Elektrofysiologische opnames van de Giant Fiber Pathway van D. melanogaster</em

Samenvatting

De Giant Fiber System is een eenvoudige neuronale circuit van de volwassen Drosophila melanogaster Met de grootste neuronen in de vlieg. We beschrijven het protocol voor de controle synaptische transmissie via deze route door het opnemen van posten synaptische potentialen in dorsale longitudinaal (DLM) en tergotrochanteral (TTM) spieren na directe stimulatie van de Giant Fiber interneuronen.

Samenvatting

Toen schrok volwassen D. melanogaster reageren door te springen in de lucht en weg te vliegen. In vele ongewervelde diersoorten, waaronder D. melanogaster, de "escape" (of "schrikreactie") respons tijdens het volwassen stadium wordt gemedieerd door de multi-component neuronale circuit genaamd de Giant Fiber System (GFS). De vergelijkende grote omvang van de neuronen, hun kenmerkende morfologie en eenvoudige connectiviteit maken het GFS een aantrekkelijk model voor het bestuderen van neuronale circuits. Het GFS route is samengesteld uit twee tweezijdig symmetrische Giant Fiber (GF) interneuronen waarvan axonen afdalen van de hersenen over de middellijn in de thoracale ganglion via de baarmoederhals bindweefsel. In de mesothoracic neuromere (T2) van de ventrale ganglia het GFS vorm elektro-chemische synapsen met 1) de grote mediale dendrieten van de ipsilaterale motorneuron (TTMn), die de tergotrochanteral spier drives (TTM), de belangrijkste extensor voor de mesothoracic femur / been , en 2) de contralaterale perifeer synapsing interneuron (PSI), die op hun beurt vormen chemische (cholinerge) synapsen met de motorneurons (DLMns) van de dorsale longitudinale spieren (DLMS), de vleugel depressoren. De neuronale route (s) om de dorsovental spieren (DVMS), de vleugel liften, is nog niet uitgewerkt (de DLMS en DVMS zijn gezamenlijk bekend als indirecte vlucht spieren - ze zijn niet direct op de vleugels, maar zet de vleugels indirect door verstoring van de nabijgelegen thoracale cuticula) (Koning en Wyman, 1980;. Allen et al., 2006). De di-synaptische activatie van de DLMS (via PSI) veroorzaakt een kleine maar belangrijke vertraging in de timing van de contractie van deze spieren ten opzichte van de monosynaptic activering van TTM (~ 0,5 ms) waardoor de TTMS om eerst uit te breiden het femur en de stuwen vliegen van de grond. De TTMS tegelijkertijd stretch-activeren van de DLMS die onderling op zijn beurt de DVMS stretch-activeren voor de duur van de vlucht. De GF pad kan indirect worden geactiveerd door het toepassen van een zintuiglijke (bijvoorbeeld "air-puff" of "lights-off") stimulus, of rechtstreeks door een supra-drempel elektrische prikkel naar de hersenen (hier beschreven). In beide gevallen, een actiepotentiaal bereikt de TTMS en DLMS uitsluitend via de GFS, aangevers verzorgen, en TTM / DLM motoneuronen, hoewel de TTMns en DLMns wel andere, nog onbekende, zintuiglijke input. Het meten van "latency reactie" (de tijd tussen de stimulatie en spier depolarisatie) en de "volgende te hoge frequentie stimulatie '(het aantal succesvolle antwoorden op een aantal hoge frequentie stimuli) biedt een manier om reproduceerbaar en kwantitatief beoordelen van de functionele status van het GFS onderdelen, waaronder zowel centraal synapsen (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) en de chemische (glutamaat) neuromusculaire verbindingen (TTMn-TTM en DLMn-DLM). Het is gebruikt om genen die betrokken zijn in het centrum van synapsvorming te identificeren en om CZS functioneren te beoordelen.

