Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten

Samenvatting

Genetische kruisen van knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd door het voeren van twee genetisch verschillende parasieten aan muggen. Recombinant nakomelingen zijn gekloond van muizen bloed na waardoor muggen om geïnfecteerde muizen bijten. Deze video laat zien hoe de productie van genetisch kruisen van Plasmodium yoelii En is van toepassing op andere knaagdieren malariaparasieten.

Samenvatting

Variatie in reactie op antimalariamiddelen en pathogeniteit van malariaparasieten is van biologische en medische belang. Koppeling in kaart brengen heeft geleid tot succesvolle identificatie van de genen of loci die ten grondslag liggen verschillende eigenschappen in malariaparasieten van knaagdieren ^1-3 en mensen ^4-6. De malariaparasiet Plasmodium yoelii is een van de vele soorten malaria geïsoleerd van wilde Afrikaanse knaagdieren en is aangepast om te groeien in laboratoria. Deze soort reproduceert veel van de biologische kenmerken van de menselijke malariaparasieten, genetische merkers zoals microsatellieten en versterkt fragment lengte polymorfisme (AFLP) markers zijn ook ontwikkeld voor de parasiet ^7-9. Zo kunnen genetische studies in knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd om het onderzoek naar Plasmodium falciparum te vullen. Hier tonen we de technieken voor het produceren van een genetische kruis in P. yoelii die voor het eerst werden ontwikkeld door Drs. David Walliker, Richard Carter, en collega's aan de universiteit van Edinburgh ^10.

Genetische kruizen in P. yoelii en andere knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd door het infecteren van muizen Mus musculus met een inoculum met gametocyten van twee genetisch verschillende klonen die verschillen in fenotypen van belang en door muggen te voeden op de geïnfecteerde muizen 4 dagen na infectie. De aanwezigheid van mannelijke en vrouwelijke gametocyten in de muis bloed is microscopisch bevestigd voor het voeden. Binnen 48 uur na de voeding, in de middendarm van de mug, de haploïde gametocyten differentiëren in mannelijke en vrouwelijke gameten, bemesten, en vormen een diploïde zygote (afb. 1). Tijdens de ontwikkeling van een zygote in een ookinete, meiose lijkt voor te komen ^11. Als de zygote is afgeleid door middel van kruisbestuiving tussen gameten van de twee genetisch verschillende parasieten, genetische uitwisseling van (chromosomale herschikking en cross-overs tussen de niet-zuster chromatiden van een paar homologe chromosomen;. Fig. 2) kan optreden, wat resulteert in recombinatie van genetisch materiaal op homologe loci. Elke zygote ondergaat twee opeenvolgende nucleaire divisies, wat leidt tot vier haploïde kernen. Een ookinete ontwikkelt zich verder in een oocysten. Zodra de oocysten rijpt, zijn duizenden sporozoieten (de nakomelingen van het kruis) gevormd en komen vrij in de mug hemoceal. Sporozoieten worden geoogst uit de speekselklieren en geïnjecteerd in een nieuwe muis host, waar de pre-erytrocytaire en erytrocytaire fase van ontwikkeling plaatsvindt. Erytrocytaire vormen zijn gekloond en geclassificeerd met betrekking tot de personages onderscheiden van de ouderlijnen voorafgaand aan de genetische linkage in kaart brengen. Controle infecties van de individuele ouders klonen worden uitgevoerd op dezelfde manier als de productie van een genetische kruis.

Protocol

Aseptische technieken moeten worden toegepast op alle materialen die worden toegediend in de dieren om onbedoelde introductie van exogene ziekteverwekkers in muizen die kunnen verwarren experimentele resultaten te vermijden.

1. Infectie van laboratoriummuizen met Blood-traps malariaparasieten

1. Bij kamertemperatuur, dooi twee flacons met daarin de bevroren bloed podium malariaparasieten te worden overschreden. In dit voorbeeld, twee knaagdier malaria parasiet gebruikte stammen zijn Plasmodium yoelii yoelii en Plasmodium yoelii nigeriensis.
2. Past een injectiespuit met een 22 tot 30 gauge (G) naald en het....

Discussie

Tonen we de technieken voor de productie van een genetische kruis in het knaagdier malaria Plasmodium yoelii, die ook van toepassing op de productie van genetisch kruisen in andere knaagdieren malarias. Infecties van muizen met enkele ouders klonen worden doorgaans uitgevoerd om een ​​succesvolle overdracht van het ouderlijk parasieten te bepalen om ervoor te zorgen dat de ouders bevoegd zijn in het produceren van functionele gameten voor het uitvoeren van een kruis.

Succesvolle tra.......

Materialen

Aanvullende materialen:

• Onderhoud van laboratoriummuizen
• Onderhoud van het laboratorium muggen
• Microscopisch onderzoek van dunne bloeduitstrijkjes gekleurd met Giemsa kleuring
• Meting van rode bloedcellen dichtheid

Onderhoud van laboratoriummuizen

Vrouwtjes van inteelt laboratorium muizenstam BALB / c, van 5 tot 8 weken oud, worden gebruikt in de studie. Muizen zijn ondergebracht in een standaard vast-bottom polycarbonaat kooi met wire-bar deksel, uitgerust met feeder en een fles water. Muizen worden gehandhaafd op een constante temperatuur (25 ± 1 ° C) op 12:12 uur licht: donker cyclus. Muizen mogen voeden 2018S Harlan Teklad Global 19% eiwit geëxtrudeerde knaagdierendieet (steriliseerbaar, van Harlan-Teklad) en worden geleverd met aangezuurd drinkwater ad libitum. Experimenten op dieren zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Animal Care en gebruik Comite bij de Nationale Instituut voor Allergie en Infectieziekten onder protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) in te stellen.

