 2010

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een nieuwe test voor het toezicht op prion opname en-handel door immuuncellen onmiddellijk na intraperitoneale inoculatie door het zuiveren en fluorescent etikettering geaggregeerde prion staven van geïnfecteerde hersenen materiaal dan het toezicht op hun opname en beweging van de injectieplaats en het karakteriseren van de cellen te bemiddelen deze gebeurtenissen.

Samenvatting

Aanwezigheid van een abnormale vorm een ​​host-gecodeerde prioneiwit (PrPC wordt vergeleken) die protease-resistente, pathologische en besmettelijke kenmerkt prionziekten zoals Chronic Wasting Disease (CWD) van hertachtigen en scrapie bij schapen. De Prion hypothese stelt dat deze abnormale conformeer de meeste of alle van de besmettelijke prion vormt. De rol van het immuunsysteem in het begin van de gebeurtenissen in perifere prion pathogenese is overtuigend aangetoond voor CWD en scrapie 1-3. Transgene en farmacologische studies bij muizen bleek een belangrijke rol van het complementsysteem in het behoud en het kopiëren van prionen vroeg na de infectie 4-6. In vitro en in vivo studies hebben ook prion retentie waargenomen door dendritische cellen 7-10, hoewel hun rol in de handel blijft onduidelijk 11-16. Macrofagen zijn soortgelijke wijze zijn betrokken in het begin van prion pathogenese, maar deze studies hebben zich gericht op gebeurtenissen die zich week na infectie 3,11,17. Deze eerdere studies ook last van het probleem van het onderscheid tussen endogene PrP C en besmettelijke prionen. Hier beschrijven we een semi-kwantitatieve, onpartijdige aanpak voor de beoordeling van prion opname van en de handel van de inenting site door immuuncellen er aangeworven. Geaggregeerde prion staven werden gezuiverd van geïnfecteerde hersenhomogenaat door detergent solubilisatie van niet-geaggregeerde eiwitten en ultracentrifugatie door middel van een sucrose kussen. Polyacrylamidegelelektroforese, Coomassie blauwe vlekken en Western blotting bevestigd herstel van sterk verrijkt prion staven in het ingehulde fractie. Prion staven waren fluorochroom-gelabeld dan intraperitoneaal geïnjecteerd in muizen. Twee uur later immuuncellen van peritoneale lavage vloeistof, milt en mediastinale en mesenteriale lymfeklieren werden getest op prion staaf vasthouden en cel subsets geïdentificeerd door multicolor flowcytometrie met behulp van markers voor de monocyten, neutrofielen, dendritische cellen, macrofagen en B-en T-cellen. Deze test kan voor het eerst directe controle van de immuuncellen het verwerven van en handel prionen in vivo binnen enkele uren na de besmetting. Deze test ook duidelijk onderscheidt besmettelijke, geaggregeerde prionen uit PrPC wordt vergeleken normaal tot expressie gebracht op gastheercellen, die kan moeilijk zijn en leiden tot interpretatie van gegevens problemen in andere testsystemen. Dit protocol kan worden aangepast aan andere inoculatie routes (orale, intraveneuze, subcutane en intranervous, bijvoorbeeld) en antigenen (geconjugeerd kralen, bacteriële, virale en parasitaire ziekteverwekkers en eiwitten, ei) ook.