Protocol

1. Apparatuur en materialen

1. Deze experimenten gebruik van een standaard electrofysiologie setup bestaat uit een stimulator, een stimulans isolatie-eenheid, twee micro-elektrode versterkers, een data-acquisitie-systeem en een computer met software collectie. Extra uitrusting omvat een kooi van Faraday, een stereomicroscoop op een boom staan, een trillingsisolatie tafel, een lichtbron, en een opname platform.
2. Vijf micromanipulators worden gebruikt. Twee micromanipulators nodig fijne controles voor de positionering van de registrerende elektroden, terwijl de andere drie micromanipulators vereisen slechts bruto controles om de twee stimulatie elektroden en de massa-elektrode positie. De micromanipulator voor de DLM registratie-elektrode wordt geplaatst aan het uiteinde van de voorbereiding (links van de experimentator) en de micromanipulator voor de TTM registratie-elektrode wordt geplaatst tussen de experimentator en de zijkant van het preparaat (iets naar links van de experimentator). De twee micromanipulators dat houdt de simulatie elektroden worden geplaatst aan het hoofd van het preparaat (rechts van de experimentator). De micromanipulator voor de massa-elektrode wordt geplaatst aan de andere kant van het preparaat
3. Trek glazen micro-elektroden opnemen met weerstanden van 40-60 MΩ en op te slaan plat in een schaal wordt ondersteund door was. Voor stimulatie, zijn twee elektrolytisch (NaOH) verscherpt wolfraamelektroden gebruikt. Een wolfraam draad, of een derde elektrolytisch verzonnen elektrode wordt gebruikt als grond. De stimulerende en massa-elektroden worden voorbereid en aan de micromanipulators voor de start van de experimentele sessie en hoeft niet te worden vervangen voor de duur van de sessie.

2. De voorbereiding van de D. melanogaster

1. Zodra de apparatuur is ingesteld, is het tijd om de vliegen te bereiden. Verdoven de vliegen door afkoeling op hen ijs of met behulp van CO _2. Als CO ₂ wordt gebruikt, dan is voldoende tijd (ongeveer 20 minuten) voor de effecten van het gas voorafgaand slijten aan het begin van het experiment.
2. Gebruik een tang om voorzichtig overdracht van de vliegen door hun benen om een ​​schotel met een platform van zachte was helling onder een hoek van ongeveer 45 °. De volgende vier stappen zijn gedaan onder een dissectiemicroscoop uit de buurt van (maar dicht bij) de opname apparatuur.
3. De volgende stap is het veiligstellen van de vlieg in was. Orient-the-fly ventrale zijde naar beneden, met de voorste naar boven op de helling. Met behulp van een paar fijne tang, verlengen de benen naar buiten, in paren, en duw ze in de wax.
4. Vertrouwd te maken met de locatie van de spieren op te nemen van: de dorsale longitudinale spieren, of DLM, en de tergotrochanteral spier, of TTM. De subcutane bevestiging sites van de DLMS overeen met het gebied tussen de borstkas en de middellijn van de voorste dorsale haren (of setae). De TTM attachment sites zijn dorsaal gelegen van de achterste en voorste supra-alar haren. Ervoor zorgen dat de vleugels geen toegang tot het DLM-of TTM vezels belemmeren, naar buiten houd de vleugels en de 'lijm' ze aan de was.
5. Met behulp van een fijne tang, trek de slurf naar buiten zorgvuldig, en zet het door onderdompeling in de was. Dit is een cruciale stap die enige oefening vereist daar de proboscis is zacht en is gemakkelijk los van de rest van het hoofd. Als dat gebeurt, gooi de vliegen en opnieuw beginnen. Als de kop veilig op deze manier leidt tot problemen bij het invoeren van de stimulatie-elektroden door de ogen.

