Dit protocol beschrijft een procedure om de ademhaling van mitochondriën geïsoleerd van skeletspieren studie. Deze methode werd aangepast van Scorrano Et al.. (2007). Het mitochondriale isolatie procedure vereist ongeveer 2 uur. De mitochondriale ademhaling kan worden voltooid in ongeveer 1 uur.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Mitochondriale Isolatie van skeletspieren
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Mitochondriën zijn organellen beheersen het leven en de dood van de cel. Ze nemen deel aan de belangrijkste metabolische reacties, synthetiseren het grootste deel van de ATP, en regelen een aantal signaaltransductiecascades 2,3. Vroegere en huidige onderzoekers hebben geïsoleerd mitochondriën van ratten en muizen weefsels, zoals lever, hersenen en hart 4,5. In de afgelopen jaren, hebben veel onderzoekers zich op het bestuderen van de mitochondriale functie van de skeletspieren.
Hier beschrijven we een methode die wij met succes hebben gebruikt voor de isolatie van de mitochondriën van skeletspieren 6. Onze procedure schrijft voor dat alle buffers en reagentia zijn vers gemaakt en moet ongeveer 250-500 mg van de skeletspieren. We bestudeerden mitochondria geïsoleerd van rat en muis gastrocnemius en diafragma, en de rat extraoculaire spieren. Mitochondriale eiwit concentratie wordt gemeten met de Bradford assay. Het is belangrijk dat mitochondriale monsters worden bewaard ijskoud tijdens de voorbereiding en dat de functionele studies worden uitgevoerd binnen een relatief korte tijd (~ 1 uur). Mitochondriale ademhaling wordt gemeten met behulp van polarografie met een Clark-type elektrode (Oxygraph systeem) bij 37 ° C 7. Ijking van de zuurstof elektrode is een belangrijke stap in dit protocol en moet dagelijks worden uitgevoerd. Geïsoleerde mitochondria (150 ug) worden toegevoegd aan 0,5 ml van de experimentele buffer (EB). Staat twee ademhaling begint met toevoeging van glutamaat (5mm) en malaat (2,5 mm). Vervolgens wordt adenosine difosfaat (ADP) (150 uM) toegevoegd aan de staat 3 te starten. Oligomycin (1 uM), een ATPase synthase blocker, wordt gebruikt om de toestand 4 schatten. Ten slotte carbonyl cyanide p-[trifluormethoxy]-fenyl-hydrazon (FCCP, 0,2 uM) wordt toegevoegd aan 5 measurestate, of afgekoppeld ademhaling 6. De respiratoire controle ratio (RCR), de verhouding van toestand 3 naar toestand 4, wordt berekend na elk experiment. Een RCR ≥ 4 wordt beschouwd als bewijs van een levensvatbare mitochondria voorbereiding.
Kortom, presenteren we een methode voor de isolatie van levensvatbare mitochondria van de skeletspieren die kunnen worden gebruikt in de biochemische (bijvoorbeeld enzymactiviteit, immunodetectie, proteomics) en functionele studies (mitochondriale ademhaling).
Protocol
1. Voorbereiding van de Buffers
- Zet de centrifuge 5804R en ingesteld op 4 ° C. Zet Isotemp 3006D waterbad en ingesteld op 37 ° C.
- Bereid de volgende oplossingen voor spier isolatie:
- PBS: Los fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tabletten in gedestilleerd water (5 tabletten / liter). Meng goed.
- PBS plus 10 mM EDTA: te bereiden een 100 ml oplossing, 2 ml van 500 mM EDTA toe te voegen aan 98 ml PBS.
- 8X Mitochondriën buffer: 10,28 g sucrose voor een uiteindelijke concentratie van 0,6 M, 400 mg van free-vetzuur bovine serum albumine (BSA) voor een uiteindelijke concentratie van 0,8%, 2,08 g HEPES voor een uiteindelijke c....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We presenteren een protocol om levensvatbare mitochondria isoleren van skeletspieren. Wanneer de opbrengst een probleem is, kan het protocol worden gewijzigd door het incuberen van de geïsoleerde spier in 5 ml PBS/10mM EDTA/0.01% trypsine gedurende 30 minuten in het ijs. Te garanderen een volledige spier spijsvertering met trypsine, de spier volledig moet worden gehakt. Nadat de 30-minuten incubatie, moet de PBS/10mM EDTA/0.01% trypsine-oplossing volledig worden vervangen door 3 ml van isolatie buffer 1 (IB1). Daarnaast.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het National Eye Institute (R01 EY12998) naar FH Andrade.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 95% CO2 / 5% O2 mengsel | Lokale gasleverancier | ||
| Adenosine 5′-difosfaat natriumzout | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Blauw Rizla-papier | Hansatech | 890101 | |
| Bradford-proteïneassay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Carbonylcyanide p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | ||
| Samengeperste stikstof | Lokale gasleverancier | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9647 | |
| Ethyleenglycol-bis-(tetraacetic acid) (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetra-azijnzuur (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | |
| Vrij vetzuur runder-serumalbumine | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| Glutaminezuur | Sigma-Aldrich | G5889 | |
| HEPES natriumzout | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | ||
| Magnesiumchloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Mannelijke Sprague Dawley-ratten | Harlan Laboratories | 300-500g | |
| Maleïnezuur | Sigma-Aldrich | M9138 | |
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | |
| Oligomycine | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Zuurstofelektrode schijf | Hansatech | S1 | |
| Oxygraph | Hansatech | ||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | ||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Kaliumchloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Kaliumfosfaat | Sigma-Aldrich | P8416 | |
| Potter-Elvehjem homogenisatoren | Fisher Scientific | 08-414-14A | |
| PTFE (0,0125mm × 25mm) membraan | Hansatech | S4 | |
| SKIL 3320 kolomboormachine | IJswinkel | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 |
Referenties
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