Protocol

1. Zuiveren en Labeling Prion Rods

Dit protocol is een bewerking van een eerder gepubliceerde 18

  1. Homogeniseren 100 gram prion-geïnfecteerd hersenweefsel in 900 ml ijskoud homogeniseren buffer (HB, 1X PBS met 320 mM sucrose, 150 mM NaCl en 4 mm EDTA) 1 min op maximale snelheid in een commerciële blender, daarna 2 min op ijs. Herhaal dit drie keer.
  2. Centrifuge homogenaat gedurende 10 min bij 3000 xg en 4 ° C. Verwijderen en opslaan supernatant op ijs. Re-schorten pellet in 1L HB en herhaal de stappen 1.1 en 1.2.
  3. Pool supernatants en centrifugeer gedurende 60 minuten bij 100.000 xg, 0 ° C. Gooi supernatant.
  4. Re-schorten pellet in 100 ml 1X Tris gebufferde zoutoplossing (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM NaCl en 1 mM EDTA) met 2% Triton X-100 (TBST). Schatting eiwit concentratie door de Bradford of een soortgelijke test en aan te passen aan 5 mg / ml in TBST. Chill op ijs gedurende 30 minuten.
  5. Centrifugeer gedurende 30 min bij 100.000 xg, 0 ° C. Gooi supernatans en was pellet met 50 ml TBST dan 100 mL TBS. Pellet opnieuw te schorten in 100 ml 1X PBS dat 1% sarcosyl en protease-remmer cocktail en gedurende 120 minuten bij 37 ° C. Roer
  6. Laag monster op 900 ml 320 mM sucrose en centrifugeer gedurende 60 minuten bij 100.000 xg, 10 ° C. Gooi supernatant en resuspendeer pellet in 10 ml 2,3 M NaCl, 5% sarcosyl.
  7. Ultrasone trillingen monster 5 x 40 seconden op 70% maximaal vermogen op 1 min. intervallen op ijs.
  8. Aliquot 1 ml monster in Eppendorf buisjes en centrifugeer gedurende vijftien minuten bij 13.000 xg, 4 oC. Twee keer wassen pellets met TBS en bewaar @ -70 ° C of conjugaat aan fluorochroom in stap 1.9.
  9. Conjugaat een tube van gezuiverd prion staven met behulp van een flacon van 649 DyLight fluorochroom volgens de fabrikant protocol.
  10. Exchange DyLight etikettering buffer voor PBS door middel van dialyse of centrifugeren door het filter kolommen. Op te slaan in 20 pi aliquots bij -70 ° C verwijderd van licht tot klaar voor gebruik.

2. Prion Inenting en Cell Recovery

Deze sectie omvat intraperitoneale prion inoculatie en het herstel van cellen van het buikvlies, mediastinale en mesenteriale lymfeklieren en milt.

  1. Verdunnen fluorescerende prion staven 01:50 in PBS onmiddellijk voorafgaand aan gebruik. Nekvel muis door het dorsale nek vacht met duim en wijsvinger, voorzichtig draaien muis om je gezicht en staart met pink te beperken. Supinate muis, verheffen achterpoten romp boven het hoofd houden en hem een ​​beetje op zijn kop.
  2. Met behulp van een 30G insuline spuit, injecteer 100 ul van TL-prionen staven 1 cm lateraal van de middellijn en 1-2 cm juist voor de sacro-iliacale gewricht. Steek de naald 1 cm door de huid gericht 45 ° mediaal. Gebruik 1:50 verdunning van fluorescerende kralen of PBS alleen als controlegroep. Incubeer muizen voor toegewezen tijd voor de analyse.
  3. Euthanaseren muizen volgens goedgekeurde dieren verzorgen en te gebruiken commissie protocollen. Injecteer 10 ml van PBS in de buikholte met behulp van een 12 ml spuit en 25G naald. Voorzichtig lengterichting rots karkas gedurende een minuut. Recover celsuspensie van het buikvlies met dezelfde spuit en een 16G naald in een 15 ml conische buis en reserveer op het ijs, terwijl karkas dissectie doorgaat.
  4. Grondig nat de ventrale zijde van het karkas met 70% ethanol. Til de huid op de middenlijn net onder de ribbenkast met een tang en snijd een kleine incisie door de huid met een schaar. Vanaf daar, maak een 3-5 cm lange incisie door de huid van de in beide richtingen aan het hoofd en staart, vervolgens twee 2-cm incisies van de middellijn zijwaarts van elk eind. Trek en speld de huid om de peritoneale en thoracale holtes te onthullen. Knip voorzichtig door de dunne doorschijnende vliezen rondom het buikvlies en weerspiegelen de thorax naar het mediastinum te onthullen.
  5. Zoek en verwijder 2-4 mediastinale lymfklieren, iets dorsaal en lateraal naast de thymus, mediaal grenzend aan de brachiocephalicus slagader, in de buurt van de ventrale zijde van de luchtpijp. Zoek en verwijder tot zes mesenteriale lymfeklieren, ingebed in het zachte witte mesenteriale weefsel dat verankert de darmen aan de achterste buikwand. Zoek en verwijder de milt, een lange, donkerrode orgel ligt net lateraal van de mediaanlijn en dorsaal van de darmen aan de linker zijkant van de buik. Reserve lymfeklieren in 1 ml RPMI 1640 medium op ijs totdat dissectie is voltooid.
  6. Maceraat en druk op de lymfeklieren door een 40 um mesh zeef in 3 ml RPMI in een plastic petrischaal met behulp van de zuiger van een 1 ml spuit. Spoel zeef met een extra 2 ml RPMI en de overdracht van de 5 ml celsuspensie aan een 15 ml conische buis. Spoel de petrischaal met een extra 5 ml RPMI en transfer naar dezelfde buis. Centrifugeer 5 minuten bij 250 xg, verwijder supernatant, resuspendeer de cel pellet in 1 ml FACS buffer (1X PBS, 1% bovine serum albumine en 10 mM EDTA) en overbrengen in een 1,5 ml Eppendorf buis.
ove_title "> 3. Cel Kleuring en Flow cytometrie

Het volgende is een typisch kleuringsprotocol voor het identificeren van immuun cel subsets met behulp van fluorescerende antilichamen tegen goed gekarakteriseerde immuun celoppervlaktemerkers. Alle antilichamen werden verdund in FACS-buffer onmiddellijk voor gebruik.