3. Het plaatsen van de elektroden

1. Zodra de vlieg is verankerd aan de was, de overdracht van de schotel met de bijgevoegde vlieg onder de stereomicroscoop, dat bevindt zich in de kooi van Faraday. Orient de vlieg zijdelings met het hoofd van de vlieg aan de rechterkant van de experimentator.
2. De volgende stap is het plaatsen van de elektroden. Grond en stimulatie-elektroden kunnen worden ingevoegd zonder te kijken door de microscoop. Goede opnames steunen op nauwkeurige Impalement, dus het is een goed idee om te oefenen de behandeling van de micromanipulators. Breng de elektrodes die dicht bij de sites van inbrengen met de hulp van micromanipulators naar de juiste plaatsen en de daaropvolgende opnames te vergemakkelijken.
3. Laat de aardelektrode in het achterste einde van de buik met behulp van de aanpassing wielen op de micromanipulator. Voor het plaatsen van de aangescherpte wolfraam stimulatie-elektroden in de hersenen, gebruik dan de micromanipulator aan het uiteinde van een van de elektroden positie, zodat het net raakt een van de ogen vliegen's. Doe hetzelfde met de andere zodat beide elektroden zijn net aanraken van de buitenkant van elk oog. Duw de elektroden op zijn beurt, door middel van elk oog, zodat de uiteinden van de elektroden de hersenen bereiken gelegen aan de achterkant van het hoofd capsule (ongeveer 2-3mm).
4. Correct geplaatste elektroden wordt geactiveerd de Giant Fiber System. Om te testen dat de stimulatie-elektroden correct zijn geplaatst, pas een korte (0,03 ms) stimulus van 30-60V over de stimulatie-elektroden, en zoek naar beweging van de vleugels en de samentrekkingen van de vlucht / beenspier "
5. De volgende stap is om back-vul het glas micro-elektroden met 3M KCl met behulp van een Hamilton of warmte-getrokken plastic spuit, en plaats ze in de fijne-control micromanipulators. Correct geplaatst micro-elektroden gebruikt kan worden voor meerdere rondes van experimenten.
6. De eerste registratie-elektrode wordt ingebracht in een DLM vezel. Er zijn twee bilateraal symmetrische DLMS, elk een is opgebouwd uit zes afzonderlijke spiervezels. De opnamen kunnen worden gedaan vanaf elke van de zes vezels, maar de meest gebruikte zijn DLM vezels 45A en 45B als gevolg van hun goede bereikbaarheid via de dorsale zijde van de thoracale cuticula, en het feit dat beide vezels worden geïnnerveerd door dezelfde motorneuron .
7. Met behulp van de micromanipulator aan de kant het verst van je, plaatst u een registratie-elektrode in het DLM vezels 45a of b. De helling van het platform kan de DLM elektrode aan de dorsale cuticula betreden op een ~ 60-90 ° hoek, die de penetratie aids. Gebruik maken van de software in oscilloscoop modus en kijk naar het computerscherm, terwijl het invoegen van het opnemen van elektroden in de thorax. Wanneer de elektrode heeft een spier ging de basislijn zal dalen tot bijna nul of een negatieve waarde. Test met een enkele prikkel om te zien of je kunt de spier reactie te observeren.
8. Steek de andere opname elektrode in de TTM het dichtst bij je. Deze elektrode wordt zijdelings geplaatst, voor u, als gevolg van de ligging van de spier gehechtheid site. Opnieuw in acht van de monitor terwijl je dit doet en test met een enkele stimulus zodra het spoor geeft aan dat de elektrode in de spier.

4. Stimulatie en opnemen

1. U bent nu klaar om te beginnen met het stimuleren van de hersenen en het opnemen van de reacties uit het been en de vlucht spieren. Breng een korte (0,03 ms) stimulus over de stimulatie-elektroden te beginnen bij 30 V en oplopend tot 60 V totdat u zich aan een antwoord (dat wil zeggen een spiertrekkingen, en een spiercel depolarisatie zoals waargenomen op de computer monitor). Voor de rest van het experiment, stelt u de spanning 50 tot 10 V boven de respons drempel.
2. Voor het meten van respons latentie, het geven van tenminste 5 enkele stimuli met een 5 seconden rust tussen elke stimulus.
3. Bepaal het "frequentie van de volgende" door het verstrekken van treinen van stimuli met verschillende snelheden. Typisch 10 treinen van 10 stimuli worden gegeven op 100 Hz (10ms tussen elke stimulus), 200Hz (5ms tussen elke stimulus) en 300Hz (3ms tussen elke stimulus). Laat een rustperiode van 2 seconden tussen elke trein van stimuli.

5. Resultaten: Reactie latencies en frequentie van het volgen van in het Reuzengebergte Fiber Pathway

1. De reactie latency is de tijd tussen stimulatie van de hersenen en depolarisatie van de spier. Dit cijfer vergelijkt de reactie latencies voor DLM en TTM aan een stimulus. Latency tussen de 0,7 en 1,2 ms voor de GF-TTM route en tussen 1,3 en 1,7 ms voor de GF-DLM pad wijzen op een gezonde voorbereiding en een vlot de opname techniek. De latencies kan variëren met genotype, de genetische achtergrond, de temperatuur en leeftijd.
   