Onderhoud van het laboratorium muggen

Muggen zijn afkomstig uit een laboratorium gekweekte kolonie van Anopheles stephensi. De volwassenen worden gehandhaafd in nylon kooien bewaard in een temperatuur-en vochtigheid-gecontroleerde ruimte (23 tot 25 ° C voor Plasmodium yoelii en Plasmodium chabaudi, en 19 tot 21 ° C voor Plasmodium berghei, 80 tot 95% luchtvochtigheid, op 12:12 uur licht: donker cyclus). Volwassen muggen worden gevoed met 10% glucose en 2,00% para-aminobenzoëzuur (PABA), aangevuld water oplossing. Voor het verkrijgen van hoge kwaliteit volwassenen, zijn 500 larven gekweekt in een lage dichtheid voorwaarde in een L gedestilleerd water in een 1000-cm ³ te openen schotel geleverd met ongeveer 1 mg natrium bicarbonaat. Na het uitkomen, worden de larven gegeven TetraMin poeder (PETCO) totdat ze zich ontwikkelen tot de pop podium en worden overgebracht naar de volwassen mug kooien voor opkomende.

Microscopisch onderzoek van dunne bloeduitstrijkjes gekleurd met Giemsa kleuring

Met een schone schaar knip uit de tip (1,0 mm) van de staart van de besmette muis. Plaats een druppel (0,5-1,0 pi) van de staart van het bloed op een schoon exemplaar dia. Muis stopt bloeden in 1-2 minuten. Leg een schone spreader slide op de top van de bloeddruppel, het onderhouden van het op een hoek van 45 ° ten opzichte van het monster glijden, en laat het bloed tot adsorptie aan de gehele breedte van de strooier. Houd het monster glijbaan en duw de strooier schuiven snel en soepel aan een dun uitstrijkje te produceren. Laat het bloed film droog is, en vervolgens onder te dompelen de dia's in absolute methanol. Laat de schuif aan de lucht drogen nog een keer voordat het te bedekken met Giemsa kleuring (10% Giemsa kleurstof in gedestilleerd water). Na het incuberen van de dunne bloed films voor 10-15 minuten op kamertemperatuur, spoel de glaasjes zorgvuldig met leidingwater en laat het drogen aan de lucht. Onderzoek van het aantal geïnfecteerde rode bloedcellen (iRBC, zie figuur 3 voor de morfologie van de geïnfecteerde RBC) onder een lichtmicroscoop met immersie olie bij 1000x vergroting (met 100x objectief) en bereken parasitemie (het aantal iRBC per 100 RBC geteld). Verschillende stammen van malariaparasieten variëren in groei en pathogeniteit. Controle van het bloed stadium parasitaemias kan worden uitgevoerd 24 uur na de injecties, afhankelijk van de dosis van het bloed podium malariaparasieten. Zo zal muizen worden microscopisch positief 24 uur bij geïnjecteerd met 10 ⁷ geïnfecteerde RBC intraperitoneaal of 10 ⁶ geïnfecteerde RBC intraveneus.

Meting van rode bloedcellen dichtheid

Net als de niveaus van parasitaemias, rode bloedcellen (RBC) dichtheid in geïnfecteerde muizen varieert in de loop van de infectie. RBC dichtheid moet worden gemeten binnen 1-2 uur voor het begin van de single-en mixed-kloon infectie en het klonen experimenten. Er zijn twee methoden voor de meting van RBC dichtheid: een handmatige telling met behulp van Neubauer hemocytometer en een automatisch tellen met behulp van een Cellometer (Nexcelom Bioscience). In beide methoden achtereenvolgens hoeveelheden van 1 ul van de muis staart bloed met behulp van een glazen capillaire (VWR) en verdun met 10 ml PBS en meng goed. Voor het gebruik van een Neubauer hemocytometer, belasting 20 pi van de suspensie op de hemacytometer. Plaats de hemacytometer op een licht microscoop met 10x objectief. De hemacytometer bevat een raster verdeeld in 9 grote vierkanten, en vier grote pleinen in de hoek zijn verder verdeeld in 16 kleine vierkantjes. Tel het totaal aantal cellen in elk van de 16 kleine vierkantjes in de vier hoeken pleinen. Om te voorkomen dat het tellen van vertekening of het tellen van cellen die een raster lijn overlappen, telt een cel als "in" als het overlapt de bovenkant of rechts lijnen en "out" als het overlapt de bodem of naar links lijnen. Schatten het aantal cellen per een klein plein en de delen door 0,00625 (het volume van een kleine vierkante is 6,25 nL). Dit levert het aantal cellen per microliter (&mu, L). Uit deze gegevens, het berekenen van de uiteindelijke rode bloedcellen dichtheid te vermenigvuldigen met 10.000 (een verdunningsfactor). Spoel de dekglas en telkamer met gedestilleerd water en 70% ethanol, de lucht drogen. Als alternatief, load 20 pi van de suspensie op een Cellometer telkamer dia. Plaats de dia in een Cellometer slide kamer (de lezer). Start de Cellometer software, kies de "rode bloedcel" optie, en voer een verdunningsfactor van 10.000. Noteer de RBC dichtheid.