  1. Tellen cellen en aliquot 10 6 cellen in Eppendorf buizen. Centrifuge cellen (zie 2.7) en was pellet 2x met 1 ml FACS buffer.
  2. Incubeer cellen 20 min op ijs in 100 ul van 2 ng / mL rat anti-muis CD16/32 de endogene Fc-receptoren te blokkeren. Pellet en wassen cellen met FACS buffer.
  3. Voeg 100 ul van 1ng / mL geschikte fluorescerende antibod (y) s aan elk monster en incubeer op ijs gedurende een uur. Voeg 100 ul van FACS buffer alleen om controle cellen. Pellet en wassen cellen twee keer met een FACS buffer.
  4. Re-schorten cellen in 1 ml ACK-buffer (150 mM NH 4 Cl, 1 mM KHCO 3 en 0,1 mM EDTA) Incubeer op ijs gedurende 1 minuut aan de rode bloedcellen lyseren. Pellet en wassen cellen met FACS buffer. Re-schorten cellen in 1 ml FACS buffer.
  5. Gegevens te verzamelen van cellen met behulp van een flowcytometer staat multicolor detectie en analyse, meestal met 405, 488 en 633 nm excitatie lasers en vijf tot tien fluorescentie-emissie detectoren.

4. Representatieve resultaten:

We gezuiverd prion staven van ruwe, prion-geïnfecteerde hersenhomogenaat (figuur 1) Wasmiddel oplosbaar en ultracentrifugatie van de E2 eland hersenhomogenaat (lanen 1 en 2) enorm verrijkt voor prion hengels (vergelijk de lanen 1 en 3), die ook protease K bestendig (laan 4). Interessant is dat onverteerd gezuiverd prion staven weergegeven een glycoform profiel opvallend veel op verteerd E2 hersenhomogenaat, wat aangeeft dramatische verrijking voor prionen. Identiek behandeld normale hersenhomogenaat leverde geen PK-resistente PrP-C (lanen 5 en 6).

Flowcytometrische analyse van de specifieke celpopulaties aan te tonen dat antigeen presenterende cellen de thuisbasis van het buikvlies door de twee uur en behouden van fluorescerende kralen en prion staven, zoals blijkt uit de enorm toegenomen fluorescentie meer dan PBS geïnjecteerd controles (figuur 2). Geen cellen geoogst uit het buikvlies van de PBS-behandelde controles weergegeven fluorescentie boven de achtergrond (afb. 2A-G), terwijl de cellen van hiel (figuur 2H-N) en prion (afb. 2O-U)-geïnoculeerde muizen weergegeven significant fluorescentie, vooral op monocyten (fig. 2I en P), dendritische cellen (fig. 2K en R) en macrofagen (afb. 2L en S), en een aantal neutrofielen (figuur 2J en Q) en minder B-cellen (Figuur 2T). Kraal en Prion-dragende monocyten, dendritische cellen en macrofagen werden ook gevonden in de mediastinale lymfeklieren twee uur na inoculatie (figuren 2AD en AK, AF en AM en AG en AN, respectievelijk), terwijl weinig of geen PrP CWD-dragende Neutrofielen , waren B-of T-cellen er gevonden (afb. 2AE en AL, AH en AG en AI en AP, respectievelijk). We hebben gedetecteerd geen kralen of prion staven in de milt of mesenterische lymfeklieren (gegevens niet getoond). In zijn geheel, deze gegevens tonen aan dat immuuncellen verkeer prionen zeer vergelijkbaar met andere deeltjes antigenen.