   Figuur 1 (A en B). Vertegenwoordiger sporen toont de reacties opgenomen van de TTMS en DLMS na een eenmalige prikkel in de hersenen.
2. Zoals hier wordt getoond, opnames van de TTM tonen meer variatie in termen van amplitude en vorm van de postsynaptische potentiaal (PSP) in vergelijking met die van de grote DLM vezels; deze verhoogde variabiliteit is te wijten aan de geringe omvang van de TTM spiervezels. Deze variabiliteit is echter geen invloed op de reactie van latency waarden voor de Giant Fiber-to-TTM pad.
   
   Figuur 1 (C en D). Verder 'respons latency' sporen uit vier individuele vliegt voor zowel de TTM en DLM. Let op TTM sporen vertonen variatie in vorm, maar PSP reactie latency is onaangetast. Voor de DLM is er minder variatie in PSP vorm.
   
   
   
   
3. Vergelijk de "frequentie van de volgende" bij 100 Hz, 200 Hz en 300 Hz door het berekenen van het aandeel van de succesvolle reacties (op 10) voor zowel DLM en TTM paden bij elke stimulatie frequentie. Bij 100 Hz, zowel TTM en DLM volg de stimuli 01:01. Bij stimulatie frequenties boven 100 Hz, het DLM reacties start om storingen geven, omdat de tussenpersoon chemische synaps tussen twee interneuronen niet over voldoende tijd om te herstellen tussen de stimuli. De TTM reacties, blijven echter 1:1 met stimuli zelfs verder dan 300Hz.
   
   Figuur 2. Vertegenwoordiger sporen met de "frequentie van de volgende" opnamen. Bij 100 Hz, zowel TTMS en DLMS reageren op alle 10 stimuli (links). Bij 200Hz, het DLM reacties beginnen te falen (asterisk).
   
   
   
   

6. Representatieve resultaten

Wild-type een korte latentie reacties (gestimuleerd elektroden worden geplaatst in de ogen, het omzeilen van sensorische receptoren en het activeren van de GF-circuit rechtstreeks) zijn afhankelijk van het genotype, de genetische achtergrond, temperatuur en leeftijd, en variëren tussen 0,7 en 1,2 ms voor de GF-TTM traject en 1.3 and1.7 ms voor de GF-DLM pad (Tanouye en Wyman, 1980; Thomas en Wyman, 1984; Engel en Wu, 1992; Allen en Murphey, 2007; Phelan et al., 2008;. Augustin et al., niet gepubliceerd.) . Deze zeer korte TTM latency is te danken aan de robuuste GF-TTMn elektrochemische synaps van de monosynaptic route en de langere DLM latentie ontstaat als gevolg van de disynaptic aard van de baan alsook door de aanwezigheid van een chemische synaps (PSI-DLMn). Intermediate-en lange-latency reacties (> 3 ms) het gevolg van de activering van de GF afferentia en worden bereikt door het gebruik van een lagere intensiteit stimulatie of het verstrekken van een visueel ("light-off") signaal. Bij 100 Hz zowel TTM en DLM moeten volgen van de stimuli 01:01. Boven de 100 Hz DLM reacties zal beginnen om storingen te zien zijn als de chemische synaps tussen PSI en de DLMns niet over voldoende tijd om te herstellen tussen de stimuli minder dan 10ms uit elkaar. TTM reacties zullen echter blijven 1:1 met stimuli ook buiten 300Hz (Tanouye en Wyman, 1980; Engel en Wu, 1992;. Allen et al., 2007;. Martinez et al., 2007). Mutaties in het shakB gen, dat codeert voor een Drosophila gap junction kanaal ("innexin"), significante toename van de respons latentie van de GF-TTM route (~ 1,5 ms), terwijl de GF-DLM tak is reageert niet (Allen en Murphey, 2007; Phelan et al.., 2008). De mutant reactie kan worden hersteld door het stimuleren van thoracale ganglia direct, waaruit blijkt dat het vertraagde effect niet te wijten is aan verstoord neuromusculaire transmissie. De mogelijkheid om hoge frequentie stimulatie volgen, is ook verminderd in deze mutanten in vergelijking met wild-type vliegt waar de GF-DLM en GF-TTM paden zijn meestal in staat om 10 stimuli te volgen met een verhouding van 1:1 tot 100 Hz en 300 Hz, respectievelijk. Het is belangrijk op te merken dat deze frequenties aanzienlijk boven de normale stimulatie frequenties die door de aanbestedende spieren tijdens de aanhoudende vlucht (3-10 Hz) (Hummon en Costello, 1989).