REAGENS Fluorchroom Excitatie LASER (nm) PEAK Emissie (nm)
Prion staven DyLight 649 633 674
1 micrometer kralen AlexaFluor 660 633 685
Antilichamen
CD11b eFluor 450 405 450
Phycoerythrin-Cy7 488 760
CD11c R-phycoerythrin 488 575
Phycoerythrin-Cy7 488 760
Ly6C Fluoroisothiocyante 488 518
Ly6G R-phycoerythrin 488 575
CD21 DyLight 488 488 518
B220 Allophycocyanin-Cy7 633 785
CD3 R-phycoerythrin 488 575
"> Tabel 1. Spectrale eigenschappen van fluorescerende reagentia

Figuur 1
Figuur 1. Zuivering van prionen staven van geïnfecteerde hersenhomogenaat. We gebruikten een 10% ruwe hersenhomogenaat van een CVO-geïnfecteerde herten (E2, lanen 1 en 2) als grondstof waaruit wij gezuiverd geaggregeerde prion staven (lanen 3 en 4). Zowel de ruwe materialen en gezuiverd toonde karakteristieke weerstand tegen protease K behandeling (lanen 1 - 4), terwijl de normale hersenhomogenaat niet (lanen 5 en 6). Moleculair gewicht markers worden weergegeven in Kd aan de linkerkant van de blot. BH, hersenhomogenaat.

Figuur 2
Figuur 2. Flowcytometrische analyse van de immuuncellen mensenhandel prionen van het buikvlies om mediastinale lymfeklieren twee uur na de inoculatie. PBS (panelen AG en V-AB), TL-kralen (HN-en AC-AI) of Prion staven (OU en AJ-AP) werden geïnjecteerd in het buikvlies van muizen en cellen geoogst uit peritoneale lavage vloeistof (AU) of de mediastinale lymfklieren (V-AP) twee uur later. Grafieken in de eerste kolom tonen cellen van muizen die werden behandeld met PBS (panelen A en V), TL-kralen (panel H en AC) en prion staven (panelen O en AJ). Fluorescerende cellen (rode of groene stippen) en de totale cellen (grijze stippen) wordt uitgezet om de relatieve grootte (voorwaartse verstrooiing), granulariteit (zijwaartse verstrooiing) en percentage van de totale levende cellen die fluoresceren te tonen. Grote aantallen cellen kenmerk van granulocyten behouden fluorescerende kralen en staven. Cellen werden ook gekleurd met antilichamen tegen het immuunsysteem celoppervlaktemerkers en gated voor LYG-Ly6C + monocyten (panelen B, I, P, W, AD en AK), Ly6c-CD11c-CD11b + Ly6G + neutrofielen (C, J, Q, X, AE en AL), Ly6G-Ly6C-CD11b + CD11c + dendritische cellen (D, K, R, Y, AF en AM), Ly6G-Ly6C-CD11c-CD11b + macrofagen, (E, L, S, Z, AG en AN), CD3 -B220 + CD21 + B-cellen (F, M, T, AA, AH en AO) en de CD21-B220-CD3 + T-cellen (G, N, U, AB, AI en AP). Monocyten, dendritische cellen en macrofagen fluorescerende kralen en prionen staven vastgehouden in de buikholte (panelen I en P, K en R en L en S, respectievelijk) en vervoerd ze mediastinale lymfklieren (panelen AD en AK, AF en AM en AG en AN, respectievelijk), waaruit soortgelijke opname van en handel van deze twee deeltjes. Neutrofielen behield een aanzienlijke hoeveelheid kralen (J) en minder staafjes (Q), maar slaagde er niet om hen te bevrijden naar de lymfeklieren (AE en AL). B-cellen behouden en vervoerd aantal staafjes (T en AO), maar vrijwel geen kralen (M en AH). T-cellen verhandeld noch kralen, noch staven (N, U, AI en AP).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier laten we zien een protocol voor tagging en het bijhouden van prionen in vivo dat sterk vergemakkelijkt de controle vroege gebeurtenissen in de perifere prion infectie. Dit protocol zorgt voor een aan het verleden pogingen om de controle prion opname in vitro en in vivo 9 3,12 door pre-etikettering van hoog verrijkt prion inoculum op ondubbelzinnige wijze te onderscheiden van endogene PrP C. Omdat de besmettelijke prionen en PrP C delen dezelfde primaire am...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Wij danken Steve McBryant en Jeff Hansen voor hulp bij ultracentrifugeren en Patti Kiser voor hulp met de muis hanteren. Het Nationaal Instituut voor Neurologische Ziekten en Stroke bij de National Institutes of Health, subsidie ​​5R01NS056379-02 gefinancierde dit werk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CWD-geïnfecteerde hersenen van een wapitiPrivé wapitifarm in ColoradoGebruik elk door prionen geïnfecteerd brein van een niet-menselijke soort
BlenderOster Professional Products6694-015Gebruik elke commerciële blender
CentrifugeSorvall, Thermo ScientificSS34 rotorGebruik elke centrifuge/rotor die 3000 x g kan bereiken en volumes van ≥ 500 ml kan bevatten
UltracentrifugeBeckman Coulter Inc.50.2 Ti rotorGebruik elke ultracentrifuge/rotor die 100,000 x g kan bereiken en volumes van ≥ 500 ml kan bevatten
Bradford-reagensSigma-AldrichB6916
Complete mini protease-remmer cocktailRoche Group11 836 170 001
SonicatorMisonixMP4000XGebruik elke hoorn- of probesonicator ingesteld op ~70% van het maximale vermogen
DyLight antilichaam-labelsetThermo Fisher Scientific, Inc.53050
microcentrifugeEppendorf55430RGebruik elke gekoelde microcentrifuge die 13,000x g kan bereiken
centrifugaalfilterkolommenEMD MilliporeMicrocon YM-100Gebruik elk filter of dialysemembraan met een molecuulgewicht-cutoff van 100 Kd
8-40 weken oude FVB-muizenCharles River Laboratories207Gebruik elke ingegetelde muizenstam
1 μm rode fluorescente beadsPhosphorex2307Gebruik elke fluorescente bead ≤ 10 μm
RPMI 1640 mediumInvitrogen11875-093
40 μm celzeefFalcon BD352340
fluorescente antilichamenBD BiosciencesDiverseGebruik elk fluorescent antilichaam dat geschikt is voor uw toepassing.
flowcytometerDakoCyanADPGebruik elke flowcytometer die in staat is tot multicolor fluorescentiedetectie