Een andere parameter gebruikt om de stabiliteit van het GFS uitgangen beschrijven is het "refractaire periode", of de minimale tijd tussen twee pulsen prikkel die nog twee reacties produceert uit de spier. De vuurvaste varieert tussen de 1-4 ms voor TTMS en 7-15 ms voor DLMS. De relatief lange refractaire periode voor DLMS is te wijten aan relatief chemische synapsen labiel op de PSI-DLMn kruising (Tanouye en Wyman, 1980; Gorczyca en Hall, 1984; Engel en Wu, 1992; Banerjee et al., 2004;. Allen en Godenschwege, 2010).

Discussie

Een van de belangrijkste dingen die men moet letten wanneer het proberen om opnames van hoge kwaliteit te verkrijgen is de juiste richting en de gezondheid van de bereiding. Idealiter zou de vlieg nog in leven zijn op het einde van de opname sessie en reageren op elektrische prikkels. Voor de registrerende elektroden om zo efficiënt mogelijk doordringen in de thoracale exoskelet, moet het vliegen worden vastgelijmd aan het oppervlak op zodanige wijze dat een rechte hoek vormen met de elektroden, indien nodig, het inbrengen van elektroden kan worden vergemakkelijkt door het verwijderen van een deel van de dorsale thoracale nagelriemen met een tungsten scalpel dus het blootstellen van de DLM vlucht spier (deze stap biedt een extra voordeel dat het moeilijker voor de tips van glas elektrodes te breken). Ook moet de zorg worden genomen om te voorkomen dat het indrukken van de elektroden door het subcuticularly gelegen DLMS en TTMS. Het hoofd van de vlieg moet goed worden vastgezet, zodat voor de stimulatie-elektroden goed worden ingebracht in de hersenen en om te voorkomen dat ze getrokken tijdens de opnamesessie.

Door zijn grootte en goed beschreven morfologie, de GFS is een van de meest toegankelijke neuronale paden in Drosophila. De doorlaatbaarheid van elektrische synapsen aan kleine moleculaire gewicht tracer kleurstoffen zorgt voor de visualisatie van elektrisch gekoppelde neuronen, en de verschillende beschikbare GAL4 lijnen maken het mogelijk om genexpressie niveau te manipuleren in een subset van cellen of celgroepen (Jacobs et al., 2000;. Allen et al., 2006). In aanvulling op de hierboven genoemde voordelen, zowel afferente en thoracale componenten van het circuit weergave-eigenschappen, zoals gewenning, spontaan herstel en dishabituation, waardoor de Drosophila GFS een handig modelsysteem voor het bestuderen van neuronale plasticiteit (Engel en Wu, 1996).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
NAAM	BEDRIJF	CAT. #	COMMENTAAR
S48 Square Pulse Stimulator	Gras Instrumenten		http://www.grasstechnologies.com/
Stimulatie unit	Gras Instrumenten		http://www.grasstechnologies.com/
SIU5 RF-transformator isolatie-eenheid	Gras Instrumenten		http://www.grasstechnologies.com/
5A twee-kanaals intracellulaire micro-elektrode Versterker	Aan de instrumenten		http://www.gettinginstruments.com/
Digidata 1440A data-acquisitiesysteem	Molecular Devices		http://www.moleculardevices.com/
Analoog-digitale Digidata 1320 en Axoscope 9.0 software	Molecular Devices		http://www.moleculardevices.com/
Opname platform met handmatige micromanipulators	Narishige, Sutter Ins., World Precision Ins.		http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/
Lichtbron	Fostec		http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm
Wild M5 stereomicroscoop	Wild Heerbrugg		http://www.wild-heerbrugg.com/
Trillingsisolatie tafel	TMC		http://www.techmfg.com/
Borosilicaat buis voor de micro-elektroden	Sutter Instrument		http://www.sutter.com/index.html
P-95 Micropipet puller	Sutter Instrument		http://www.sutter.com/index.html
Microfil 34 meter, 67 mm (elektrode filler)	Wereld precisie-instrumenten	MF34G-5	http://www.wpi-europe.com/en/
Microdissectie tools (tangen, ...)	Fijn Science Tools		www.finescience.com
Ontleden (stereo) microscoop	Leica		http://www.leica-microsystems.com/
Kooi van Faraday	Onbekende fabrikant

Andere: kunststof spuiten, wolfraam aardedraad en NaOH-geslepen wolfraamelektroden, KCl, was platform, een PC met monitor ...