Referenties

  1. Klein, M. A. A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie. Nature. 390, 687-687 (1997).
  2. Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. Involvement of the immune system in TSE pathogenesis. Immunol Today. 19, 201-201 (1998).
  3. Sigurdson, C. J. PrP(CWD) lymphoid cell targets in early and advanced chronic wasting disease of mule deer. J Gen Virol. 83, 2617-2617 (2002).
  4. Klein, M. A. Complement facilitates early prion pathogenesis. Nat Med. 7, 488-488 (2001).
  5. Mabbott, N. A. Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of C1q significantly delays onset of scrapie. Nat Med. 7, 485-485 (2001).
  6. Zabel, M. D. Stromal Complement Receptor CD21/35 Facilitates Lymphoid Prion Colonization and Pathogenesis. J Immunol. 179, 6144-6144 (2007).
  7. Cordier-Dirikoc, S., Chabry, J. Temporary depletion of CD11c+ dendritic cells delays lymphoinvasion after intraperitonal scrapie infection. J Virol. 82, 8933-8933 (2008).
  8. Dorban, G. Oral scrapie infection modifies the homeostasis of Peyer's patches' dendritic cells. Histochem Cell Biol. 128, 243-243 (2007).
  9. Flores-Langarica, A. Scrapie pathogenesis: the role of complement C1q in scrapie agent uptake by conventional dendritic cells. J Immunol. 182, 1305-1305 (2009).
  10. Huang, F. P., MacPherson, G. G. Dendritic cells and oral transmission of prion diseases. Adv Drug Deliv Rev. 56, 901-901 (2004).
  11. Ano, Y., Sakudo, A., Nakayama, H., Onodera, T. Uptake and dynamics of infectious prion protein in the intestine. Protein Pept Lett. 16, 247-247 (2009).
  12. Aucouturier, P. Infected splenic dendritic cells are sufficient for prion transmission to the CNS in mouse scrapie. J Clin Invest. 108, 703-703 (2001).
  13. Huang, F. P. Migrating intestinal dendritic cells transport PrP(Sc) from the gut. J Gen Virol. 83, 267-267 (2002).
  14. Jeffrey, M. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapiesusceptible and scrapie-resistant sheep. J Pathol. 209, 4-4 (2006).
  15. Raymond, C. R., Mabbott, N. A. Assessing the involvement of migratory dendritic cells in the transfer of the scrapie agent from the immune to peripheral nervous systems. J Neuroimmunol. 187, 114-114 (2007).
  16. Mohan, J., Hopkins, J., Mabbott, N. A. Skin-derived dendritic cells acquire and degrade the scrapie agent following in vitro exposure. Immunology. 116, 122-122 (2005).
  17. Gilch, S. CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells. FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).
  18. Safar, J. Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).
  19. Büeler, H. R. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73, 1339-1339 (1993).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Flowcytometrieperitoneale lavagefluorescentielabelingultracentrifugatiesucrosegradi ntdendritische cellenmacrofagenprionopname

Gerelateerde artikelen